免疫應答中小鼠脾GAP

1、            楊宏*王凌黃傳書鞠躬 (第四軍醫(yī)大學神經(jīng)科學研究所神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)研究室西安710032； *軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所神經(jīng)生物學研究室，北京100850) 摘要為了解脾交感神經(jīng)在免疫功能增強時的形態(tài)變化，用免疫組織化學方法觀察了BALB/c小鼠脾內(nèi)生長相關(guān)蛋白樣免疫反應(GAP-43-LI)性神經(jīng)在結(jié)核菌素衍生蛋白(PPD)誘發(fā)的免疫反應高峰期數(shù)量和分布的變化。結(jié)果顯示，動物在接受兩次PPD注射(21d+7d)后，脾GAP-43-LI神經(jīng)纖維密度明顯增

2、加并伴有分布和形態(tài)的變化。于對照動物，脾GAP-43-LI神經(jīng)纖維主要分布于血管周圍，少量伸入動脈周圍淋巴鞘的脾基質(zhì)中，而在免疫刺激的動物，不僅血管周圍的神經(jīng)纖維明顯增多，動脈周圍淋巴鞘外層、邊緣區(qū)和紅髓等免疫應答活躍的部位也出現(xiàn)許多神經(jīng)纖維。神經(jīng)纖維分支和纖維上膨體明顯增多。以上結(jié)果提示：免疫應答中脾神經(jīng)成分發(fā)生活躍的結(jié)構(gòu)重塑，這些變化有可能與神經(jīng)的免疫調(diào)節(jié)功能有關(guān)。 關(guān)鍵詞神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)生長相關(guān)蛋白-43脾神經(jīng)支配小鼠 近年來的大量研究事實證明，神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫系統(tǒng)之間存在著相互影響和相互調(diào)節(jié)。免疫細胞產(chǎn)生的多種細胞因子可作為信使將免疫反應的信息傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)，后者將信息整合后通過目前

3、公認的神經(jīng)內(nèi)分泌和自主神經(jīng)兩大途徑對免疫功能進行調(diào)節(jié)。初級和次級免疫器官的淋巴組織中神經(jīng)纖維的發(fā)現(xiàn)為研究兩大系統(tǒng)的功能聯(lián)系開辟了廣闊的視野。作為機體中神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng)直接接觸的場所，脾的神經(jīng)支配以及神經(jīng)與脾免疫功能之間的關(guān)系得到了大量的研究。已知脾交感神經(jīng)不僅僅是傳統(tǒng)意義上的血管支配神經(jīng)，它們在脾實質(zhì)中也廣泛分布；、腎上腺素受體及神經(jīng)肽受體廣泛存在于脾免疫細胞之上，并能介導相應激素對免疫細胞功能的影響；兒茶酚胺在體外、體內(nèi)均能調(diào)節(jié)淋巴細胞的功能及去除交感神經(jīng)支配對于脾的免疫功能產(chǎn)生極大影響1，2等事實證明，免疫器官的神經(jīng)支配是神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)的重要途徑之一。 以上多數(shù)工作是通過刺激或損毀交感神經(jīng)

4、來觀察免疫功能改變的，而通過改變免疫狀態(tài)來觀察神經(jīng)成分變化的研究很少。有報道老年大鼠脾交感神經(jīng)的密度下降，間接表明神經(jīng)支配密度與免疫功能的強弱成正比。而免疫功能增強的狀態(tài)下脾交感神經(jīng)密度有無改變尚未見報道。本實驗中我們以生長相關(guān)蛋白(GAP-43)免疫反應作為脾交感神經(jīng)纖維標記，研究在抗原刺激后抗體產(chǎn)生最高峰期BALB/c小鼠脾內(nèi)神經(jīng)的改變，借以了解脾神經(jīng)在免疫功能增強時的可塑性，為深入探討脾交感神經(jīng)的免疫調(diào)節(jié)機理提供依據(jù)。 材料和方法 1.動物和實驗處理 選78周齡，體重2025g的雄性BALB/c小鼠18只，實驗組和對照組各6只，另有6只用于探索免疫方案的前期實驗。動物飼養(yǎng)在恒溫、恒濕、定

