大鼠急性腎臟缺血再灌注后處理動(dòng)物模型的建立

1、大鼠急性腎臟缺血再灌注后處理動(dòng)物模型的建立大鼠急性腎臟缺血再灌注后處理動(dòng)物模型的建立2008-5-9 12:22:52 作者：陳光磊，王漢民，劉廣厚，陳威，何麗潔，孫世仁，張鵬 【摘要】 目的：建立腎臟缺血后處理動(dòng)物模型. 方法：將40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、缺血再灌注組（IR組）和3個(gè)缺血后處理組（IPO1，IPO2，IPO3組），分別制作動(dòng)物模型. IR組在同時(shí)夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈45 min后恢復(fù)血供，IPO1，IPO2和IPO3組在腎缺血45 min后分別采用不同的后處理方法，其中IPO3組采用反復(fù)10次再灌注20 s-缺血20 s的后處理方法. 恢復(fù)血供24 h后留取各組大鼠靜脈血標(biāo)本及

2、腎組織，檢測(cè)腎功能指標(biāo)，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化并對(duì)腎小管損傷程度進(jìn)行評(píng)分. 結(jié)果：IPO3組血尿素氮為（27.93.2） mmol/L，血肌酐為（23249） mol/L，腎小管損傷程度評(píng)分為38248. 和IR組相比，IPO3組的血尿素氮、血肌酐及腎小管損傷程度評(píng)分均明顯降低（P0.05）. 結(jié)論：在急性腎臟缺血后，采用IPO3組的方法可以減輕急性腎臟缺血再灌注損傷，從而成功建立大鼠急性腎臟IRI的后處理動(dòng)物模型. 【關(guān)鍵詞】 缺血后處理0引言急性腎臟缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）是一種常見(jiàn)的臨床病理生理過(guò)程，多見(jiàn)于低血容量性休克、急性腎

3、動(dòng)脈阻斷以及腎臟移植等情況，可以造成急性腎衰竭或使移植腎功能延遲恢復(fù). 因此，如何有效防止因急性腎臟IRI而導(dǎo)致的各種急慢性腎臟疾病是一個(gè)亟待解決的問(wèn)題. 2000年，陶凌等在國(guó)內(nèi)首先證實(shí)了缺血后處理（ischemic postconditioning，IPO）對(duì)急性心肌缺血再灌注兔心臟具有保護(hù)作用，此后，更多研究者2-4把研究對(duì)象拓寬到不同物種和不同器官，建立了IPO動(dòng)物模型，并對(duì)IPO保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行了探討. 但是，腎臟IPO是否同樣具有對(duì)急性腎臟IRI的保護(hù)作用尚不清楚. 我們?cè)诖笫蠹毙阅I臟IRI模型基礎(chǔ)上，探討建立腎臟IPO大鼠模型的方法.1材料和方法1.1材料健康雌性SD大鼠40只，

4、體質(zhì)量（23610）g（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（軍2002005），標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，正常飲水，普通光照. 血尿素氮、血肌酐試劑盒（化學(xué)法）（南京建成生物工程研究所）；721分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）.1.2方法1.2.1動(dòng)物分組與模型制作將SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只. 缺血再灌注組（IR組）：參考Basile等5的方法進(jìn)行雙側(cè)腎臟缺血再灌注，建立缺血再灌注引起的急性腎衰竭的動(dòng)物模型. 將大鼠用30g/L戊巴比妥腹腔注射麻醉，去毛、固定，沿上腹部正中線逐層切開(kāi)皮膚、腹直肌及腹膜，先后在結(jié)腸脾區(qū)及結(jié)腸肝區(qū)位置暴露左、右腎，游

5、離左、右腎蒂，用玻璃分針小心分離出左、右腎動(dòng)脈，然后用血管夾同時(shí)將雙側(cè)腎動(dòng)脈夾閉，45 min后同時(shí)松開(kāi)雙側(cè)血管夾，恢復(fù)雙側(cè)腎臟血供. 缺血后處理1組（IPO1組）：各缺血后處理組的手術(shù)方法基本同IR組. 在缺血45 min后用血管夾同時(shí)給予雙側(cè)腎臟反復(fù)5次的恢復(fù)血供3 min-阻斷血供3 min處理（即缺血后處理），再恢復(fù)血供. 缺血后處理2組（IPO2組）：在缺血45 min后用血管夾同時(shí)給予雙側(cè)腎臟反復(fù)5次的恢復(fù)血供20 s-阻斷血供20 s處理，再恢復(fù)血供. 缺血后處理3組（IPO3組）：在缺血45 min后用血管夾同時(shí)給予雙側(cè)腎臟反復(fù)10次的恢復(fù)血供20 s-阻斷血供20 s處理，再

