蘇南丘陵區(qū)紫花苜蓿菌核病病原研究及防治初報

1、蘇南丘陵區(qū)紫花苜蓿菌核病病原研究及防治初報張薇1 胡躍高1 張力群2 儲國良3中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)工程研究中心，北京1000942. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)植病系，北京1000943. 江蘇省鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，句容 212400摘 要 本文通過對核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）序列分析，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對采自蘇南丘陵地區(qū)的苜蓿菌核病菌NJ1進行病原鑒定，確定病原菌為三葉草核盤菌（Sclerotinia trifoliorum）。對該病原菌生物學(xué)特性研究表明，菌絲生長最適溫度為1823，最適pH值為59。病原菌對硫酸銨利用能力強，對L-半胱氨酸利用能力差；對甘露醇和乳糖利用最好，D-果糖和D-木糖利用較差,不能利

2、用檸檬酸。用平皿法比較化學(xué)藥劑對病原菌抑菌殺菌能力，其中根必治、速克靈和萬霉凈3000倍液可完全抑制病菌生長，溫室生測表明根必治防效最好。從當?shù)剀俎８H土壤中篩選到三種有效生防細菌，平皿對峙試驗中S1和S2抑菌效果較好，抑菌帶達到或超過1.5cm，溫室生測S2生防效果最好，防效達67.5%。關(guān)鍵詞 苜蓿菌核病，Sclerotinia trifoliorum，ITS，防治隨著蘇南丘陵區(qū)苜蓿生產(chǎn)擴大，發(fā)生了嚴重的菌核病害。病原菌在田間形成可以越冬（夏）的菌核，以菌絲形態(tài)在田間大量侵染，造成苜蓿減產(chǎn)和品質(zhì)降低。國外對苜蓿菌核病原菌生理生化特性、發(fā)病生態(tài)因子及防治方面研究較多，如1978年美國植病學(xué)會

3、舉行的Sclerotinia學(xué)術(shù)討論會上所報道的菌絲適宜生長pH值為2.591，二十多種化學(xué)藥劑2和盾殼霉、木霉菌等生防菌3可以防治菌核病。我國自發(fā)現(xiàn)苜蓿菌核病后一直沒有病原菌的鑒定報道。由于核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS（internal transcribed spacer）在真菌種間存在豐富的變異，該區(qū)域的DNA酶切圖譜以及序列分析為真菌分類、鑒定提供了一個強有力的工具4?；诖耍珻arbone和Kohn在1993年5就已經(jīng)研究了核盤菌科（Sclerotiniacceae）核糖體DNA的ITS1之間的差異，Holst-Jensen 等1998年利用ITS研究了核盤菌及其近緣屬間的系統(tǒng)發(fā)育6。

4、本研究通過克隆核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征對病原菌進行鑒定；以碳、氮源，溫度，酸堿度等生理指標研究病原菌生物學(xué)特性；運用平皿法和盆栽法篩選出幾種有效的殺菌劑和生防菌，并對病害防治進行了初步探索。1材料與方法1.1病原鑒定形態(tài)學(xué)特征觀察 病原菌菌核于2001年9月采自江蘇省句容市磨盤鄉(xiāng)潘沖村苜蓿病區(qū)土壤。將菌核表面消毒后置于PDA平皿中25ºC培養(yǎng)72h，取邊緣菌絲于新鮮PDA平皿中培養(yǎng)72h，在顯微鏡下切取菌絲尖端約1mm，進行純培養(yǎng)，得菌株NJ1。將采集到的子囊盤和PDA平皿上生長的菌核用1NaClO表面消毒3min，切片于顯微鏡下觀察。區(qū)的克隆與序列分析菌絲基因組DNA提取如

5、文獻7所述。采用引物ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）和ITS5（5-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3）8，以菌株NJ1菌絲基因組DNA為模板擴增ITS片段。PCR程序如下：95ºC變性5min；95ºC 40sec，52ºC 40sec，72ºC 1min，共30個循環(huán)；72ºC延伸10min。PCR產(chǎn)物連接pMD18-T（TAKARA公司），轉(zhuǎn)化Escherichia coli DH5。重組質(zhì)粒命名為pMD18-ITS，并測序（上海申友生物技術(shù)有限責任公司）。應(yīng)用BLAST對序列同源性比較（）。1.