5、期消毒的環(huán)境中，飼以小鼠專用塊食和清水。實驗組動物接受2次免疫，抗原為結(jié)核菌素衍生蛋白PPD(中國藥品生物制品鑒定所)。初次免疫時將抗原與福氏完全佐劑(Sigma公司)混合，每只動物腹腔注射500l，含PPD 30g。動物存活21d后接受第2次免疫注射，這次將抗原溶于消毒生理鹽水，每只動物腹腔注射500l，含抗原30g。7d后將動物處死。對照組動物在相同的時間點接受2次消毒生理鹽水腹腔注射，每只500l,此實驗方案根據(jù)前期實驗組尾靜脈取血、間接ELISA法測定血清中抗PPD特異性抗體的滴度而確定。在初次免疫后第9d有一抗體高峰，追加免疫后第7d出現(xiàn)第2個更高的峰(圖1)。 2.組織處理和免疫組

6、織化學 動物全部以1%戊巴比妥鈉深麻(30mg/kg i.p.)，經(jīng)主動脈灌注生理鹽水10ml,繼而灌注4的4%多聚甲醛-磷酸緩沖溶液10min。取出脾浸入相同固定液中后固定812h,稱脾重，轉(zhuǎn)入含20%蔗糖的磷酸緩沖液中4下浸泡12h。沿與脾長軸垂直的方向?qū)⑵⒎譃?等份，取靠中線的一塊自脾門向被膜方向做冰凍切片(厚30m)，每5張切片中收集1張于0.01mol/L,pH7.4的磷酸鉀鹽緩沖液(KPBS)中。切片用甲醇+0.1%H2O2處理15min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，0.05mol/L Tris-鹽酸緩沖液(TBS)洗(5min×3)，浸入由TBS稀釋的2%牛血清白蛋白(

7、BSA)中封閉60min，直接進入由含2%BSA、1.8%疊氮鈉、0.1% Tween-20 的雙倍鹽 Tris-鹽酸緩沖液(TBS2T)稀釋的特異性綿羊抗GAP-43 IgG(11 000)中4下孵育3648h，特異性抗體由美國哈佛大學 Benowitz教授惠贈。孵育結(jié)束后，切片在TBS2T中洗30min,入TBS2T稀釋的羊抗兔生物素化IgG(Sigma公司，1200)室溫孵育120min,TBS2T洗(10min×3)，入TBS稀釋的ABC復合物(Sigma公司，1200)室溫孵育100min,TBS洗(5min×3)。切片進入含0.05%DAB，2.5%硫酸鎳銨，0

8、.01%H2O2的0.1mol/L,pH6.2醋酸緩沖液中呈色1015min。貼片，必要時以1%中性紅復染。室溫晾干，100%酒精脫水、二甲苯透明，DPX封片。行空白對照實驗?？贵w的特異性檢驗采用吸收實驗，詳見文獻3。 3.定量分析 對每例動物所有的脾切片逐張進行分析。在10倍顯微鏡下，從每張切片的左上角開始，向下移動視野，每隔4個視野取1個作分析用。為確保相鄰上下掃描的視野沒有重疊，兩排之間相隔一視野的寬度。在Camera Lucida(Nikon,Japan)下，用統(tǒng)一粗細的筆畫出白、紅髓的輪廓和其中的陽性神經(jīng)纖維。用Leica 570圖像分析儀測定每個視野中白髓和紅髓的面積和其中神經(jīng)纖維

