一個(gè)新的具有特殊結(jié)構(gòu)和潛在趨化活性

1、一個(gè)新的具有特殊結(jié)構(gòu)和潛在趨化活性的人細(xì)胞因子趨化素樣因子1的克隆和特性研究韓文玲 婁雅欣 唐軍民 張穎妹 陳英玉 馬大龍 等細(xì)胞因子是在免疫和炎癥反應(yīng)中起重要作用的小分子蛋白質(zhì)。近年來(lái)，越來(lái)越多的細(xì)胞因子得以發(fā)現(xiàn)。本文介紹一種新的細(xì)胞因子趨化素樣因子1（CKLF1）的發(fā)現(xiàn)和特性研究。CKLF1全長(zhǎng)cDNA序列包括530個(gè)堿基，有一個(gè)編碼99個(gè)氨基酸的完整開(kāi)放讀碼框架。CKLF1與已發(fā)現(xiàn)的其它細(xì)胞因子沒(méi)有明顯的序列同源性。CKLF1在PHA刺激的U937細(xì)胞中的表達(dá)可被IL-10所部分抑制。重組的CKLF1能夠明顯趨化嗜中性細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，同時(shí)，它能夠刺激小鼠骨骼肌細(xì)胞的增殖。以上結(jié)

2、果表明CKLF1可能在炎癥和骨骼肌再生過(guò)程中發(fā)揮重要作用。關(guān)鍵詞：白細(xì)胞介素10；骨骼肌細(xì)胞；剪切；抑制性減數(shù)雜交前 言細(xì)胞因子是一群在免疫和炎癥反應(yīng)中起重要作用的小分子蛋白質(zhì)?？偟膩?lái)說(shuō)，細(xì)胞因子在細(xì)胞被活化后呈一過(guò)性誘導(dǎo)表達(dá)，其表達(dá)受多種因素調(diào)控。細(xì)胞因子包括白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、生長(zhǎng)因子和趨化因子等（1）。其中，趨化因子是結(jié)構(gòu)相似的小分子蛋白質(zhì)，在吸引和活化白細(xì)胞過(guò)程中起重要作用。趨化因子在蛋白質(zhì)水平上含有4個(gè)保守的半胱氨酸，根據(jù)前兩個(gè)半胱氨酸的相對(duì)位置不同，趨化因子可分為CXC（）、CC（）、C（）和CX3C（）4個(gè)亞家族，C代表半胱氨酸，X代表任一氨基酸（2）。以前的研究表明：人前

3、單核細(xì)胞系U937細(xì)胞在PHA刺激下，能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞因子；而白細(xì)胞介素10能抑制多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生（3）（4）?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，我們?cè)O(shè)計(jì)了一條新的技術(shù)路線(xiàn)來(lái)發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞因子。利用抑制性減數(shù)雜交技術(shù)，從PHA刺激的U937細(xì)胞中克隆到能被IL-10所抑制的cDNA序列，其中一個(gè)序列編碼一個(gè)新的分泌性細(xì)胞因子，含有CC家族趨化因子所具有的特征性結(jié)構(gòu)即兩個(gè)連續(xù)的半胱氨酸，并對(duì)多種白細(xì)胞具有趨化作用，該因子被命名為趨化素樣因子1（CKLF1）。但是，該因子與其它CC家族趨化因子有如下區(qū)別：（1）CKLF1成熟蛋白質(zhì)只有一個(gè)連續(xù)的CC結(jié)構(gòu)，其羧基端沒(méi)有其它的半胱氨酸；（2）CKLF1與已發(fā)現(xiàn)的其它C

4、C家族趨化因子沒(méi)有明顯序列上的同源性； （3）CKLF1至少存在其它三種不同的RNA剪切形式；（4）它對(duì)骨骼肌細(xì)胞有刺激作用。CKLF1可能代表一個(gè)新的家族的趨化因子。因此，我們將其命名為趨化素樣因子1，其相應(yīng)的變異體命名為CKLF2，CKLF3和CKLF4。材 料 和 方 法抑制性減數(shù)雜交（SSH）SSH的操作方法按Diatchenko報(bào)道的進(jìn)行操作(5)， 用CLONTECH公司的 PCR-Select TM cDNA Subtraction Kit。SSH技術(shù)把抑制性PCR(Suppression PCR)和傳統(tǒng)的減數(shù)雜交方法相結(jié)合(16)，可用于比較兩個(gè)群體的mRNA，得到在一組mRN

