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1、尊敬的中國微生態(tài)學(xué)雜志編輯：“金黃色葡萄球菌的耐藥性分析及基因分型研究”一文是由鮑宏達(dá)等撰寫的論著。該文通過實(shí)驗(yàn)分析了上海某大型醫(yī)院的院內(nèi)分離菌株的耐藥譜和基因型，并研究了菌株的親緣關(guān)系，對(duì)防治強(qiáng)致病多耐藥型金黃色葡萄球菌在該院的流行提出了有針對(duì)性的意見和建議。敬請(qǐng)各位編輯給予指正，謝謝！文章第一作者：鮑宏達(dá)，男，1987年生，研究方向：分子流行病學(xué)通訊作者：劉暢，Email: tiantianlc我們保證該文章從未在任何公開雜志發(fā)表，也絕對(duì)沒有一稿多投。金黃色葡萄球菌的耐藥性分析及基因分型研究鮑宏達(dá) 徐白瑩 劉暢 韓立中 倪語星 郭曉奎（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院 上海 200025） 摘要 目的

2、通過分析上海地區(qū)院內(nèi)分離金黃色葡萄球菌的藥敏譜型及對(duì)耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（MRSA）進(jìn)行基因譜型的研究，了解金黃色葡萄球菌的院內(nèi)流行狀況。方法 對(duì)臨床分離出的43株金黃色葡萄球菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)和SCCmec基因盒的多重PCR檢測(cè)，并將結(jié)果整合后用MEGA3.1軟件分析其進(jìn)化相關(guān)關(guān)系。結(jié)果 藥敏結(jié)果顯示43株金葡菌對(duì)青霉素和甲氧西林的耐藥率最高。甲氧西林的耐藥率達(dá)到62.8。MecA陽性菌株SCCmec的分型顯示均為II型或III型，且所占比例相近，未見I型和IV型。進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)了在同一醫(yī)院中親緣關(guān)系相近的菌株，為院內(nèi)感染流行株。結(jié)論 MecA基因介導(dǎo)的MRSA在分離菌株中所占比例高，存在

3、院內(nèi)感染爆發(fā)性流行。關(guān)鍵詞 耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌、基因譜型、多重PCR、耐藥性、院內(nèi)感染Typing and phylogeny analysis of methcillin-resistant Staphylococcus aureus in nosocomial infections.Hong-da BAO，Bai-ying XU，Chang Liu，Li-zhong Han, Yu-xing Ni, Xiao-kui Guo(Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai, 200025 China)Abstra

4、ct Objective To determine the antimicrobial susceptibility and molecular types among clinical isolates of Methcillin-resistant Staphylococcus aureus from different departments in Shanghai Ruijin hospital, and evaluate the prevalence of Staphylococcus aureus in nosocomial infections (NI). Methods Ant

5、imicrobial susceptibility of forty-three strains isolated from patients were examined by disc diffusion method; methicillin-resistant strains with mecA gene were typed by multiplex PCR method. MEGA3.1 software was applied to analyze the homology of the strains according to the susceptibility tests a

6、nd the gene typing methods. Results The rates of the resistance to penicillin and methcillin is the highest, especially the resistant methcillin is up to 62.8%. SCCmec typing method gave the result that only type II and type III strains were discovered, none of the type I and type IV were found. Rel

7、ative analysis showed phylogeny homologous strains exist. Conclusion Prevalence of certain types of mecA positive MRSA strains leading to epidemic outbreak.Key Words Methcillin-resistant Staphylococcus aureus; Genotype; multiplex PCR; antibiotic resistance；nosocomial infections金黃色葡萄球菌（Staphlococcus

8、aureus），簡(jiǎn)稱金葡菌，是引起院內(nèi)感染的重要革蘭陽性病原菌之一。近年來，隨著抗生素的廣泛使用，其耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，導(dǎo)致臨床診斷和用藥困難，其中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 (Methcillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 引起的院內(nèi)感染 (nosocomial infection) 已經(jīng)成為全世界嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。建立快速、可靠的檢測(cè)和分型方法，對(duì)于相關(guān)衛(wèi)生部門控制耐藥菌株的流行具有非常重要的意義。MRSA的產(chǎn)生多數(shù)是由于獲得了可轉(zhuǎn)移性耐藥基因mecA，在mecA陽性的MRSA菌株復(fù)制起始點(diǎn)附近有一特征性結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)內(nèi)含有mecA基因，并可