9、的長度。計算出單位面積內(nèi)神經(jīng)纖維的總長度。 4.抗PPD特異性抗體的檢測 采用間接ELISA法，其程序如下：進口ELISA板包被抗原(PPD 10mg/L)4過夜，1%BSA 37封閉1h，加入從120開始稀釋的免疫小鼠血清，37孵育1h，加HRP標記的羊抗鼠抗體(美國Sigma公司，11 000)37，1h，四甲基聯(lián)苯胺(TMB)呈色，2mol/L硫酸終止反應，ELISA讀數(shù)儀(型號)檢測結(jié)果。以上各反應步驟之間均以PBS Tween-20洗滌。 結(jié)果 脾重測量結(jié)果顯示免疫應答動物脾的重量明顯高于對照組(P0.01)，除鏡下發(fā)現(xiàn)生發(fā)中心增多以外，脾的一般結(jié)構(gòu)未出現(xiàn)明顯變化。 ELISA檢測結(jié)

10、果表明，血中抗PPD抗體滴度于初次免疫后第9d達到第1個高峰，追加免疫后第7d達到第2個且更高的高峰(圖1)。 對照動物脾內(nèi)GAP-43-LI神經(jīng)纖維分布于中央動脈和其分支周圍，同時有少數(shù)纖維伸入動脈周圍淋巴鞘(PALS)的淋巴實質(zhì)中，但一般只到達內(nèi)層，偶見少數(shù)神經(jīng)纖維分布于邊緣區(qū)(圖2a,2b)。在接近脾門的PALS中陽性神經(jīng)纖維分布較密集。紅髓中可見到少量細而短的GAP-43-LI纖維。大多數(shù)神經(jīng)纖維上膨體較少。                

11、;  免疫刺激動物脾內(nèi)血管周GAP-43-LI神經(jīng)叢密度明顯增大(圖3a，3b)，許多血管周神經(jīng)叢的神經(jīng)纖維上出現(xiàn)大量膨體(圖3c)。自血管周神經(jīng)叢伸向PALS 的神經(jīng)纖維明顯增多(圖3d)，PALS外層、PALS與邊緣區(qū)交界區(qū)陽性神經(jīng)纖維增多，有些神經(jīng)纖維伸入邊緣區(qū)(圖3e3g)。另一明顯變化是神經(jīng)纖維增粗、膨體增多(圖3g,3h)。紅髓內(nèi)神經(jīng)纖維密度也明顯增加，帶有膨體的神經(jīng)纖維位于紅髓髓索或密集地圍繞在末梢小動脈的周圍(圖3i)。雖然接受免疫的動物脾內(nèi)生發(fā)中心增多，但生發(fā)中心內(nèi)幾乎無神經(jīng)分布。定量分析結(jié)果顯示，PPD免疫組動物脾紅髓和白髓內(nèi)GAP-43-LI神經(jīng)纖維密度明顯高于

12、對照組(圖4)。于實驗組和對照組的個別動物可見少數(shù)性質(zhì)不明的GAP-43-LI細胞，其數(shù)量多少與免疫刺激無任何關(guān)系。 圖2對照小鼠脾抗GAP-43抗體染色結(jié)果，中性紅復染。 2a示GAP-43-LI血管周神經(jīng)叢，有小量神經(jīng)纖維伸入動脈周圍淋巴鞘(PALS)的實質(zhì)中。CA.中央動脈PALS.動脈周圍淋巴鞘MZ.邊緣區(qū)標尺示40m 2b示陽性神經(jīng)纖維主要見于PALS 的內(nèi)層，偶見于邊緣區(qū)。神經(jīng)纖維較細，膨體和分支較少標尺示20m Fig.2 The spleen of contral mouse spleen stained with anti-GAP-43 IgG,counter stained

13、 with neutral red.(2a).GAP-43-LI nerve plexus around the central artery,with a small amout of fibers extending to the parenchyma of the PALS.CA:central artery,PALS:periarterial lymphocyte sheath,MZ:marginal zone.Bar=40m.(2b):immunoreactive nerve fibers in the inner part of the PALS,which occasionall