5、A中表達(dá)，而在另一組mRNA中低表達(dá)或不表達(dá)的基因。先將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，其中含有特異表達(dá)基因的樣本為tester，另一組為driver，tester和driver cDNA雜交，去除雜交體cDNA，沒(méi)有形成雜交體的cDNA即是在tester中特異表達(dá)或高表達(dá)的基因，而在driver中不表達(dá)或低表達(dá)的基因。抑制性PCR在選擇性擴(kuò)增特異基因的同時(shí)，抑制自身的擴(kuò)增，使雜交陽(yáng)性率更高。在SSH操作過(guò)程中，人前單核細(xì)胞系U937細(xì)胞由本室長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)。細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清 ，100U/ml青鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中。用于SSH操作的U937細(xì)胞批量培養(yǎng)至2×107細(xì)胞，

6、離心收集細(xì)胞, 用Hanks液洗三遍后懸于含10ng/mlPHA的10% FCS RPMI1640中, 其中一半即1×107細(xì)胞作為tester, 另一半細(xì)胞中加入終濃度為100ng/ml的IL-10作為driver。繼續(xù)培養(yǎng)8小時(shí)后收集細(xì)胞， 提取mRNA，取2mgmRNA合成雙鏈cDNA，用RsaI切后，將tester分為兩組，在T4 DNA連接酶作用下，分別連上Adapter1和Adapter2，進(jìn)行兩輪雜交，雜交產(chǎn)物用作PCR擴(kuò)增的模板。將雜交產(chǎn)物稀釋1000倍，利用試劑盒提供的PCR引物，進(jìn)行第一輪PCR，擴(kuò)增27輪，然后將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋10倍，分別以NESTED P

7、CR引物1和 NESTED PCR引物2R進(jìn)行第二輪PCR，擴(kuò)增15輪，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物即為差異基因片段，Glassmilk回收2001600bp的片段，克隆到pGEM-T easy中，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL-Blue菌，選白色克隆。得到約100個(gè)克隆，隨機(jī)篩選15個(gè)變大明顯的克隆，純化質(zhì)粒DNA，用ALF快速測(cè)序儀進(jìn)行序列分析，并在NCBI中進(jìn)行序列同源性比較。生物信息學(xué)將來(lái)自PHA刺激的U937細(xì)胞文庫(kù)的EST片段與GenBank TBLASTN 的EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較。將與CKLF1片段有高度同源性的序列（50個(gè)以上堿基，95%以上同源性），通過(guò) EST Assembly Machine ( 進(jìn)

8、行EST拼接（6）。用于CKLF1拼接的EST片段的登記號(hào)為 W38899, N95062, AA429945, AA987264, AA927461, W19056, N89912, AA516431, AA479657, AA455042, AA989129, AF151058，NM-016951，W52820。在PHA刺激的U937細(xì)胞中得到CKLF1的全長(zhǎng)序列，測(cè)序證明EST拼接正確。CKLF1可能的信號(hào)肽切割位點(diǎn)分析用PcGene、Prosite軟件和 Signal P server (vices/SignalP)進(jìn)行分析。CKLF1的染色體定位用HTGS數(shù)據(jù)庫(kù)分析（）。包含CKLF

9、1基因的兩個(gè)染色體片段的登錄號(hào)為AC010542和AC018557。Northern Blot分析我們對(duì)目的基因的表達(dá)情況進(jìn)行了Northern Blot分析，細(xì)胞總RNA的提取用生命公司的TRIZ0LTM試劑提取。分別取20 mg tester或driver RNA，在1.5%的甲醛變性膠中電泳，通過(guò)毛細(xì)管吸引法將RNA轉(zhuǎn)到尼龍膜上。探針的標(biāo)記和雜交操作參照DUPONT公司Random Primer Fluorescein Labeling kit with Antifluorescein-HRP (DuPont NENÒ NELMGC-803)試劑盒說(shuō)明書(shū)。標(biāo)記探針的核苷酸均為來(lái)

10、源于SSH雜交得到的全長(zhǎng)EST片段（CKLF1全長(zhǎng)cDNA片段中的53-530位堿基）。寡核苷酸用于擴(kuò)增CKLF1及其變異體的全長(zhǎng)cDNA片段的引物為： P1 5 GCA, AGA, AGC,GGG, AAG, CCG, A 3和P2 5 GGA, AGA, ATA, CAG, AAA, TAT, GTT, TAA, TAC 3； 用于擴(kuò)增CKLF1及其變異體的編碼區(qū)cDNA片段以構(gòu)建pCDI-CKLF1的引物為： P3 5 ATG, GAT, AAC, GTG, CAG, CCG, AAA, AT 3和P4 5 TTA, CAA, AAC, TTC, TTT, TTT, TTC, ATG,