6、2溫度對菌絲生長的影響在培養(yǎng)23d的菌落邊緣打孔，轉(zhuǎn)接至PDA平皿中央，每皿1片菌餅。分別在2、6、10、15、18、20、23、25、28、33和37下培養(yǎng)。每處理4個重復(fù)，每天定時測量菌絲生長直徑，依文獻9所述方法計算菌絲平均生長速率。1.3酸堿度對菌絲生長的影響用1mol/L的HCl和NaOH調(diào)PDA培養(yǎng)基pH值，梯度設(shè)為313。在培養(yǎng)23d的苜蓿菌核病菌落邊緣打孔，各處理平板中央接種直徑為7mm菌餅，4個重復(fù)，23恒溫培養(yǎng)，每天定時測量菌落直徑，并計算平均生長速率。1.4碳源和氮源對菌絲生長的影響以查彼(Czapek)培養(yǎng)基10作為基本培養(yǎng)基。分別用等量的乳糖、淀粉、甘露醇、葡萄糖、麥

7、芽糖、檸檬酸、D-果糖、D-木糖置換其中的蔗糖；分別用等量的谷氨酸、硫酸銨、硝酸鉀、L-天冬堿、L-半胱氨酸、L-苯丙氨酸置換硝酸鈉，配成不同碳源和氮源的培養(yǎng)基,調(diào)pH至7.0。設(shè)無碳、無氮和水瓊脂對照。平皿中央接菌餅，23下培養(yǎng)，4次重復(fù)，每日定時測量菌落直徑。1.5殺菌劑對病原菌的殺菌毒力實驗采用12種殺菌劑：赤霉清（25%多·酮WP，江蘇省綠盾植保農(nóng)藥實驗有限公司），灰核克星（50%多·霉威WP，山東壽光雙星化工廠），速克靈（50%二甲酰亞胺WP，日本住友化學(xué)工業(yè)株式會社），萬霉凈（55%甲硫·菌核凈WP，山東神星農(nóng)藥），土菌靈（20%乙酸銅WP，山東綠豐農(nóng)

8、藥有限公司），百菌清（75%四氯間苯二晴WP，日本SDS Biotech K.K.），可殺得（77%氫氧化銅WP，美國固信公司），多菌靈（50% WP，石家莊市華星農(nóng)藥廠），敵克松（55%敵磺鈉WP，遼寧省丹東市農(nóng)藥總廠），福美雙（50%雙硫胺甲酰WP，天津市捷康化學(xué)品有限公司），根必治（45%五氯·福WP，山東綠豐農(nóng)藥有限公司），百菌通（60%琥·乙膦鋁WP，齊齊哈爾四友化工實業(yè)有限公司）。每個藥劑設(shè)500、1500、2000倍3個濃度，將稱量好的藥劑與熔化的PDA混合，倒平板。以不添加藥劑的PDA為空白對照，每處理4個重復(fù)。平皿中央接菌餅，23培養(yǎng)，每日定時測量菌落直徑

9、，依文獻11所述計算相對抑制百分率。對抑菌顯著的藥劑降低濃度作進一步篩選。1.6殺菌劑的溫室生測苜蓿種子催芽后播種，每處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)5個苗缽（10×9.7×6.4cm），每缽播20粒種子，待五葉期時接種麥麩培養(yǎng)的病原菌培養(yǎng)物約2g（菌:麥麩1:1），菌上覆土1cm。接種兩天后噴灑化學(xué)藥劑，各藥劑分別設(shè)500、1000、2000倍濃度。以不接病原菌(CK+)和不噴灑藥劑(CK)為對照，實驗室溫為2530。依據(jù)文獻12所述分級標準計算病情指數(shù)和防效。1.7拮抗細菌的篩選系列稀釋法從句榮苜蓿菌核病、油菜菌核病土中分離細菌。取1g土樣溶于10ml滅菌水，系列稀釋至105倍，

