分子生物學(xué)常見試題

1、分子生物學(xué)常見試題一, 名詞解釋1, 基因:能夠表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)和RNA的DNA序列,是決定遺傳性狀的功能單位.2, 基因組:細(xì)胞或生物體的一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和.3, 端粒:以線性染色體形式存在的真核基因組DNA末端都有一種特殊的結(jié)構(gòu)叫端粒.該結(jié)構(gòu) 是一段DNA序列和蛋白質(zhì)形成的一種復(fù)合體,僅在真核細(xì)胞染色體末端存在.4, 操縱子:是指數(shù)個功能上相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因串聯(lián)在一起,構(gòu)成信息區(qū),連同其上游的調(diào)控區(qū)(包括啟動子和操縱基因以及下游的轉(zhuǎn)錄終止信號所構(gòu)成的基因表達(dá)單位,所轉(zhuǎn)錄的RNA為多順反子.5, 順式作用元件:是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān),能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識別和結(jié)合的特異D

2、NA序列.包括啟動子,上游啟動子元件,增強(qiáng)子,加尾信號和一些反應(yīng)元件等.6, 反式作用因子:是指真核細(xì)胞內(nèi)含有的大量可以通過直接或間接結(jié)合順式作用元件而調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的蛋白質(zhì)因子.7, 啟動子:是RNA聚合酶特異性識別和結(jié)合的DNA序列.8, 增強(qiáng)子:位于真核基因中遠(yuǎn)離轉(zhuǎn)錄起始點,能明顯增強(qiáng)啟動子轉(zhuǎn)錄效率的特殊DNA序列. 它可位于被增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄基因的上游或下游,也可相距靶基因較遠(yuǎn).9, 基因表達(dá):是指生物基因組中結(jié)構(gòu)基因所攜帶的遺傳信息經(jīng)過轉(zhuǎn)錄,翻譯等一系列過程, 合成特定的蛋白質(zhì),進(jìn)而發(fā)揮其特定的生物學(xué)功能和生物學(xué)效應(yīng)的全過程.10, 信息分子:調(diào)節(jié)細(xì)胞生命活動的化學(xué)物質(zhì).其中由細(xì)胞分泌的

3、調(diào)節(jié)靶細(xì)胞生命活動的化學(xué)物質(zhì)稱為細(xì)胞間信息分子;而在細(xì)胞內(nèi)傳遞信息調(diào)控信號的化學(xué)物質(zhì)稱為細(xì)胞內(nèi)信息分子. 11, 受體:是存在于靶細(xì)胞膜上或細(xì)胞內(nèi)能特異識別生物活性分子并與之結(jié)合,進(jìn)而發(fā)生生物學(xué)效應(yīng)的的特殊蛋白質(zhì).12, 分子克隆:在體外對DNA分子按照即定目的和方案進(jìn)行人工重組,將重組分子導(dǎo)入合適宿主,使其在宿主中擴(kuò)增和繁殖,以獲得該DNA分子的大量拷貝.13, 蛋白激酶:是指能夠?qū)⒘姿峒瘓F(tuán)從磷酸供體分子轉(zhuǎn)移到底物蛋白的氨基酸受體上的一大類酶.14, 蛋白磷酸酶:是具有催化已經(jīng)磷酸化的蛋白質(zhì)分子發(fā)生去磷酸化反應(yīng)的一類酶分子,與蛋白激酶相對應(yīng)存在,共同構(gòu)成了磷酸化和去磷酸化這一重要的蛋白質(zhì)活性

4、的開關(guān)系統(tǒng).15, 基因工程:有目的的通過分子克隆技術(shù),人為的操作改造基因,改變生物遺傳性狀的系列過程.16, 載體:能在連接酶的作用下和外源DN*段連接并運(yùn)送DNA分子進(jìn)入受體細(xì)胞的DNA分子.17, 轉(zhuǎn)化:指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程.18, 感染:以噬菌體,粘性質(zhì)粒和真核細(xì)胞病毒為載體的重組DNA分子,在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒,才能感染適當(dāng)?shù)募?xì)胞,并在細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增.19, 轉(zhuǎn)導(dǎo):指以噬菌體為載體,在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移DNA的過程,有時也指在真核細(xì)胞之間通過逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移和獲得細(xì)胞DNA的過程.20, 轉(zhuǎn)染:指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞

