演示文稿1FRET機(jī)理

1、1.熒光的產(chǎn)生熒光的產(chǎn)生 物質(zhì)分子的能級(jí)包括一系列電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)。一、一、基本原理基本原理 圖1 熒光、磷光能級(jí)圖 分子吸收能量后，從基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)或更高電子激發(fā)態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí)（這一過程速度很快，大約10-15 s），成為激發(fā)單重態(tài)分子。激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，可以通過以下幾種途徑釋放能量返回基態(tài)。 1） 振動(dòng)馳豫 這一過程只能發(fā)生在同一電子能級(jí)內(nèi)，即分子通過碰撞以熱的形式損失部分能量，從較高振動(dòng)能級(jí)下降到該電子能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)上。由于這一部分能量以熱的形式釋放，而不是以光輻射形式發(fā)出，故振動(dòng)馳豫屬于無輻射躍遷。 2） 內(nèi)轉(zhuǎn)換 即激發(fā)態(tài)分子將多余的能量轉(zhuǎn)變?yōu)闊?/p>

2、能，從較高電子能級(jí)降至較低的電子能級(jí)。內(nèi)轉(zhuǎn)換也屬于無輻射躍遷。 3） 熒光 較高激發(fā)態(tài)分子經(jīng)無輻射躍遷降至第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)后，仍不穩(wěn)定，停留較短時(shí)間后（約10-8 s，稱作熒光壽命），以光輻射形式放出能量，回到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，這時(shí)所發(fā)射的光稱為熒光。當(dāng)然也可以無輻射躍遷形式返回基態(tài)。 4）系間竄躍 有些物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子通過振動(dòng)馳豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換下降到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)后，有可能經(jīng)過另一個(gè)無輻射躍遷轉(zhuǎn)移至激發(fā)三重態(tài)，這一過程伴隨著自旋方向的改變，稱為系間竄躍。對(duì)于大多數(shù)物質(zhì)，系間竄躍是禁阻的。如果分子中有重原子（如I、Br等）存在，由于自旋-軌道的強(qiáng)偶合作用，電子自旋方向可以

3、改變，系間竄躍就變得容易了。 5） 磷光 經(jīng)系間竄躍的分子再通過振動(dòng)馳豫降至激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，停留一段時(shí)間（10-410 s，稱作磷光壽命），然后以光輻射形式放出能量返回到基態(tài)各振動(dòng)能級(jí)，這時(shí)發(fā)出的光稱為磷光（phosphorescence）。由于激發(fā)三重態(tài)能量比激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)能量低，故磷光輻射的能量比熒光更小，即磷光的波長(zhǎng)比熒光更長(zhǎng)。1 1）熒光的檢測(cè)）熒光的檢測(cè) 光源發(fā)出的紫外可見光通過激發(fā)單色器分出不同波長(zhǎng)的激發(fā)光，照射到樣品溶液上，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。樣品發(fā)出的熒光為寬帶光譜，需通過發(fā)射單色器分光后再進(jìn)入檢測(cè)器，檢測(cè)不同發(fā)射波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度F。由于激發(fā)光不可能完全被吸收，

4、可透過溶液，為了防止透射光對(duì)熒光測(cè)定的干擾，常在與激發(fā)光垂直的方向檢測(cè)熒光（因熒光是向各個(gè)方向發(fā)射的）。 2.激發(fā)光譜和熒光光譜激發(fā)光譜和熒光光譜 任何熒光物質(zhì)，都具有兩種特征光譜，即激發(fā)光譜(excitation spectrum)和熒光發(fā)射光譜(fluorescence emission spectrum)。 2）激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的形成）激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的形成2.1 激發(fā)光譜激發(fā)光譜 保持熒光發(fā)射波長(zhǎng)不變（即固定發(fā)射單色器），依次改變激發(fā)光波長(zhǎng)（即調(diào)節(jié)激發(fā)單色器），測(cè)定不同波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)下得到的熒光強(qiáng)度F（即激發(fā)光波長(zhǎng)掃描）。然后以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)作圖