11、C 3； 用于擴(kuò)增不含終止密碼的CKLF1及其變異體的cDNA片段，以構(gòu)建pEGFP-N1-CKLF1, pEGFP-N1-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4的下游引物為： P5 5 CGG GAT CCA AAA CTT CTT TTT TTT CAT GC 3CKLF1表達(dá)譜分析用巢式PCR的方法對(duì)CKLF1及其變異體在各種不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析，用Clontech公司Multiple Tissue cDNA Panels試劑盒提供的單鏈cDNA文庫(kù)作模板，利用P1，P2和P3，P4引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在第一輪PCR反應(yīng)中，取1µlcDNA文庫(kù)作模板，反應(yīng)體系為

12、25µl，進(jìn)行25個(gè)循環(huán)；在第二輪PCR反應(yīng)中，取1µl第一輪PCR產(chǎn)物作模板，反應(yīng)體系為25µl，進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。取10µl第二輪PCR產(chǎn)物，在5%SDS-PAGE膠中電泳。質(zhì)粒構(gòu)建為了對(duì)CKLF1， CKLF2和CKLF4的亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究，將去終止碼的相應(yīng)序列克隆到表達(dá)載體pEGFP-N1中。用P3和P5引物，從PHA刺激的U937細(xì)胞cDNA文庫(kù)中，擴(kuò)增CKLF1，CKLF2和CKLF4的cDNA序列，在P5引物中，終止碼被去除，并引入BamH1酶切位點(diǎn)。PCR產(chǎn)物用Klenow酶處理為平端，然后用BamH1酶切。pEGFP-N1載體先用Eco

13、RI酶切，再用Klenow酶處理為平端，然后用BamH1酶切。酶切處理后的載體片段和目的基因片段回收后，連接得到重組質(zhì)粒pEGFP-N1-CKLF1，pEGFP-N1-CKLF2和pEGFP-N1-CKLF4。用P3和P4引物從PHA刺激的U937細(xì)胞cDNA文庫(kù)中，擴(kuò)增CKLF1的 ORF片段，克隆入pGEM-T載體中，測(cè)序。用EcoRI將插入片段釋放出來(lái)，連接至經(jīng)EcoRI切后，并用CIP處理后的pcDI載體中，經(jīng)酶切鑒定可得到CKLF-1的正義表達(dá)載體pcDI-CKLF1。pcDI是將pcDNA3的BglI-kpnI片段與pCI的BglI-KpnI片段置換后得到的一個(gè)真核表達(dá)載體（7）。

14、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染試劑在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染中， COS-7細(xì)胞在10%胎牛血清的DMEM中培養(yǎng)。用SuperFect轉(zhuǎn)染試劑，根據(jù)說(shuō)明轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。48小時(shí)后，收集轉(zhuǎn)染上清，用于活性分析和Western blot分析。細(xì)胞用PBS洗，甲醛固定30分鐘，再用PBS洗，熒光顯微鏡觀(guān)察。CKLF1-EGFP，CKLF2-EGFP，CKLF3-EGFP在COS-7細(xì)胞上清中的Western blot分析將pEGFP-N1，pEGFP-N1-CKLF1, pEG FP-N1-CKLF2 和 pEGFP-N1-CKLF4四種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，48小時(shí)后，各取70µl細(xì)胞上清，進(jìn)行SDS-PAGE電

15、泳，電轉(zhuǎn)至尼龍膜上，與抗EGFP多克隆抗體反應(yīng)，再與HRP標(biāo)記的二抗反應(yīng)，用化學(xué)發(fā)光的方法進(jìn)行檢測(cè)。趨化實(shí)驗(yàn)按照以前報(bào)道的方法（8），從健康成年志愿者外周血中分離嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。純化的嗜中性粒細(xì)胞重懸于HBSS緩沖液中，細(xì)胞密度為1X106/ml；淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞重懸于含0.5%低內(nèi)毒素BSA和20mM Hepes的1640培養(yǎng)液中，細(xì)胞密度分別為5X106/ml和2X106/ml。細(xì)胞趨化實(shí)驗(yàn)用48孔趨化小室，按照文獻(xiàn)報(bào)道的進(jìn)行（9）。小孔的下面裝滿(mǎn)COS-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)染上清，上面是各種不同類(lèi)型的細(xì)胞。用于嗜中性細(xì)胞的聚炭膜孔徑為3µm，趨化時(shí)間為30分鐘；用于單