9、在以整體形式在不同菌株間相互傳播，稱為葡萄球菌染色體盒mec（(staphylococcal chromosome cassette，SCC mec）。對(duì)SCCmec進(jìn)行基因分型是一種重要的MRSA的分型方法，目前國際上研究主要可將MRSA分為五種型別1-3，對(duì)于MRSA的流行病學(xué)研究具有重要意義。本研究對(duì)上海瑞金醫(yī)院2007年7-8月臨床分離的43株S.aureus進(jìn)行藥敏分型和SCCmec分型，并整合兩種分型方法分析了菌株間的親緣關(guān)系，旨在對(duì)感染菌株的耐藥特點(diǎn)和流行病學(xué)特征有所了解。1 材料與方法1.1. 菌株來源 2007年7-8月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院臨床檢驗(yàn)科收集的住院患者送

10、檢標(biāo)本（包括痰、咽拭子、尿、創(chuàng)面或傷口分泌物、血）中分離的醫(yī)院感染菌株43株。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC 25923，來自本教研室。1.2 細(xì)菌鑒定 所有分離菌株經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀（法國梅里埃）API Staph 系統(tǒng)進(jìn)行生化鑒定。1.3 培養(yǎng)基和藥敏紙片 MH瓊脂干粉培養(yǎng)基購自上海中科昆蟲生物技術(shù)開發(fā)有限公司。所用的藥敏紙片包括慶大霉素(GM)、青霉素（P）、甲氧西林（MET）、優(yōu)立新（SAM）、頭孢唑啉（CZ）、萬古霉素（VA）、四環(huán)素（T）、克林霉素（CL）、復(fù)方新諾明（SXT）、磷霉素（FM）、利福平（RA）、替考拉寧（TP）、左氧沙星（LVF）。均購自美國BD公司。1.4 藥敏

11、試驗(yàn) 采用K-B法測(cè)定43株菌對(duì)13種抗生素藥物的藥物敏感性，結(jié)果依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）2004年版進(jìn)行判讀。結(jié)果分別標(biāo)記為敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）。1.5 細(xì)菌DNA的制備 選擇對(duì)甲氧西林耐藥的菌株，吸取1.5mL的過夜培養(yǎng)菌液置于Eppendorf管中，離心沉淀后用小量細(xì)菌基因組抽提試劑盒（華舜）抽提細(xì)菌基因組DNA作為模板，按照試劑盒的說明書操作。1.6 基因分型 根據(jù)Genebank上mecA的基因序列設(shè)計(jì)引物mecA1和mecA2，從耐甲氧西林的菌株中篩選mecA陽性的樣本。然后采用多重PCR的方法，設(shè)計(jì)針對(duì)SCCmecI型至IV型的6對(duì)引物，進(jìn)行葡萄

12、球菌染色體盒分型（SCCmec）。各種靶基因引物序列和產(chǎn)物長(zhǎng)度列于表1。PCR擴(kuò)增條件均為：25L反應(yīng)體系，2×Taq Master Mix (北京天根生化科技有限公司) 12.5L，上下游引物各1L、模板 1L，用ddH2O補(bǔ)至25L。在BIORAD PCR 擴(kuò)增儀上設(shè)置擴(kuò)增條件如下：95預(yù)變性4min, 94變性30s, 55退火30s, 72延伸1min,共循環(huán)30次，最終72延伸4min。擴(kuò)增產(chǎn)物取10ul進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物表現(xiàn)出495bp和342bp的為I型，表現(xiàn)出342bp，284bp和209bp的為II型，表現(xiàn)出414bp，243bp和209bp的為

13、III型，只有一條342bp的是IV型。表1 靶基因PCR引物序列4基因名稱引物名稱引物序列產(chǎn)物長(zhǎng)度CIFCIF2 F2TTCGAGTTGCTGATGAAGAAGG495CIF2 R2ATTTACCACAAGGACTACCAGCKDPKDP F1AATCATCTGCCATTGGTGATGC284KDP R1CGAATGAAGTGAAAGAAAGTGGMECMECI P2ATCAAGACTTGCATTCAGGC209MECI P3GCGGTTTCAATTCACTTGTCRIF4RIF4 F3GTGATTGTTCGAGATATGTGG243RIF4 R9CGCTTTATCTGTATCTATCGCR