14、y can be seen in the marginal zone.Nerve fibers are thin,with a small amount of varicosities and branches.Bar=20m 圖3PPD免疫小鼠脾抗GAP-43抗體染色結(jié)果，中性紅復染。 3a，3b示濃密的血管周神經(jīng)叢，神經(jīng)纖維向PALS的實質(zhì)中伸展。標尺示10m 3c示血管周神經(jīng)纖維上的大量膨體標尺示10m 3d示自動脈周神經(jīng)叢伸向PALS分支豐富的神經(jīng)纖維標尺示20m 圖3e3g示PALS、邊緣區(qū)的陽性神經(jīng)纖維標尺示20m(3e),標尺示10m(3f,3g) 3h示PALS 中帶有不同大小

15、膨體的神經(jīng)纖維標尺示10m 3i示紅髓中分布于末梢小動脈周圍()和髓索內(nèi)()的神經(jīng)纖維標尺示10m Fig.3 The spleen of mouse immunized with PPD,stained with anti-GAP-43 IgG,counter stained with neutral red.(3a,3b):A dense periarterial nerve plexus.The nerve fibers extend to the parenchyma of the PALS.Bar=10m(3c):Extremely rich varicosities appear

16、in the nerve fibers.Bar=10m.(3d):Richly branching nerve fibers in the PALS radiating out from the periarterial plexus.Bar=20m. Fig.3e3g Nerve fibers in the outer parts of the PALS and the marginal zone.Bar=20m(3e),Bar=10m(3f,3g).(3h):Fibers in the PALS with varicosities of different sizes.Bar=10m (3

17、i):Nerve fibers around the terminal arteriole (thin arrow)and in the splenic cord of the red pulp.(arrow heads).Bar=10m 空白對照實驗未發(fā)現(xiàn)任何陽性染色。 圖1PPD免疫后血中抗PPD抗體摘度的變化時程 Fig.1 Time course of the titer of the antibody against PPD after PPD immunization. 圖4GAP-43樣神經(jīng)纖維在正常和PPD 免疫的BALB/c小鼠脾臟中的密度 Fig.4 Density of

18、the GAP-43-LI nerve fibers in the spleen of control and PPD immunized BALB/c mice(*,P0.05). 討論 可塑性是中樞和外周神經(jīng)普遍的特性。神經(jīng)細胞以改變自身功能、形態(tài)特性的方式對外界刺激作出反應以適應各種功能的需要。生長相關(guān)蛋白(GAP-43)是神經(jīng)特異的膜結(jié)合蛋白，與軸突出芽和重塑有關(guān)3。我們曾經(jīng)證實，支配脾的神經(jīng)普遍含有GAP-43,GAP-43-ir神經(jīng)大部分屬于交感神經(jīng)，少部分屬于非交感神經(jīng)4。 本實驗結(jié)果證實，在胸腺依賴性抗原PPD誘發(fā)的免疫應答中，于抗體產(chǎn)生高峰期脾內(nèi)GAP-43-LI神經(jīng)纖維出現(xiàn)

19、密度明顯增加、神經(jīng)分支和膨體增多以及神經(jīng)自血管周圍向淋巴實質(zhì)中(PALS外層、邊緣區(qū)和髓索)伸展等形態(tài)和分布上的變化。本實驗脾臟內(nèi)的神經(jīng)數(shù)量是用單位面積總長度來計算的，因此必須考慮免疫后脾臟體積(重量)的變化，同樣數(shù)量的神經(jīng)纖維在體積增加的情況下其密度下降，反之則增加。在本實驗中脾臟的體積在免疫后有較大的增加，因此，實際脾臟神經(jīng)纖維的增加應更為明顯。有趣的是，免疫應答中神經(jīng)纖維增多的幾個部位包括動脈周圍淋巴鞘外層、邊緣區(qū)和紅髓與文獻中報道的胸腺依賴性或非依賴性抗原刺激后抗體形成細胞存在的部位非常吻合5。這些部位雖然屬于B淋巴細胞分布區(qū)，但在胸腺非依賴性抗原誘發(fā)的免疫反應中，產(chǎn)生干擾素(IFN-