16、核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的聚炭膜孔徑為5µm，趨化時(shí)間為90分鐘。DNA注射和肌肉切片分析所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均購(gòu)自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部。將100µgpcDI-CKLF1或pcDI分別溶于100µl生理鹽水中，取6-8周齡BALB/c小鼠，分別注射pcDI-CKLF1或pcDI于骨胳肌中，同時(shí)用40ms，80V電刺激，以提高質(zhì)粒的攝取量（10）。10天后，處死小鼠，將注射質(zhì)粒部位的肌肉取出。標(biāo)本分為兩部分，一部分用于常規(guī)組織學(xué)處理，分別進(jìn)行Feulgen，ANAE，POX和HE染色。另外一部分用于提取RNA，進(jìn)行RT-PCR分析。 結(jié) 果差異顯示cDNA片段的獲得利用SSH

17、技術(shù)，我們從PHA刺激的U937細(xì)胞中得到了能被IL-10所抑制表達(dá)的cDNA序列。篩選了15個(gè)插入序列大于200個(gè)堿基的克隆，測(cè)序，并在Genbank公共數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)克隆包括CKLF1為新基因。Northern blot分析再次證明白細(xì)胞介素10能夠抑制CKLF1的表達(dá)，CKLF1約為600個(gè)堿基（見(jiàn)圖1）。 圖1. CKLF表達(dá)的Northern blot分析第2和第4泳道的RNA來(lái)自PHA刺激的U937細(xì)胞；第1和第3泳道的RNA來(lái)自PHA刺激同時(shí)IL-10抑制的U937細(xì)胞。CKLF1在PHA刺激的U937細(xì)胞中的表達(dá)可被IL-10部分抑制（第1和第2泳道）。CKLF1全

18、長(zhǎng)DNA序列克隆及其編碼蛋白質(zhì)的特征通過(guò)SSH技術(shù)從PHA刺激的U937細(xì)胞中獲得的CKLF1片段含有多聚腺苷酸尾巴和相對(duì)少見(jiàn)的加尾信號(hào)ATTAAA，人趨化因子Eotaxin和TARC的加尾信號(hào)也是ATTAAA（11，12）。這表明該片段包含完整的3'非翻譯區(qū)（13，14）。該片段有一個(gè)編碼99個(gè)氨基酸的完整開(kāi)放讀碼框架，96-98位為翻譯起始密碼ATG，其周邊序列為GCGATGG，符合Kozak規(guī)律（15）。在Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索發(fā)現(xiàn)，CKLF1為一個(gè)新基因；但是EST數(shù)據(jù)庫(kù)檢索發(fā)現(xiàn),來(lái)自不同cDNA文庫(kù)的多條EST序列與我們得到的序列部分相同或高度同源。通過(guò)EST延伸技術(shù)，在

19、CKLF1原有cDNA序列基礎(chǔ)上，向5'非翻譯區(qū)延長(zhǎng)了52個(gè)堿基。Northern blot顯示CKLF1與預(yù)期的大小基本相符。為證明EST拼接是否正確，我們?cè)O(shè)計(jì)了引物P1和P2，從PHA刺激的U937細(xì)胞中成功得到CKLF1的全長(zhǎng)cDNA序列，DNA序列分析表明我們的EST拼接是正確的。CKLF1的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼的蛋白質(zhì)序列如圖2A所示（CKLF1在GenBank中的登錄號(hào)為AF096895）。 圖2. CKLF1的核酸和相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列及其與TARC和STCP-1的序列比較（A）CKLF1的核酸和蛋白質(zhì)序列。核酸序列為正義鏈，從5'到3'方向。核酸序列下為