14、IF5RIF5 F10TTCTTAAGTACACGCTGAATCG414RIF5 R13GTCACAGTAATTCCATCAATGCDCSDCS F2CATCCTATGATAGCTTGGTC342DCS R1CTAAATCATAGCCATGACCGmecAMecA1GTTGTAGTTGTCGGGTTTG446MecA2TCCACATTGTTTCGGTCT1.7 整合藥敏試驗(yàn)和SCCmec分型結(jié)果，對(duì)mecA陽性的菌株用MEGA3.1軟件進(jìn)行菌株親緣關(guān)系比較，并構(gòu)建進(jìn)化樹。2 結(jié)果2.1 細(xì)菌鑒定 經(jīng)全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定，43株菌屬于金黃色葡萄球菌種。2.1 藥敏試驗(yàn) 43株金黃色葡萄球菌中有2

15、7株菌對(duì)甲氧西林耐藥，MRSA菌株占到62.8。所以菌株對(duì)其它12種抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表2,從表中可以看出，43株菌對(duì)青霉素的耐藥率最高，達(dá)到90.7，對(duì)替考拉寧的耐藥率最低，僅2.3。無萬古霉素耐藥菌株。表2 43株金黃色葡萄球菌對(duì)13種藥物的耐藥性抗菌藥物MRSA(n=27)MSSA(n=16)總耐藥率(%)慶大霉素青霉素優(yōu)立新頭孢唑啉萬古霉素四環(huán)素克林霉素復(fù)方新諾明磷霉素利福平替考拉寧左氧沙星81.5（22/27）100（27/27）85.2（23/27）92.6（25/27）0（0/27）88.9（24/27）88.9（24/27）33.3（9/27）14.8（4/27）44.4（

16、12/27）3.7（1/27）74（20/27）12.5（2/16）75（12/16）6.3（1/16）0（0/0）0（0/16）18.8（3/16）6.3（1/16）0（0/16）6.3（1/16）0（0/16）0（0/16）0（0/16）55.8（24/43）90.7（29/43）55.8（24/43）58.1（25/43）0（0/43）62.8（27/43）58.1（25/43）20.9（9/43）11.6（5/43）25.6（12/43）2.3（1/43）46.5（20/43）2.2 SCCmec分型結(jié)果 43株菌中對(duì)甲氧西林耐藥的共有27株。經(jīng)篩查，mecA陽性的菌株為24株，占到8

17、8.9。SCCmec分型結(jié)果提示，在所有mecA陽性的菌株中，可檢測(cè)出II型菌株9株，占37.5；III型菌株15株，占62.5。未見I型和IV型菌株的存在。2.3 整合后的菌株親緣關(guān)系比較結(jié)果 將mecA陽性的24株菌結(jié)合藥敏試驗(yàn)的分型結(jié)果，用MEGA3.1軟件分析其同源性，構(gòu)建進(jìn)化樹結(jié)果見圖1。3 討論金黃色葡萄球菌是引起醫(yī)院和社區(qū)感染的重要致病菌，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用和各種侵入性醫(yī)療裝置的應(yīng)用，臨床上耐藥菌株不斷增多，尤其是MRSA引起的院內(nèi)感染，可引起爆發(fā)性流行，并可遠(yuǎn)距離播散。對(duì)院內(nèi)感染的MRSA菌株進(jìn)行耐藥譜分析和基因分型對(duì)于控制MRSA的院內(nèi)傳播和爆發(fā)具有重要的流行病學(xué)意義。細(xì)菌

18、分型的前提是流行病學(xué)上相關(guān)的菌株源于單一親代的克隆擴(kuò)增，分型方法有生物型、藥敏譜型、血清型和噬菌體型等表型方法和質(zhì)粒分析、染色體DNA限制性內(nèi)切酶分析、Southern雜交、PFGE、PCR分析等基因方法兩大類。藥敏譜型是細(xì)菌耐藥性檢測(cè)方面無可替代，并是醫(yī)院感染菌株的流行病學(xué)調(diào)查的重要內(nèi)容。本研究對(duì)院內(nèi)分離的43株菌進(jìn)行的藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示：大部分菌株呈現(xiàn)多重耐藥性。其中MRSA的菌株對(duì)青霉素和頭孢唑林的耐藥率也較高，達(dá)100和92.6，提示該醫(yī)院分離株對(duì)-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥情況較普遍。對(duì)糖肽類抗生素如萬古霉素完全敏感，替考拉寧也較敏感，耐藥率僅為3.7。該藥敏譜結(jié)果與國內(nèi)其它醫(yī)院分離株的藥敏結(jié)