20、)的T淋巴細胞也正是分布于以上3個部位并且與產(chǎn)生抗體的細胞并置排列6，7，說明這些結(jié)構(gòu)是脾臟中免疫反應活躍的部位。本實驗中免疫應答高峰期神經(jīng)纖維變化出現(xiàn)于這些部位，更強烈提示了神經(jīng)與免疫功能之間的密切關(guān)系。 免疫功能狀態(tài)改變時神經(jīng)纖維數(shù)量和形態(tài)的變化也見于淋巴結(jié)8，這種變化的機制目前尚不完全清楚。因為胚胎發(fā)育中脾內(nèi)去甲腎上腺素能神經(jīng)與免疫細胞相伴出現(xiàn)9，而且成年動物的初級和次級淋巴器官中有較豐富的交感神經(jīng)支配，這些事實提示了胚胎和成年脾組織中某種維持神經(jīng)生長存活物質(zhì)存在的可能性。事實上，脾T、B淋巴細胞能夠產(chǎn)生具有活性的神經(jīng)生長因子(NGF)已得到證實10。NGF、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF

21、)、神經(jīng)營養(yǎng)素-3,4(NT-3,NT-4)等神經(jīng)營養(yǎng)素的mRNA也已發(fā)現(xiàn)于胸腺和脾臟11，進一步提示免疫器官自身能夠產(chǎn)生神經(jīng)營養(yǎng)素。體外實驗證實，淋巴器官組織塊能夠誘導共同培養(yǎng)的交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)的生長，這種作用能夠被抗NGF抗體完全阻斷12。經(jīng)感染性刺激的淋巴器官組織塊具有更強的神經(jīng)誘生作用，而且除NGF外，免疫活性細胞所產(chǎn)生的細胞因子如IL-1、IL-3、IL-6、GM-CSF等均有一定的神經(jīng)誘導作用1215。以上實驗依據(jù)從不同角度支持了本實驗的結(jié)果。雖然目前尚不知我們的實驗條件下神經(jīng)營養(yǎng)性因子的表達和分泌是否增加，但有報道免疫細胞內(nèi)NT-4 mRNA水平在 ConA、LPS或感染的刺激下有

22、所增高11。正是由于多種神經(jīng)營養(yǎng)性因子、細胞因子的共同作用，使神經(jīng)纖維在免疫反應中得以發(fā)生與功能相適應的變化。在我們的實驗中，脾GAP-43-LI神經(jīng)纖維的形態(tài)學變化有著區(qū)域的特殊性，神經(jīng)纖維有向免疫反應激烈的部位伸展的趨勢，這也反應出在免疫應答時脾不同結(jié)構(gòu)和區(qū)域內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)性因子和細胞因子的生成量可能有所差別。邊緣區(qū)和紅髓作為免疫應答的前沿，有大量巨噬細胞聚集，我們最近的工作證實，邊緣區(qū)和紅髓的巨噬細胞呈NGF免疫反應陽性。           有關(guān)交感神經(jīng)對免疫功能的影響已有較多研究1，2，有些問題尚存在爭議。因

23、外科或化學切除交感神經(jīng)可導致免疫功能的增強，故相當一部分人認為交感神經(jīng)對免疫功能起抑制作用，但也有去除交感神經(jīng)不影響或增強免疫功能的報道。本研究的結(jié)果以及老年動物脾交感神經(jīng)纖維密度降低的報道表明，脾交感神經(jīng)纖維的密度與其免疫功能狀態(tài)呈正比。神經(jīng)纖維密度增加的同時是否伴有NA含量的改變有待進一步研究。有報道，于免疫應答各個不同階段，脾NA水平出現(xiàn)明顯變化2。由于許多證據(jù)證實NA對免疫功能起抑制作用，因而，本實驗中免疫應答高峰期神經(jīng)纖維數(shù)量、分支和膨體增加的結(jié)果有可能解釋為，神經(jīng)通過釋放更多的神經(jīng)遞質(zhì)及增加與免疫細胞的接觸而對免疫反應起負反饋抑制作用。 收稿1997-12修回1998-04 參考文

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