20、相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列，終止碼用星號(hào)表示。（B）CKLF1的蛋白質(zhì)序列與CC家族趨化因子TARC和STCP-1的比較。加深的為保守的氨基酸。CKLF1編碼的蛋白質(zhì)含有99個(gè)氨基酸，分子量為10.9KDa，為高度堿性的疏水性蛋白質(zhì)。CKLF1蛋白沒(méi)有N糖基化位點(diǎn)，SignalP分析發(fā)現(xiàn)沒(méi)有典型的信號(hào)肽切割位點(diǎn)（16，17），轉(zhuǎn)基因分析和Western blot分析發(fā)現(xiàn)，CKLF1可被分泌到細(xì)胞上清中。其他實(shí)驗(yàn)室的研究發(fā)現(xiàn)，一些沒(méi)有前導(dǎo)序列的蛋白質(zhì)能被分泌出來(lái)，如乳腺來(lái)源的生長(zhǎng)抑制因子，白細(xì)胞介素1和巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子2等（18）。因此，CKLF1可能利用另外一種分泌機(jī)制。CKLF1在蛋白質(zhì)水平上僅與

21、線(xiàn)蟲(chóng)的amino acid permease蛋白有低水平的同源性，與其它蛋白質(zhì)沒(méi)有明顯的同源性。CKLF1蛋白具有兩個(gè)結(jié)構(gòu)特性：（1）CKLF1僅有三個(gè)半胱氨酸，最后兩個(gè)連續(xù)排列，具有CC家族趨化因子的結(jié)構(gòu)特征；（2）BLAST檢索發(fā)現(xiàn)，CKLF1與其它CC家族趨化因子之間沒(méi)有明顯同源性。但是，手工排列發(fā)現(xiàn)，CKLF1與兩個(gè)位于16號(hào)染色體上CC家族趨化因子TARC和STCP-1在CC附近有數(shù)個(gè)關(guān)鍵的氨基酸相同（圖2B所示）。CKLF1三個(gè)變異體的克隆化通過(guò)RT-PCR技術(shù)，我們從PHA刺激的U937細(xì)胞中得到CKLF1的全長(zhǎng)cDNA序列，同時(shí)，得到了其它三條片段，經(jīng)克隆化和序列分析后，發(fā)現(xiàn)它

22、們?yōu)镃KLF1的三種變異體，分別命名為CKLF2（AF135380），CKLF3（AF135381）和CKLF4（AF145216）。在PHA刺激的U937細(xì)胞中，CKLF1比CKLF2，CKLF3和CKLF4的表達(dá)水平高，且該基因的表達(dá)可被IL-10所抑制，因此Northern Blot檢測(cè)時(shí)只看到一條帶，可能因?yàn)槠渌儺愺w豐度較低，Northern Blot敏感度不夠而未能檢測(cè)到。讀碼框架分析表明：CKLF-2 、CKLF-3和CKLF-4分別編碼152個(gè)氨基酸， 67個(gè)氨基酸和120個(gè)氨基酸，它們與CKLF1有相同的氨基端和羧基端， 中間27-112為氨基酸不同， 但都有CC結(jié)構(gòu)。用編碼

23、最多氨基酸的CKLF2作參照， CKLF1，CKLF3和CKLF4分別缺失27-79，27-111，80-111位氨基酸（圖3所示）。 圖3. CKLF1、CKLF2、CKLF3和CKLF4的蛋白質(zhì)序列圖4.人CKLF基因內(nèi)含子和外顯子交界處序列及CKLF1，2，3，4結(jié)構(gòu)示意圖（A）人CKLF基因內(nèi)含子和外顯子交界處序列。外顯子序列用大寫(xiě)字母表示；內(nèi)含子序列用小寫(xiě)字母表示。（B）CKLF對(duì)外顯子的選擇性應(yīng)用及CKLF1，2，3，4的結(jié)構(gòu)示意圖。CKLF1與其變異體有相同的氨基端和羧基端。在CKLF2蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)上，CKLF1，CKLF3和CKLF4選擇性用27-79，27-111和80-11

24、1位氨基酸。下劃線(xiàn)序列指CKLF2和CKLF4可能的穿膜區(qū)序列CKLF基因定位和結(jié)構(gòu)通過(guò)檢索HTGS數(shù)據(jù)庫(kù)，將CKLF2全長(zhǎng)cDNA序列與人類(lèi)基因組工作草圖相比較，我們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)位于16號(hào)染色體上的片段與其有高度同源性。CKLF基因包括4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子。內(nèi)含子和外顯子交界處的序列符合真核細(xì)胞剪接規(guī)律（圖4A）（19）。CKLF基因與cDNA序列比較發(fā)現(xiàn)，外顯子1，2，3，4分別編碼1-26，27-79，80-111，112-152位氨基酸（圖4B）。CKLF1，2，3，4有共同的外顯子1和4，選擇性擁有外顯子2和3。因此，它們?yōu)橥换虻牟煌艚有问?。CKLF1 mRNA在不同組織中的表達(dá)