6、恢復(fù)血供. 對(duì)照組（S組）：手術(shù)方法基本同IR組，但僅分離出大鼠雙側(cè)腎動(dòng)脈，不進(jìn)行夾閉.1.2.2標(biāo)本留取在末次恢復(fù)腎臟血供24 h后將大鼠用30 g/L戊巴比妥腹腔注射麻醉，固定，分離下腔靜脈，用注射器采血23 mL，用于血液生化指標(biāo)檢查；然后用冰生理鹽水經(jīng)腎動(dòng)脈對(duì)腎臟進(jìn)行灌注直至腎臟發(fā)白，取下雙腎，留取部分組織做光鏡檢查.1.2.3指標(biāo)觀察腎功能：采用化學(xué)比色法檢測(cè)血尿素氮及血肌酐. 腎臟組織形態(tài)學(xué)：部分腎組織用100 mL/L甲醛固定，常規(guī)脫水、包埋、切片后，行HE和PAS染色，光鏡下觀察形態(tài)，參考Paller等6的方法進(jìn)行評(píng)分，每只大鼠腎組織隨機(jī)選擇10個(gè)無(wú)重疊視野（200），每個(gè)視野

7、下隨機(jī)選擇10處腎小管，共按100個(gè)腎小管計(jì)分，分?jǐn)?shù)越高表示腎小管損傷程度越嚴(yán)重.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：所得數(shù)據(jù)采用xs表示，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析（ANOVA），多組之間的兩兩比較采用LSDt檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1血尿素氮及肌酐與S組相比， IR， IPO1， IPO2， IPO3組的血尿素氮及血肌酐均顯著增高（P0.05），IPO3組的血尿素氮和血肌酐均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01，表1）.表1各組SD大鼠血尿素氮、血肌酐及腎小管損傷程度評(píng)分的比較（略）2.2腎臟組織形態(tài)學(xué)的變化2.2.1腎小管損傷程度的評(píng)分與

8、S組相比，IR，IPO1，IPO2，IPO3組的腎小管損傷程度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）. 與IR組相比，IPO1組的腎小管損傷程度更重（P0.05），IPO3組的腎小管損傷程度明顯減輕（P0.01，表1）.2.2.2腎臟組織形態(tài)學(xué)改變?cè)诠忡R下S組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常，腎小管、腎間質(zhì)未見(jiàn)明顯病理改變（圖1A）. 經(jīng)過(guò)再灌注24 h后，IR組大鼠腎組織中可見(jiàn)間質(zhì)水腫，腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣消失，大量上皮細(xì)胞脫落、壞死，基底膜裸露，管腔明顯擴(kuò)張，管腔內(nèi)可見(jiàn)大量管型（圖1B）. IPO3組大鼠腎組織中可見(jiàn)間質(zhì)輕度水腫，腎小管上皮細(xì)胞扁平，部分刷狀緣脫落消失，部分管腔擴(kuò)張，可見(jiàn)少量管型，相對(duì)IR組病理

9、改變明顯減輕（圖1C）.圖1各組SD大鼠腎臟形態(tài)學(xué)改變PAS 200略3討論1986年，Murry等7發(fā)現(xiàn)在急性缺血再灌注出現(xiàn)之前對(duì)心臟進(jìn)行反復(fù)多次的短暫缺血再灌注（即缺血預(yù)處理）可以減輕心臟的IRI，此后，Islam等8證實(shí)了預(yù)處理對(duì)腎臟急性IRI同樣有保護(hù)作用. 然而在臨床中，如果一旦發(fā)生IRI，則預(yù)處理難以實(shí)施，因此，研究在缺血后對(duì)再灌注進(jìn)行處理更具有實(shí)用價(jià)值. 2000年，我國(guó)學(xué)者首先證實(shí)了IPO對(duì)急性心肌IRI具有保護(hù)作用，此后，Zhao等和Kin等9的研究分別證明了IPO可以減輕犬和大鼠心臟IRI. 不僅在心臟，隨后的一些研究針對(duì)肝臟3、腦4等組織進(jìn)行IPO，證實(shí)對(duì)其相應(yīng)器官的IR