19、果較為相似，但慶大霉素和四環(huán)素的耐藥率較其它報(bào)道略高5, 6。臨床上治療金黃色葡萄球菌引起的感染應(yīng)嚴(yán)格根據(jù)藥敏鑒定結(jié)果，明確是否為MRSA感染。對(duì)于MRSA菌株的治療，仍以糖肽類抗生素為主，應(yīng)合理規(guī)范使用抗生素，以免細(xì)菌耐藥性的進(jìn)一步加重。圖1 mecA陽性的24株菌的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果（數(shù)字為菌株編號(hào)） 現(xiàn)代分子微生物學(xué)的研究證實(shí)，MRSA耐藥的主要機(jī)制是由于獲得編碼低親和力的青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)的mecA基因，從而表現(xiàn)對(duì)甲氧西林耐藥。MecA基因位于SCCmec上，SCCmec主要由mec基因復(fù)合體和ccr基因復(fù)合體組成，根據(jù)兩種基因復(fù)合體組成的不同，SCCmec可以分成5種不

20、同的基因型別，是一種對(duì)MRSA進(jìn)行分型的重要方法。本研究用PCR法擴(kuò)增SCCmec基因分型的特征性基因，結(jié)果顯示本醫(yī)院院內(nèi)感染菌株以III型為主，其次是II型，未見I型和IV型菌株。研究發(fā)現(xiàn)，來自不同地區(qū)的MRSA菌株流行的基因型別也不相同。有研究對(duì)來源于20個(gè)國家的304株MRSA菌株進(jìn)行SCCmec分型，顯示以I型和型為主7；另有研究加拿大院內(nèi)感染分離MRSA菌株主要為SCCmec11型菌株8。一般認(rèn)為，SCCmec I型為早期醫(yī)院感染的MRSA菌株，SCCmec II和型為目前醫(yī)院感染的MRSA流行株，SCCmecIV型為社區(qū)感染MRSA菌株。本研究結(jié)果符合目前醫(yī)院感染的流行菌株，提示可

21、能存在院內(nèi)感染。型菌株SCCmec基因盒存在攜帶氨基糖苷類耐藥基因的PUB110質(zhì)粒和攜帶紅霉素耐藥基因的Tn554轉(zhuǎn)座子，型菌株具有攜帶四環(huán)素耐藥基因的PT181質(zhì)粒和Tn554轉(zhuǎn)座子，故型和型菌株一般表現(xiàn)為多重耐藥。整合藥敏譜和基因分型結(jié)果，分析菌株之間的親緣關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了親緣關(guān)系相近的菌株，提示這些菌株來源可能相同，具有追溯傳染源的意義。此外，這些菌株可能存在小范圍的爆發(fā)流行，因此應(yīng)對(duì)這些耐藥菌株采取及時(shí)而合理的控制。綜上所述，該醫(yī)院分離出的MRSA菌株存在多重耐藥和小規(guī)模爆發(fā)流行的現(xiàn)狀，給臨床治療帶來了一定困難。但菌株對(duì)糖肽類抗生素仍較為敏感，本結(jié)果有助于臨床合理使用抗菌藥物。為預(yù)防

22、耐藥金葡菌特別是MRSA的產(chǎn)生和傳播，院內(nèi)MRSA感染患者應(yīng)注意隔離，防止交叉感染；強(qiáng)調(diào)消毒隔離制度、無菌技術(shù)的規(guī)范操作，盡量減少侵入性操作；加強(qiáng)綜合治療和護(hù)理質(zhì)量。參考文獻(xiàn)1.Ito, T., et al., Structural comparison of three types of staphylococcal cassette chromosome mec integrated in the chromosome in methicillin-resistant Staphylococcus aureusJ. Antimicrob Agents Chemother, 2001, 45

23、(5): 1323-36.2.Ma, X.X., et al., Novel type of staphylococcal cassette chromosome mec identified in community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus strainsJ. Antimicrob Agents Chemother, 2002, 46(4): 1147-52.3.Ito, T., et al., Novel type V staphylococcal cassette chromosome mec driven by a novel cassette chromosome recombinase, ccrCJ. Antimicrob Agents Chemother,