25、CKLF1 mRNA在PHA刺激的U937細(xì)胞中存在不同的變異體形式。我們用RT-PCR技術(shù)分析了CKLF1及其變異體在成年及胚胎組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：CKLF1及其變異體在脾臟、肺、睪丸、卵巢、外周血白細(xì)胞、胎盤(pán)、胰腺、胎腦、胎兒骨胳肌和心臟中高表達(dá)；成年人骨胳肌、肝臟、胸腺、結(jié)腸、前列腺、胎脾和胎肝中表達(dá)水平較低；而在成年人腦組織、腎臟、心臟、小腸、胎肺和胎腎中的表達(dá)幾乎檢測(cè)不到。在絕大多數(shù)組織中，CKLF1和CKLF2的表達(dá)水平相類(lèi)似，均比CKLF4的表達(dá)水平高，而CKLF3的表達(dá)水平最低（圖5所示）。 圖5.人CKLF1及其變異體在各種組織中的分布（A）CKLF及其變異體在胚胎組

26、織中的表達(dá)。（B）CKLF及其變異體在成年組織中的表達(dá)。左邊顯示的分子量標(biāo)準(zhǔn)。CKLF1，CKLF2和CKLF4的亞細(xì)胞定位為了研究CKLF1，2，4的細(xì)胞定位，我們構(gòu)建了CKLF-EGFP融合表達(dá)載體，EGFP在CKLFcDNA序列的下游，二者位于同一讀碼框架。將融合表達(dá)載體和空載體對(duì)照分別轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀(guān)察熒光的分布。表達(dá)對(duì)照EGFP的細(xì)胞有分布均勻的亮綠色熒光，在細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有特異性亞細(xì)胞定位（圖6A）；而轉(zhuǎn)染CKLF1-EGFP的細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)熒光很弱（圖6B）。基于CKLF1的結(jié)構(gòu)特征，可以推測(cè)大部分CKLF1-EGFP蛋白可能被分泌到細(xì)胞培養(yǎng)上清中。相反，CKLF2-E

27、GFP和CKLF4-EGFP主要位于細(xì)胞邊緣，在細(xì)胞的其它位置，僅有很少的熒光分布（圖6C和6D）。轉(zhuǎn)染HEK-293細(xì)胞，也得到相似的結(jié)果，這表明CKLF1，CKLF2和CKLF4的亞細(xì)胞定位不僅局限于COS-7細(xì)胞。圖6.EGFP、CKLF1-EGFP、CKLF2-EGFP和CKLF4-EGFP融合蛋白的亞細(xì)胞定位EGFP位于CKLF1，CKLF2和CKLF4的羧基端，它們?cè)谕蛔x碼框架上，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，熒光顯微鏡觀(guān)察。（A）轉(zhuǎn)染EGFP對(duì)照。（B）轉(zhuǎn)染CKLF1-EGFP。（C）轉(zhuǎn)染CKLF2-EGFP。（D）轉(zhuǎn)染CKLF4-EGFP。放大倍數(shù)為400倍。CKLF1為分泌性表達(dá)

28、從CKLF1的亞細(xì)胞定位結(jié)果來(lái)看，我們推測(cè)CKLF1可能為分泌性表達(dá)。為證明這一點(diǎn)，收集COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳和Western blot分析。Western blot表明在pcDI-CKLF1-EGFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，有一條約38KD的特異表達(dá)帶，分子量與CKLF1-EGFP融合蛋白相吻合（圖7）。而在其它三組轉(zhuǎn)染上清中，沒(méi)有檢測(cè)到特異的表達(dá)帶。因此，我們可以得出以下結(jié)論：雖然CKLF1的信號(hào)肽尚有待確定，但CKLF1為分泌性蛋白，在細(xì)胞上清中檢測(cè)不到CKLF2-EGFP和CKLF4-EGFP的存在。而且，計(jì)算機(jī)分析發(fā)現(xiàn)，CKLF2和CKLF4的27-79位氨基酸為高度疏