10、I也可產(chǎn)生保護(hù)作用，并對(duì)保護(hù)作用機(jī)制進(jìn)行了探討. 但是，以往的國(guó)內(nèi)外眾多研究并未涉及到腎臟器官，而且針對(duì)大鼠心臟等器官的研究中，單次后處理的時(shí)間和后處理的循環(huán)次數(shù)也不盡相同10，因此，在開(kāi)展針對(duì)腎臟IPO作用效果及作用機(jī)制的研究之前，首先需要建立成功的大鼠腎臟IPO模型. 在國(guó)外許多大鼠缺血再灌注的急性腎衰模型研究5, 11中，都將腎臟缺血時(shí)間限定在45 min，我們?cè)诒狙芯恐型瑯訉⑷毖獣r(shí)間限定在45 min，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)成功復(fù)制了大鼠急性腎臟IRI模型. Yang等12通過(guò)對(duì)研究發(fā)現(xiàn)，如果在開(kāi)始再灌注10 min后再進(jìn)行后處理將喪失對(duì)IRI的保護(hù)作用，更多的研究9,13發(fā)現(xiàn)，如果在開(kāi)始再灌注1

11、 min之后再進(jìn)行后處理，同樣會(huì)使其對(duì)心肌IRI的保護(hù)作用喪失. 最近，Tang等10的研究顯示，不同的后處理循環(huán)次數(shù)和心肌梗死面積有關(guān)，單次后處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、后處理循環(huán)次數(shù)過(guò)少都有可能限制其心肌保護(hù)作用的發(fā)揮. 因此，我們?cè)诔晒?fù)制了大鼠急性腎臟IRI模型的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)針對(duì)單次后處理的時(shí)間和后處理的循環(huán)次數(shù)進(jìn)行了研究，以期成功建立大鼠急性腎臟IRI的后處理動(dòng)物模型. 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中對(duì)大鼠腎臟缺血后采用了3種不同的后處理方式，從功能學(xué)和形態(tài)學(xué)角度對(duì)后處理的效果進(jìn)行了分析，以便選擇合適的腎臟缺血后處理動(dòng)物模型. 結(jié)果顯示，相對(duì)于IR組，采用反復(fù)5次恢復(fù)血供3 min-阻斷血供3 min的后處理（IP

12、O1組）并不能減輕急性腎臟IRI，反而可能加重?fù)p傷；采用反復(fù)5次恢復(fù)血供20 s-阻斷血供20 s的后處理（IPO2組）能使腎功能指標(biāo)改善，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 而采用反復(fù)10次恢復(fù)血供20 s-阻斷血供20 s的后處理組（IPO3組）和IR組相比，腎功能指標(biāo)明顯改善，腎組織中未見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞脫落和基底膜裸露，間質(zhì)水腫、刷狀緣消失、管腔擴(kuò)張、管型等改變也較IR組輕，對(duì)腎小管損傷程度評(píng)分的分析同樣支持上述結(jié)果. 綜上所述，在急性腎臟缺血后及時(shí)采取反復(fù)10次的短暫（恢復(fù)血供20 s-阻斷血供20 s）后處理，可以減輕急性腎臟IRI，從而成功建立大鼠急性腎臟IRI的后處理動(dòng)物模型，為進(jìn)一步研究IPO對(duì)

13、大鼠腎臟的保護(hù)作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】 陶凌, 李源, 高峰,等. 缺血后處理對(duì)急性心肌缺血再灌注兔心臟的保護(hù)作用J. 第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào), 2000, 21(6): S116-S118. Zhao ZQ, Corvera JS, Halkos ME, et al. Inhibition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion: comparison with ischemic preconditioningJ. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2003, 285(2):H579-H588.3 Sun K, Liu ZS, Sun Q. Role of mitochondria