10、各取100µL均勻涂布于LB平板上，28培養(yǎng)48h，挑取形態(tài)有明顯差異的菌落保存?zhèn)溆?。平皿對峙法篩選拮抗NJ1的細菌，記錄抑菌帶大小，每個處理設(shè)3次重復(fù)。1.8生防菌生物測定將分離到的細菌S1、S2、S3與來自中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生防室的生防細菌Bacillus megaterium B130、B. subtilis B908接種于LB培養(yǎng)液中28培養(yǎng)。將已催芽的種子分別浸于濃度為108CFU/ml的各生防菌液中20min，無菌水作對照。播種后到五葉期時接種病原菌，方法同1.6。2結(jié)果與分析2.1菌株NJ1的鑒定結(jié)果菌株NJ1的菌核黑色，球形或橢圓形，表面粗糙，直徑45mm，在PDA中于平皿

11、邊緣生長。子囊盤褐色，盤形，直徑25mm。子囊棍棒形，子囊孢子橢圓形，單胞，無色，形態(tài)特征與核盤菌屬最為相近。123MM10.5kb kb3 kb1 kb利用引物ITS4與ITS5可以擴增到長度為1,040bp的片段（圖1，泳道2），其中第495643bp為ITS1區(qū)，第644801bp為5.8S 亞基，第802948bp為ITS2區(qū)。圖2為目標菌ITS區(qū)（包括5.8S亞基）核苷酸序列同源性比對結(jié)果。菌株NJ1 ITS區(qū)與 Sclerotinia trifoliorum同源性達100%，與S. sclerotiorum同源性為99%。菌株NJ1與S. sclerotiorum相比，在ITS1區(qū)

12、有一個、ITS2區(qū)有兩個堿基發(fā)生變化，5.8S rDNA的核苷酸序列完全相同，可見核糖體小亞基在屬內(nèi)種間是高度保守的，ITS區(qū)在種間具有變異性。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征分析可以確定菌株NJ1為三葉草核盤菌（S. trifoliorum）。圖1 菌株NJ1基因組DNA及ITS片段電泳圖譜Fig.1. The electrophoresis of genome DNA and ITS of strain NJ1M: 1 kb標準DNA；1: NJ1基因組DNA；2: ITS片段PCR產(chǎn)物；3: Pst、BamH雙切pMD18-ITSM: 1 kb size DNA marker; 1: NJ1 genomi

13、c DNA; 2: ITS segment by PCR; 3: pMD18-ITS digested by Pstand BamH1 CAGAGTTCAT GCCCGAAAGG GTAGACCTCC CACCCTTGTG TATTATTACT TTGTTGCTTTêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêê

14、34;êê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêêêêêêêêêêêê êêêêêêê

15、;êêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê61 GGCGAGCTGC TCTTCGGGGC CTTGTATGCG C

16、GCCAGAGAA TATCAAAACT CTTTTTATTAêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêê&

17、#234;êêêêê êêêêêêêêêêêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêT êêêê&#

18、234;êêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê121 ATGTCGTCTG AGTACTATAT AATAGTTAAA ACTTTCAACA ACGGATCTCT TGGTTCTGGCêêêêêêêêêê êê&#

19、234;êêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêêê

20、4;êêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê ê

21、;êêêêêêêêê181 ATCGATGAAG AACGCAGCGA AATGCGATAA GTAATGTGAA TTGCAGAATT CAGTGAATCAêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêê

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23、234;ê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê241 TCGAATCTTT GAACGCACAT TGCGCCCCTT GGTATTCCG

24、G GGGGCATGCC TGTTCGAGCGêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêê

25、34;êêêê êêêêêêêêêêêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêê

26、;êêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê301 TCATTTCAAC CCTCAAGCTC AGCTTGGTAT TGAGTCCATG TCAGCAATGG CAGGCTCTAAêêêêêêêêêê êêê

27、;êêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêêêê&

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29、#234;êêêêêêê361 AATCAGTGGC GGCGCCGCTG GGTCCTGAAC GTAGTAATAT CTCTCGTTAC AGGTTCTCGGêêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê &

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31、234;êêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê421 TGTGCTTCTG CCAAAACCCA AATTTTCTAT GGTT strain NJ1ê&