5、的過程.21, DNA變性:在物理或化學(xué)因素的作用下,導(dǎo)致兩條DNA鏈之間的氫鍵斷裂,而核酸分子中的所有共價鍵則不受影響.22, DNA復(fù)性:當(dāng)促使變性的因素解除后,兩條DNA鏈又可以通過堿基互補(bǔ)配對結(jié)合形成DNA雙螺旋結(jié)構(gòu).23, 退火:指將溫度降至引物的TM值左右或以下,引物與DNA摸板互補(bǔ)區(qū)域結(jié)合形成雜交鏈.24, 筑巢PCR:先用一對外側(cè)引物擴(kuò)增含目的基因的大片段,再用內(nèi)側(cè)引物以大片段為摸板擴(kuò)增獲取目的基因.可以提高PCR的效率和特異性.25, 原位PCR:以組織固定處理細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA作為靶序列,進(jìn)行PCR反應(yīng)的過程.26, 定量PCR:基因表達(dá)涉及的轉(zhuǎn)錄水平的研究常需要對mR

6、NA進(jìn)行定量測定,對此采用的PCR技術(shù)就叫定量PCR.27, 基因打靶:是指通過DNA定點同源重組,改變基因組中的某一特定基因,從而在生物活體內(nèi)研究此基因的功能.28, DNA芯片NA芯片技術(shù)是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接將大量的DNA探針以顯微打印的方式有序地固化于支持物表面,然后與標(biāo)記的樣品雜交,通過對雜交信號的檢測析,即可獲得樣品的遺傳信息.由于常用計算機(jī)硅芯片作為固相支持物,所以稱為DNA芯片. 29, 錯義突變:DNA分子中堿基對的取代,使得mRNA的某一密碼子發(fā)生變化,由它所編碼的氨基酸就變成另一種的氨基酸,使得多肽鏈中的氨基酸順序也相應(yīng)的發(fā)生改變的突變. 30, 無義

7、突變:由于堿基對的取代,使原來可以翻譯某種氨基酸的密碼子變成了終止密碼子的突變.31, 同義突變:堿基對的取代并不都是引起錯義突變和翻譯終止,有時雖然有堿基被取代,但在蛋白質(zhì)水平上沒有引起變化,氨基酸沒有被取代,這是因為突變后的密碼子和原來的密碼子代表同一個氨基酸的突變.32, 移碼突變:在編碼序列中,單個堿基,數(shù)個堿基的缺失或插入以及片段的缺失或插入等均可以使突變位點之后的三聯(lián)體密碼閱讀框發(fā)生改變,不能編碼原來的蛋白質(zhì)的突變.33, 癌基因:是細(xì)胞內(nèi)控制細(xì)胞生長的基因,具有潛在的誘導(dǎo)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的特性.當(dāng)癌基因結(jié)構(gòu)或表達(dá)發(fā)生異常時,其產(chǎn)物可使細(xì)胞無限制增殖,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生.包括病毒癌基因和細(xì)

8、胞癌基因.34, 細(xì)胞癌基因:存在于正常的細(xì)胞基因組中,與病毒癌基因有同源序列,具有促進(jìn)正常細(xì)胞生長,增殖,分化和發(fā)育等生理功能.在正常細(xì)胞內(nèi)未激活的細(xì)胞癌基因叫原癌基因,當(dāng)其受到某些條件激活時,結(jié)構(gòu)和表達(dá)發(fā)生異常,能使細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化.35, 病毒癌基因:存在于病毒(大多是逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組中能使靶細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的基因. 它不編碼病毒結(jié)構(gòu)成分,對病毒無復(fù)制作用,但是當(dāng)受到外界的條件激活時可產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的作用.36, 基因診斷:以DNA或RNA為診斷材料,通過檢查基因的存在,結(jié)構(gòu)缺陷或表達(dá)異常,對人體的狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過程.37, RFLP:即限制性片段長度多態(tài)性,個體之間DNA