5、，就可得到該熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。 任何熒光物質(zhì)，都具有兩種特征光譜，即激發(fā)光譜(excitation spectrum)和熒光發(fā)射光譜(fluorescence emission spectrum)。 2）激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的形成）激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜的形成 激發(fā)光譜上熒光強(qiáng)度最大值所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)就是最大激發(fā)波長(zhǎng)，是激發(fā)熒光最靈敏的波長(zhǎng)。物質(zhì)的激發(fā)光譜與它的吸收光譜相似，所不同的是縱坐標(biāo)。2.2 熒光光譜 熒光光譜，又稱發(fā)射光譜。保持激發(fā)光波長(zhǎng)不變（即固定激發(fā)單色器），依次改變熒光發(fā)射波長(zhǎng)，測(cè)定樣品在不同波長(zhǎng)處發(fā)射的熒光強(qiáng)度F。以發(fā)射波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，以熒光強(qiáng)度F為縱坐標(biāo)作圖，得到熒光發(fā)射光譜

6、。熒光發(fā)射光譜上熒光強(qiáng)度最大值所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)就是最大發(fā)射波長(zhǎng)。 圖2 蒽在乙醇溶液中的激發(fā)光譜（-）和發(fā)射光譜3）發(fā)射光譜與激發(fā)光譜的關(guān)系 3.1 發(fā)射光譜形狀與激發(fā)光波長(zhǎng)無關(guān) 由于熒光是分子從第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回到基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)時(shí)釋放的光輻射，與分子被激發(fā)至哪一個(gè)電子激發(fā)態(tài)無關(guān)。 3.2 發(fā)射光譜比激發(fā)光譜波長(zhǎng)為長(zhǎng) 由于分子吸收激發(fā)光被激發(fā)至較高激發(fā)態(tài)后，先經(jīng)無輻射躍遷（振動(dòng)馳豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換）損失掉一部分能量，到達(dá)第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，再由此發(fā)出熒光。因此，熒光發(fā)射能量比激發(fā)光能量低，發(fā)射光譜波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)。 3.3 鏡像對(duì)稱 對(duì)于高度對(duì)稱的有機(jī)分子，其熒光發(fā)射光譜與吸收

7、光譜呈鏡像對(duì)稱關(guān)系。解釋1：能級(jí)結(jié)構(gòu)相似性 熒光為第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到基態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)而形成，即其形狀與基態(tài)振動(dòng)能級(jí)分布有關(guān)。 激發(fā)光譜是由基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)躍遷到第一電子激發(fā)單重態(tài)的各個(gè)振動(dòng)能級(jí)而形成，即其形狀與第一電子激發(fā)單重態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布有關(guān)。 由于激發(fā)態(tài)和基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布具有相似性，因而呈鏡像對(duì)稱。S1S01 1）物質(zhì)產(chǎn)生熒光的必要條件物質(zhì)產(chǎn)生熒光的必要條件 一種物質(zhì)能否發(fā)熒光以及熒光強(qiáng)度的高低，與它的分子結(jié)構(gòu)及所處的環(huán)境密切相關(guān)。能夠發(fā)射熒光的物質(zhì)都應(yīng)同時(shí)具備兩個(gè)條件： 3. 影響產(chǎn)生熒光及熒光強(qiáng)度的因素影響產(chǎn)生熒光及熒光強(qiáng)度的因素必要條件必要條件物質(zhì)分子必須有

8、強(qiáng)的紫外吸收（*躍遷）物質(zhì)具有較高的熒光效率。也稱熒光量子產(chǎn)率，用f 表示。 凡是使 kF 增加，使其它去活化常數(shù)降低的因素均可增加熒光量子產(chǎn)率。通常，kF 由分子結(jié)構(gòu)決定（內(nèi)因），而其它參數(shù)則由化學(xué)環(huán)境和結(jié)構(gòu)共同決定。FfFVRICISCECPkkkkkkk發(fā)射的熒光量子數(shù)吸收的光量子數(shù)2.影響熒光及其強(qiáng)度的因素影響熒光及其強(qiáng)度的因素 躍遷類型躍遷類型：如上所述，物質(zhì)必須在紫外可見區(qū)有強(qiáng)吸收和高熒光效率才能產(chǎn)生熒光。具有* 躍遷的分子才有強(qiáng)吸收。共軛效應(yīng)共軛效應(yīng)：大多數(shù)能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)都含有芳香環(huán)或雜環(huán)，具有共軛的* 躍遷。其共軛程度愈大，熒光效率也愈大，且最大激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)都向長(zhǎng)波長(zhǎng)方向移