29、水性氨基酸，可能是穿膜蛋白。將CKLF2序列遞交到GenBank后，發(fā)現(xiàn)了其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室克隆的序列，與CKLF2有相同的讀碼框架，其中一個(gè)的登錄號(hào)為AF057306，被認(rèn)為是穿膜蛋白脂，這提示CKLF2可能是穿膜蛋白。圖7.應(yīng)用抗EGFP多克隆抗體，在COS-7細(xì)胞上清中檢測(cè)CKLFs/EGFP。第一泳道：高分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)；第二泳道：EGFP；第三泳道：CKLF1/EGFP；第四泳道：CKLF2/EGFP；第五泳道：CKLF4/EGFP重組CKLF1在體外的趨化活性為了研究CKLF1的生物學(xué)活性，我們構(gòu)建了CKLF1真核表達(dá)質(zhì)粒pcDI-CKLF1，該質(zhì)粒包括CKLF1的完整讀碼框架。我們將

30、pcDI-CKLF1和空載體pcDI分別轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，收集細(xì)胞上清，進(jìn)行趨化活性分析。重組CKLF1的趨化活性分析用穿孔移動(dòng)分析法，趨化活性用趨化指數(shù)表示（趨化指數(shù)是指pcDI-CKLF1轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清組的細(xì)胞數(shù)與空載體pcDI轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清組的細(xì)胞數(shù)的比值）（20）。與pcDI轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清相比較，pcDI-CKLF1轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清對(duì)人中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞有明顯的趨化活性（圖8所示）。我們?cè)诠塖2細(xì)胞系統(tǒng)中得到相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這說(shuō)明CKLF1的趨化活性不僅局限于COS-7細(xì)胞系統(tǒng)。CKLF1體內(nèi)趨化活性我們將pcDI-CKLF1裸質(zhì)粒注射到BALB/c小鼠肌肉中，10天后，取注射部

31、位肌肉組織，RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)CKLF1的表達(dá)水平較高；同時(shí)，肌肉縱切，F(xiàn)eulgen染色，發(fā)現(xiàn)與空載體對(duì)照組相比，注射pcDI-CKLF1裸質(zhì)粒的小鼠肌肉切片中有更多的細(xì)胞浸潤(rùn)。這表明CKLF1能引起白細(xì)胞的聚集或能刺激干細(xì)胞的增殖或二者兼而有之。為進(jìn)一步驗(yàn)證CKLF1的體內(nèi)趨化活性，我們又對(duì)部分肌肉切片進(jìn)行POX或ANAE染色，然后用HE復(fù)染（21）。如圖9D和圖9F所示，許多細(xì)胞呈POX或ANAE強(qiáng)陽(yáng)性，而在圖9C和圖9E中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的陽(yáng)性細(xì)胞。眾所周知，POX陽(yáng)性細(xì)胞主要是嗜中性粒細(xì)胞，而ANAE陽(yáng)性細(xì)胞主要為單核細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞（22）。在細(xì)胞染色的基礎(chǔ)上，結(jié)合形態(tài)學(xué)觀(guān)察，CK

32、LF1在體內(nèi)能夠趨化嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，這與CKLF1的體外趨化活性一致。圖8.CKLF1對(duì)白細(xì)胞的趨化作用將人外周血淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞置于趨化小室中，下面孔中加入不同稀釋度的COS-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染上清。在高倍鏡下，隨機(jī)選5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞的數(shù)量。CI：趨化指數(shù)。 圖9.小鼠肌肉內(nèi)注射pcDI-CKLF1引起的白細(xì)胞浸潤(rùn)A、C、E為注射pcDI組小鼠；B、D、F為注射pcDI-CKLF1組小鼠。注射質(zhì)粒10天后，取肌肉組織，作組織切片。D和F中可見(jiàn)白細(xì)胞浸潤(rùn)。CKLF1在體內(nèi)引起骨胳肌的形態(tài)學(xué)改變將肌肉組織固定后，分別作縱切片和橫切片，HE染色。在表達(dá)CKLF1的肌

33、肉組織中，除了觀(guān)察到多細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象外，還發(fā)現(xiàn)了肌肉組織的形態(tài)學(xué)改變，如圖10所示。在橫切面中，CKLF1組有細(xì)胞核居中現(xiàn)象（圖10B），而對(duì)照組沒(méi)有這種現(xiàn)象（圖10A）；在縱切面中，CKLF1組細(xì)胞核成串珠狀排列（圖10D）。這種現(xiàn)象說(shuō)明肌衛(wèi)星細(xì)胞被活化，肌肉處于再生狀態(tài)（23）。目前，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證明這是CKLF1的直接作用還是由被趨化細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子導(dǎo)致的結(jié)果。圖10.CKLF1對(duì)BALB/c小鼠骨胳肌的作用裸質(zhì)粒注射后10天，取肌肉組織，作縱切片和橫切片，HE染色，200倍放大后鏡檢。表達(dá)CKLF1的肌組織切片中（B，D），可明顯觀(guān)察到肌纖維再生，即核居中現(xiàn)象。而在對(duì)照組肌肉切片