9、的核苷酸序列存在差異,稱為DNA多態(tài)性.若因此而改變了限制性內(nèi)切酶的酶切位點則可導(dǎo)致相應(yīng)的限制性片段的長度和數(shù)量發(fā)生變化,稱為RFLP.38, 基因治療:一般是指將限定的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入患者特定的靶細(xì)胞,以最終達(dá)到預(yù)防或改變特殊疾病狀態(tài)為目的治療方法.39, 反義RNA:堿基序列正好與有意義的mRNA互補(bǔ)的RNA稱為反義RNA.可以作為一種調(diào)控特定基因表達(dá)的手段.40, 核酶:是一種可以催化RNA切割和RNA剪接反應(yīng)的由RNA組成的酶,可以作為基因表達(dá)和病毒復(fù)制的抑制劑.41, 三鏈DNA:當(dāng)某一DNA或RNA寡核苷酸與DNA高嘌呤區(qū)可結(jié)合形成三鏈,能特異地結(jié)合在DNA的大溝中,并與富含嘌呤鏈上的

10、堿基形成氫鍵.42, SSCP:單鏈構(gòu)象多態(tài)性檢測是一種基于DNA構(gòu)象差別來檢測點突變的方法.相同長度的單鏈DNA,如果堿基序列不同,形成的構(gòu)象就不同,這樣就形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性.43, 管家基因:在生物體生命的全過程都是必須的,且在一個生物個體的幾乎所有細(xì)胞中持續(xù)表達(dá)的基因.44, 細(xì)胞全能性:指同一種生物的所有細(xì)胞都含有相同的DNA,即基因的數(shù)目和種類是一樣的,但在不同階段,同一個體的不同組織和器官中基因表達(dá)的種類和數(shù)目是不同的.45, SD序列:轉(zhuǎn)錄出的mRNA要進(jìn)入核糖體上進(jìn)行翻譯,需要一段富含嘌呤的核苷酸序列與大腸桿菌16S rRNA3,末端富含嘧啶的序列互補(bǔ),是核糖體的識別位點.4

11、6, 反義核酸技術(shù):是通過合成一種短鏈且與DNA或RNA互補(bǔ)的,以DNA或RNA為目標(biāo)抑制翻譯的反義分子,干擾目的基因的轉(zhuǎn)錄,剪接,轉(zhuǎn)運(yùn),翻譯等過程的技術(shù).47, 核酸探針:探針是指能與某種大分子發(fā)生特異性相互作用,并在相互作用之后可以檢測出來的生物大分子.核酸探針是指能識別特異堿基順序的帶有標(biāo)記的一段DNA或RNA分子. 48, 周期蛋白:是一類呈細(xì)胞周期特異性或時相性表達(dá),累積與分解的蛋白質(zhì),它與周期素依賴性激酶共同影響細(xì)胞周期的運(yùn)行.49, CAP:是大腸桿菌分解代謝物基因活化蛋白,這種蛋白可將葡萄糖饑餓信號傳遞個許多操縱子,使細(xì)菌在缺乏葡萄糖時可以利用其他碳源.50, 順反子51, 結(jié)

12、構(gòu)域二, 問答題(一,病毒,原核,真核基因組的特點答:1,病毒基因組的特點:種類單一;單倍體基因組:每個基因組在病毒中只出現(xiàn)一次;形式多樣;大小不一;基因重疊;動物/細(xì)菌病毒與真核/原核基因相似:內(nèi)含子;具有不規(guī)則的結(jié)構(gòu)基因;基因編碼區(qū)無間隔:通過宿主及病毒本身酶切;無帽狀結(jié)構(gòu);結(jié)構(gòu)基因沒有翻譯起始序列.2,原核基因組的特點:為一條環(huán)狀雙鏈DNA;只有一個復(fù)制起點;具有操縱子結(jié)構(gòu);絕大部分為單拷貝;可表達(dá)基因約50%,大于真核生物小于病毒;基因一般是連續(xù)的,無內(nèi)含子;重復(fù)序列很少. 3,真核基因組的特點:真核生物基因組遠(yuǎn)大于原核生物基因組,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,基因數(shù)龐大,具有多個復(fù)制起點;基因組DNA與