9、動(dòng)，如苯、萘、蒽三種物質(zhì)。 苯萘蒽維生素A205nm286nm356nm327nm278nm321nm404nm510nm0.110.290.36 exem剛性平面結(jié)構(gòu)剛性平面結(jié)構(gòu)：當(dāng)熒光分子共軛程度相同時(shí)，分子的剛性和共平面性越大，熒光效率越大。O-OOCOO-熒光物質(zhì)（熒光素）-OOCOO-非熒光物質(zhì)（酚酞）芴（=1.0）聯(lián)苯（=0.2） 有些物質(zhì)本身不發(fā)熒光或熒光較弱，但和金屬離子形成配合物后，如果剛性和共平面性增加，就可以發(fā)熒光或增強(qiáng)熒光。如8-羥基喹啉是弱熒光物質(zhì)，與Mg2+、Al3+ 等金屬離子形成的配合物的熒光增強(qiáng)，利用這一特點(diǎn)可以間接測(cè)定金屬離子。 NOH8-羥基喹啉NOAl/

10、38-羥基喹啉-鋁取代基團(tuán)取代基團(tuán) 熒光分子上的各種取代基對(duì)分子的熒光光譜和熒光強(qiáng)度都有很大影響。給電子取代基如NH2、OH、OCH3、NHR、NR2等，能增加分子的電子共軛程度，使熒光效率提高。而-COOH、NO2、C=O、F、Cl等吸電子取代基，可減弱分子電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。還有一類取代基則對(duì)熒光的影響不明顯，如R、SO3H、NH3 等。溫度溫度 溫度對(duì)被測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度有明顯的影響。當(dāng)溫度升高時(shí)，介質(zhì)粘度減小，分子運(yùn)動(dòng)加快，分子間碰撞幾率增加，從而使分子無輻射躍遷增加，熒光效率降低。故降低溫度有利于提高熒光效率及熒光強(qiáng)度。 溶劑溶劑 同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中，其熒光光譜的

11、位置和熒光強(qiáng)度可能會(huì)有一定的差別，尤其是那些分子中含有極性取代基的熒光物質(zhì)，它們的熒光光譜易受溶劑的影響。 溶劑的影響可以分為一般溶劑效應(yīng)和特殊溶劑效應(yīng)。一般溶劑效應(yīng)是指溶劑極性的影響。通常情況下，隨著溶劑極性增大，* 躍遷所需的能量差E減小，躍遷幾率增加，從而使熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移，熒光強(qiáng)度增大。 一般而言， 探針激發(fā)態(tài)的偶極矩大于基態(tài)偶極矩， 當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)后， 溶劑的偶極子在激發(fā)態(tài)的熒光基團(tuán)的周圍重新定向而降低激發(fā)態(tài)的能量，溶劑的極性越大，熒光團(tuán)激發(fā)態(tài)能量降低的越多， 因而從激發(fā)態(tài)躍遷回基態(tài)時(shí)發(fā)射的能量越低， 發(fā)射的波長(zhǎng)就越長(zhǎng)特殊溶劑效應(yīng)是指溶劑與熒光物質(zhì)形成化合物，或溶劑使熒光物質(zhì)的電離狀態(tài)