32、#234;êêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêê Sclerotinia trifoliorum（Z99676） êêêêêêêêêê ê

33、êêêêêêêêê êêêêêêêêêê êêêê Sclerotinia sclerotiorum（M96382）圖2 菌株 NJ1與近源菌ITS15.8S rDNAITS2區(qū)序列比對Fig. 2 Alignment of the ITS15.8S rDNAITS2 homologues2.2溫度對菌絲生長的影響菌絲在不同培養(yǎng)溫度下生長量不同（圖3）。在33、37下

34、不能生長，實驗設(shè)定的最低溫度2仍可生長；1823為菌絲生長的最適溫度；2、6和28下只緩慢的生長,菌絲不形成菌核（表1）；1015低溫條件下菌核形成緩慢，10下培養(yǎng)30d才見到成熟菌核，在2023只需5d就形成黑色菌核；從菌核數(shù)量看，2025間產(chǎn)量最多。表1 菌核形成與溫度的關(guān)系Table 1 The relationship between the sclerotium formation and temperature溫度()Temperature26101518202325283337菌核形成期(天)sclerotium formation period 30179658菌核總數(shù)(個/皿

35、)sclerotium number4718419033注：為不產(chǎn)生菌核。表中數(shù)據(jù)為10次重復(fù)平均值。Note: none sclerotium. The data in the table are averages of 10 replicates.2.3 pH值對菌絲生長的影響苜蓿菌核病菌菌絲生長對pH值的適應(yīng)范圍較廣，實驗中pH值312范圍內(nèi)菌絲均可生長，但生長速度有明顯差異。當pH值為5時菌絲生長最快，日生長量達到3cm。當pH值大于7時，菌絲生長速率隨pH值增大而減小，pH值為13時菌絲不再生長（圖4）。說明苜蓿菌核病菌適宜在中性偏酸環(huán)境下生長。 圖3 菌絲在不同溫度下的生長速率 圖

36、4 不同pH值對菌絲生長的影響 Fig.3 The speed of growth in different temperature Fig.4 Mycelial growth in different pH value2.4 碳源和氮源對菌絲生長的影響氮源對苜蓿菌核病菌落生長影響較大(圖5)，該菌硫酸銨利用最好，菌絲稠密；對L-天冬堿利用較好，生長速率快；可以利用谷氨酸、硝酸鉀、DL-苯丙氨酸，但菌絲生長稀疏，菌落薄。其中在L-半胱氨酸的培養(yǎng)基上菌落生長最慢，且形態(tài)不規(guī)則。對于供試的9種碳源，該菌在甘露醇和乳糖中生長速率最快(圖6)，但菌落稀疏；對蔗糖，可溶性淀粉和葡萄糖等碳源利用較好，菌落

37、形態(tài)正常，生長速率快，其中在淀粉培養(yǎng)基上菌絲生長致密；對D-果糖、D-木糖和麥芽糖利用能力較差，不能利用檸檬酸。2.5 殺菌劑對病原菌的殺菌毒力試驗中對土菌靈等12種藥劑進行殺菌毒力測定，其中百菌清、赤霉清、福美雙、根必治、萬霉凈和速克靈6種藥劑抑菌效果較好，500、1000、1500倍藥劑濃度抑菌率達到或接近100，其它藥劑則分別為093%不等。對上述試驗6個藥劑稀釋濃度進行二次篩選。結(jié)果表明，根必治、速克靈和萬霉凈3000倍藥圖 5 不同氮源中菌絲生長速率 圖 6 不同碳源中菌絲生長速率Fig.5 The speed of growth Fig.6 The speed of growth

38、in different nitrogen source in different carbon source液仍對病原菌表現(xiàn)了較好的抑制效果，抑菌率為100%（見圖7）。百菌清、赤霉清、福美雙3000倍液抑菌率分別為88%、83%、99。圖7 化學(xué)藥劑對病原菌生長的抑制作用Fig. 7 Inhibition effect of fungicide against NJ11百菌清（chlorothalonil） 2赤霉清（carbendazim-triadimefon） 3福美雙（thiram）4根必治（kobutol-thiram） 5速克靈（sumilex） 6萬霉凈（diethofenc