13、蛋白質(zhì)結(jié)合成染色體,儲存于細(xì)胞核內(nèi);真核基因為單順反子,而細(xì)菌和病毒的結(jié)構(gòu)基因多為多順反子;基因組中非編碼區(qū)多于編碼區(qū);真核基因多為不連續(xù)的斷裂基因,由外顯子和內(nèi)含子鑲嵌而成;存在大量的重復(fù)序列;功能相關(guān)的基因構(gòu)成各種基因家族;存在可移遺傳因素;體細(xì)胞為雙倍體,而精子和卵子為單倍體.(二,乳糖操縱子的作用機(jī)制答:1,乳糖操縱子的組成:大腸桿菌乳糖操縱子含Z,Y,A三個結(jié)構(gòu)基因,分別編碼半乳糖苷酶, 透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶,此外還有一個操縱序列O,一個啟動子P和一個調(diào)節(jié)基因I.2,阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié):沒有乳糖存在時,I基因編碼的阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列O處,乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài),不能合成分解乳

14、糖的三種酶;有乳糖存在時,乳糖作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變構(gòu),不能結(jié)合于操縱序列,乳糖操縱子被誘導(dǎo)開放合成分解乳糖的三種酶.所以,乳糖操縱子的這種調(diào)控機(jī)制為可誘導(dǎo)的負(fù)調(diào)控.3,CAP的正性調(diào)節(jié):在啟動子上游有CAP結(jié)合位點,當(dāng)大腸桿菌從以葡萄糖為碳源的環(huán)境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚吹沫h(huán)境時,cAMP濃度升高,與CAP結(jié)合,使CAP發(fā)生變構(gòu),CAP結(jié)合于乳糖操縱子啟動序列附近的CAP結(jié)合位點,激活RNA聚合酶活性,促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄,調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后促進(jìn)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄,對乳糖操縱子實行正調(diào)控,加速合成分解乳糖的三種酶.4,協(xié)調(diào)調(diào)節(jié):乳糖操縱子中的I基因編碼的阻遏蛋白的負(fù)調(diào)控與CAP的正調(diào)控兩種機(jī)制,互相

15、協(xié)調(diào),互相制約.(三,真核生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制答:真核生物在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控主要是通過反式作用因子,順式作用元件和RNA聚合酶的相互作用來完成的,主要是反式作用因子結(jié)合順式作用元件后影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過程.1, 轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成:真核生物RNA聚合酶識別的是由通用轉(zhuǎn)錄因子與DNA形成的蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物,只有當(dāng)一個或多個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到DNA上,形成有功能的啟動子,才能被RNA 聚合酶所識別并結(jié)合.轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成過程為:TFD結(jié)合TATA盒;RNA聚合酶識別并結(jié)合TFD-DNA復(fù)合物形成一個閉合的復(fù)合物;其他轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶結(jié)合形成一個開放復(fù)合物.在這個過程中,反式作用因

16、子的作用是:促進(jìn)或抑制TFD與TATA盒結(jié)合;促進(jìn)或抑制RNA聚合酶與TFD-DNA復(fù)合物的結(jié)合;促進(jìn)或抑制轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成.2, 反式作用因子:一般具有三個功能域(DNA識別結(jié)合域,轉(zhuǎn)錄活性域和結(jié)合其他蛋白結(jié)合域;能識別并結(jié)合上游調(diào)控區(qū)中的順式作用元件;對基因的表達(dá)有正性或負(fù)性調(diào)控作用.3, 轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控:反式作用因子的活性調(diào)節(jié):表達(dá)式調(diào)節(jié)反式作用因子合成出來就具有活性;共價修飾磷酸化和去磷酸化,糖基化;配體結(jié)合許多激素受體是反式作用因子;蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)復(fù)合物的解離與形成.反式作用因子與順式作用元件的結(jié)合:反式作用因子被激活后,即可識別并結(jié)合上游啟動子元件和增強(qiáng)子