12、改變，使熒光峰的波長(zhǎng)和熒光強(qiáng)度都發(fā)生較大變化。如在萘胺的乙醇溶液中加入鹽酸，隨著溶液中鹽酸濃度的增加，萘胺的NH2基逐漸被NH3Cl基所代替，而NH3Cl基對(duì)萘環(huán)特征頻率的影響小于NH2，因此溶液的熒光光譜趨近于萘的熒光光譜。 pH值：溶液的酸度（pH值）對(duì)熒光物質(zhì)的影響可以分兩個(gè)方面： 1若熒光物質(zhì)本身是弱酸或弱堿時(shí)，溶液pH值改變，物質(zhì)分子和其離子間的平衡也隨之發(fā)生變化，而不同形體具有其各自特定的熒光光譜和熒光效率。例如苯胺 NH3+NH2OH-H+OH-H+NH-PH13無熒光（離子形式）2. 對(duì)于金屬離子與有機(jī)試劑生成的熒光配合物，溶液pH值的改變會(huì)影響配合物的組成，從而影響它們的熒光

13、性質(zhì)。例如Ga3+離子與鄰-二羥基偶氮苯，在pH34的溶液中形成1:1配合物，能產(chǎn)生熒光。而在pH67的溶液中，則形成12的配合物，不產(chǎn)生熒光。 總之，溶液pH值對(duì)熒光物質(zhì)的熒光光譜、熒光效率及熒光強(qiáng)度均有影響。需通過條件實(shí)驗(yàn)找出pH與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，確定最適宜的pH范圍，以提高分析的靈敏度和準(zhǔn)確度。 Frster resonance energy transfer， ( FRET)FRET是指在兩個(gè)不同的熒光團(tuán)中，如果一個(gè)熒光團(tuán)(Doner)的發(fā)射光譜和另一個(gè)熒光團(tuán)(Aceptor)的吸收光譜有一定的重疊，當(dāng)這兩個(gè)熒光團(tuán)間的距離合適時(shí)(一般小于100)，就可以觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的

14、現(xiàn)象，即用供體的激發(fā)波長(zhǎng)激發(fā)時(shí)，可觀察到受體的熒光發(fā)射。進(jìn)一步講，就是在供體的激發(fā)狀態(tài)下由一對(duì)偶極子介導(dǎo)的能量從供體向受體轉(zhuǎn)移的過程。此過程沒有光子的參與，所以是非輻射性的。影響共振能量轉(zhuǎn)移效率的因素1）供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜重疊程度2）供體與受體間的距離3）供體與受體的躍遷偶極的相對(duì)取向選擇性識(shí)別F-的熒光傳感器受體分子是利用共振能量轉(zhuǎn)移原理識(shí)別F的傳感器。在THF溶液中，以 294nm（三芳基硼的吸收帶）激發(fā)，只觀察到位于 670nm 的卟啉的熒光發(fā)射峰而觀測(cè)不到三芳基硼基團(tuán)的熒光發(fā)射， 說明發(fā)生了從三芳基硼到卟啉的能量轉(zhuǎn)移過程。氟離子加入后與硼反應(yīng)，使硼原子的雜化軌道由 sp2變?yōu)?sp3，進(jìn)而減弱了體系的共軛，阻斷了能量轉(zhuǎn)移的發(fā)生，于是產(chǎn)生兩個(gè)新的熒光峰，分別位于356 nm（三芳基硼的發(fā)射）和692nm（卟啉的發(fā)射），而位于670nm 處的熒光強(qiáng)度減弱，說明由三芳基硼到卟啉的能量轉(zhuǎn)移被阻斷。因此該體系可用于比值法檢測(cè)氟離子。選擇性識(shí)別Na+的熒光傳感器 分子中芘為能量供體，蒽-9-羧酸酯為能量受體，杯芳烴為Na+的結(jié)合位點(diǎn)。在甲醇-四氫呋喃(15:1)的混合溶劑中，可同時(shí)觀察到芘和蒽-9-羧酸酯的熒光發(fā)射。隨著Na+的加入，相對(duì)于芘的熒光發(fā)射，蒽-9-羧酸酯的熒光增強(qiáng)程度更大，說明Na+的加入使芘與蒽-9-羧酸酯間的距離減小，能量轉(zhuǎn)移