39、arb）2.6 殺菌劑藥效試驗噴藥7d后調(diào)查病指。如表2所示，三種藥劑500倍液對苜蓿菌核病防效均達到或超過45，速克靈1000倍液接近50，而根必治2000倍液的防效達到52.4。相對無施藥對照，三種藥劑的病情指數(shù)均顯著降低，且各處理間病情指數(shù)差異顯著；從防效上看，根必治各處理均好于速克靈與萬霉凈。由于根必治2000倍液處理病指與1000倍液處理病指無顯著差異，因此，根據(jù)低濃度，低污染的施藥原則，根必治2000倍液應(yīng)當是理想的防治苜蓿菌核病的藥劑倍數(shù)，但田間效果有待進一步試驗證明。表2 幾種化學(xué)藥劑對苜蓿菌核病的盆栽試驗防效Table 2 Control effect of fungicid

40、e on NJ1處 理 Treatment病情指數(shù) Disease index500 1000 2000防效(%) Control efficiency500 1000 2000對照 Control77.6a55%萬霉凈WPdiethofencarb42.3b49.8b54.3b45.435.830.050%速克靈WPSumilex29.8c38.8c45.2c61.649.941.745%根必治WPkobutol-thiram20.3d28.4d36.9d73.963.652.4注：同列數(shù)據(jù)后標有相同字母者表示在5%水平差異不顯著，下同。Note: The same letters in t

41、he same column means they were not significantly different at 5% level by Duncans multiple range test, the same to below.2.7 生防菌對病菌的拮抗能力室內(nèi)應(yīng)用平板對峙法篩選出三種對病原菌拮抗效果顯著的細菌，代號分別為S1、S2、S3。其中S1抑菌帶達1.8cm，S2為1.5cm，S3為0.4cm。對來自中國農(nóng)大植病生防室的生防菌進行篩選，B130抑菌帶寬1.7cm，木霉-T10、木霉-XW2，細菌B908也具有拮抗效果。2.8 生防菌生物測定 在實驗條件下對照發(fā)病快而且嚴重

42、，接種病原菌20d后幾乎全部發(fā)病。從表3可以看出，各生防菌處理病指均顯著低于對照病指，其中S2防效最好，最高時達67.5%，而且在對照發(fā)病達90%時防效仍維持在60%，說明S2防效持續(xù)時間長且效果穩(wěn)定。S1防效最低，而且持續(xù)時間最短，7d后防效開始降低。其余菌株的防效均維持在50%左右，防效較持久。表3 不同生防菌防治效果Table 3 Effect of biocontrol bacteria on suppression of NJ1處理Treatment病情指數(shù) Disease index7d 10d 15d防效(%) Control efficiency 7d 10d 15d對照 Co

43、ntrol41.7a67.3a86.6aS121.4bc32.8c51.4c48.751.340.6S217.7c21.9d33.2d57.667.561.7S327.9b53.4b74.7b32.020.714.1B13019.9bc31.3c48.5c52.453.544.0B90818.5c30.9c46.1c55.754.146.83結(jié)論與討論本研究運用ITS法對我國江蘇丘陵地區(qū)苜蓿菌核病進行病原鑒定。結(jié)果顯示菌株NJ1的ITS15.8S rDNAITS2核苷酸序列與Sclerotinia trifoliorum的完全相同；與S. sclerotiorum同源性為99%，三個變異位點分

44、別發(fā)生在ITS和1TS2區(qū)，5.8S rDNA序列相同。說明5.8S rDNA在核盤菌種間是保守的，而ITS區(qū)在種間具有變異性，因此ITS區(qū)序列的差異可為核盤菌種水平的鑒定提供一定依據(jù)。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)特征可以確定，發(fā)生在我國蘇南丘陵地區(qū)的苜蓿菌核病是由三葉草核盤菌（S. trifoliorum）引致。江蘇省句容地區(qū)的苜蓿菌核病菌菌株，在實驗室條件下菌絲生長的溫度范圍為228，1823為最適生長溫度。低于6、高于28均不產(chǎn)生菌核。2025形成菌核的速度最快，數(shù)量最多。在當?shù)兀?、5月份日均溫達到20，適合菌核形成，菌核病大量發(fā)生，可根據(jù)發(fā)病期提前進行防治。該菌對酸堿度適應(yīng)范圍廣，pH值312范