34、中，無(wú)細(xì)胞核居中現(xiàn)象。討 論我們通過(guò)一種新的技術(shù)路線(xiàn)，成功地克隆了新細(xì)胞因子CKLF1及其三種變異體。應(yīng)用這條技術(shù)路線(xiàn)，把其它的細(xì)胞因子產(chǎn)生細(xì)胞和細(xì)胞因子合成抑制抑制因子結(jié)合起來(lái)，可發(fā)現(xiàn)更多新的細(xì)胞因子。CKLF1-EGFP、CKLF2-EGFP和CKLF3-EGFP轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞和HEK-293細(xì)胞的結(jié)果表明，CKLF1是分泌性蛋白質(zhì)，而CKLF2和CKLF4為穿膜蛋白。根據(jù)計(jì)算機(jī)分析結(jié)果，我們推測(cè)CKLF1的另外一個(gè)變異體CKLF3可能與CKLF1相同，為分泌性表達(dá)，目前這部分工作正在研究之中。令人感興趣的是，CKLF1的不同變異體可為分泌性表達(dá)，也可為跨膜蛋白。有人報(bào)道，新的CC家族

35、趨化因子Eskine，由于選擇性應(yīng)用5'外顯子，而造成兩種不同的變異體，其中之一為分泌性表達(dá)，另一種定位于細(xì)胞核（24）。對(duì)CKLF1的不同變異體而言，不同的表達(dá)形式可能是由于對(duì)27-79這段高疏水性氨基酸的選擇性應(yīng)用有關(guān)。從CKLF1的結(jié)構(gòu)上來(lái)看，CKLF1有三個(gè)半胱氨酸，最后兩個(gè)連續(xù)排列，呈CC家族趨化因子的特征性結(jié)構(gòu)，第一個(gè)半胱氨酸可能位于信號(hào)肽內(nèi)。CKLF1與其它趨化因子的不同之處在于它的羧基端沒(méi)有其它的半胱氨酸。CKLF1基因定位于16號(hào)染色體，與CC家族趨化因子TARC和STCP-1有低水平的同源性（25）。在目前發(fā)現(xiàn)的所有CC家族趨化因子中，只有TARC和STCP-1定位

36、于16號(hào)染色體上，其它絕大多數(shù)CC家族趨化因子位于17染色體上。FRN是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種CX3C趨化因子，也是唯一一種膜結(jié)合型趨化因子，同樣定位與16號(hào)染色體（25）。重組的CKLF1在體內(nèi)外均具有廣譜的趨化活性， 我們認(rèn)為CKLF1可能代表一個(gè)新的家族的趨化因子，它與TARC、STCP-1和FRN在進(jìn)化上可能有一定的保守性。在小鼠肌肉中表達(dá)重組的CKLF1，可刺激肌肉細(xì)胞的增殖和分化，這與IGF-1對(duì)成年小鼠趾長(zhǎng)伸肌的作用一致（27）。我們推測(cè)CKLF1可能通過(guò)以下幾種機(jī)制來(lái)調(diào)控骨胳肌細(xì)胞的再生：第一，與IGF-1相同，CKLF1本身能夠調(diào)控肌衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分裂；第二，CKLF1趨化的白

37、細(xì)胞能夠產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子能夠影響肌細(xì)胞的生長(zhǎng)；第三，CKLF1與其它細(xì)胞因子具有協(xié)同作用，刺激肌細(xì)胞的再生和肌管的形成。目前，尚需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證明我們的推測(cè)?？傊?，我們成功地克隆了一個(gè)新的細(xì)胞因子及其三種變異體。CKLF1的表達(dá)水平可被IL-10所部分抑制。功能實(shí)驗(yàn)證明，CKLF1具有廣譜的趨化活性，并能刺激骨胳肌細(xì)胞的增殖和分化。致謝：感謝懷特博士對(duì)CKLF1命名所提的建議；感謝李凌松博士協(xié)助論文修改；感謝黃大無(wú)和鐘英誠(chéng)在照片處理過(guò)程中所提供的幫助；感謝范中玉對(duì)論文的輸入所做的工作。這項(xiàng)研究工作是由國(guó)家863和973基金支持。參 考 文 獻(xiàn)1. Nicola, N. A.,

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