45、圍均能生長，pH值為5時菌絲生長最快，pH值大于7時，菌絲生長速率隨pH值增大而減小，pH值為13時菌絲不再生長。由此可見苜蓿菌核病菌菌絲適宜在中性偏酸環(huán)境下生長。當?shù)赝寥缹冱S棕壤，肥力低，pH值6.5左右，酸堿度適宜苜蓿菌核病的發(fā)生，因此，播種時增施石灰和磷、鉀肥可能提高植株抗病性。根必治、速克靈和萬霉凈均為亞胺類殺菌劑，當質(zhì)量濃度稀釋到0.33%時，對病原菌的抑制率仍達到100。盆栽試驗中速克靈500倍液和根必治5002000倍液防治效果較好，可以此為基礎(chǔ)開展田間實驗，以確定最佳濃度和最佳噴施時間，從而為苜蓿菌核病的防治提供依據(jù)。已有實驗表明，播前用木霉菌菌粉拌種或直接施用到土壤，對溫室黃

46、瓜根腐病和田間油菜菌核病防效分別達到50%和60%，并有長期效果13。本試驗通過平板對峙法篩選到幾株有效抑制菌株NJ1的生防菌，溫室生測表明S2生防效果較好，但其生防機理仍須進一步研究。生物防治以其獨特的優(yōu)勢越來越受到植保工作者的重視，本實驗中生防菌的抑菌效果雖不及殺菌劑，但其較穩(wěn)定的防效以及無污染的特點仍值得深入研究。參 考 文 獻1 蘇祖芳基蘗肥與穗粒肥配比對水稻產(chǎn)量形成的影響水稻群體質(zhì)量理論與實踐北京: 中國農(nóng)業(yè)科技出版社, 1995: 155-1602 Sharma S K, Verma B R, Sharma B K. Biocontrol of Sclerotinia sclero

47、tiorum causing stem rot of chickpea. Indian-Phytopathology, 1999, 52(1): 44-463 Hedke K, Luth P, von Triedemann A. CONTANS®-Frist biocontrol agent against Sclerotinia sclerotiorum in oilseed rape. Proceedings of the 10th International Rapeseed Congress. 1999, 9: 26-29, Canberra, Australia.4 陸家云

48、主編植物病原真菌學(xué)北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 20015 Carbone I, Kohn L M. Ribosomal DNA sequence divergence within internal transcribed spacer 1 of the Sclerotiniaceae. Mycologia, 1993, 85(3): 415-4276 Holst-Jensen A, Vaage M, Schumacher T. An approximation to the phylogeny of Sclerotinia and related genera. Nord. J. Bot.,

49、1998, 18(6): 705-719 7 Kohn L M, Petsche D M, Bailty S R, et al. Restriction fragment length polymorphisms in nuclear and mitochondarial DNA of Sclerotinia species. Phytopathology, 1988, 78(8): 1047-10528 Hsiao C, Chatterton N J, Asay K H. Phylogenetic relationships of the mongenomic species of the

50、wheat tribe, Triticeae(Poaceae), inferred from nuclear rDNA (ITS) sequences. Theor. Appl. Genet., 1995, 90: 389-3989 史建榮, 王裕中, 陳懷谷, 等油菜菌核病菌的生物學(xué)特性研究植物保護, 1999, 1: 6-810 方中達編著植病研究方法中國農(nóng)業(yè)出版社, 第三版 P46-4711 操海群, 岳永德, 彭鎮(zhèn)華, 等竹提取物的抗真菌作用植物保護學(xué)報, 2003, 30(1): 35-3912 鄭雯, 郭永霞, 辛惠普, 孫連軍春油菜菌核病藥劑防治試驗農(nóng)藥, 2000, 39(10): 29-3013 李宏科拮抗微生物的開發(fā)和利用世界農(nóng)業(yè), 1998(2)：28-30Identification and control of alfalfa sclerotinia stem rot occurred in south Jiangsu hilly areaZhang Wei1 Hu Yueg