17、中的保守性序列,對基因轉(zhuǎn)錄起調(diào)節(jié)作用.反式作用因子的作用方式成環(huán),扭曲,滑動,Oozing.反式作用因子的組合式調(diào)控作用:每一種反式作用因子結(jié)合順式作用元件后雖然可以發(fā)揮抑制作用,但反式作用因子對基因調(diào)控不是由單一因子完成的而是幾種因子組合發(fā)揮特定的作用.(四,真核生物轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控機(jī)制答1,5,端加帽和3,端多聚腺苷酸化的調(diào)控意義:5,端加帽和3,端多聚腺苷酸化是保持mRNA 穩(wěn)定的一個重要因素,它至少保證mRNA在轉(zhuǎn)錄過程中不被降解.(2,mRNA選擇性剪接對基因表達(dá)調(diào)控的作用(3,mRNA運(yùn)輸?shù)目刂?五,受體的特點答:1,高度專一性;2,高度親和性;3,可逆性;4,可飽和性;5,特定的

18、作用模式(六,表皮生長因子介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑答:表皮生長因子受體是一個典型的蛋白酪氨酸激酶受體,這個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要步驟是: 1, 受體二聚化的形成及其磷酸化:表皮生長因子與受體的結(jié)合使受體發(fā)生二聚化,從而改變受體構(gòu)象,使蛋白酪氨酸激酶活性增強(qiáng),受體自身的幾個蛋白酪氨酸殘基在激酶的作用下發(fā)生磷酸化.2, 募集接頭蛋白Grb2:表皮生長因子受體自身被磷酸化后,不僅其激酶活性增強(qiáng),而且其構(gòu)象發(fā)生變化,從而適合與含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白分子相結(jié)合.Grb2是作為接頭蛋白結(jié)合到受體上.3, 調(diào)控分子SOS的活化:SOS含有可與SH3結(jié)構(gòu)域相結(jié)合的富含脯氨酸基序,當(dāng)Grb2結(jié)合到磷酸化的表皮生長因子受體后

19、,它的兩個SH3結(jié)構(gòu)域即可結(jié)合SOS,使之活化.4, 低分子量G蛋白Ras的活化:SOS可促進(jìn)Ras釋放GDP,結(jié)合GTP的反應(yīng),使Ras激活.活化的Ras作用其下游分子Raf,使之活化.Raf是MAPK級聯(lián)反應(yīng)的第一個分子,由此啟動了MAPK的三級激活過程.5, MAPK的級聯(lián)激活:Raf是一種MAPKKK,它作用于MEK,使之磷酸化而激活,活化的MEK在作用于MAPK家族的ERK1,使之磷酸化激活由此完成了三級激活.6, 轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化及轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用:活化的ERK可以轉(zhuǎn)至細(xì)胞核內(nèi),使某些轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子發(fā)生磷酸化,從而影響基因的轉(zhuǎn)錄.(七,cAMP信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑答:1,組成:胞外信息分子(主要

20、是胰高血糖素,腎上腺素和促腎上腺皮質(zhì)激素,受體,G蛋白, AC,cAMP , PKA.2,途徑:信號分子與受體結(jié)合,引起受體構(gòu)象變化受體活化G蛋白活化后的G蛋白激活腺苷酸環(huán)化酶(ACAC 催化ATP生成cAMPcAMP 活化PKA,PKA使目標(biāo)蛋白磷酸化,調(diào)節(jié)代謝酶的活性或調(diào)節(jié)基因的表達(dá)(八,IP3-Ca2+信號途徑:信號分子與受體結(jié)合,引起受體構(gòu)象變化受體活化G蛋白活化后的G蛋白激活PLCPLC 水解PIP2生成IP3 和DGIP3 使鈣通道打開,細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高Ca2+ 與CaM結(jié)合,激活Ca2+-CaM依賴的蛋白激酶Ca2+ -CaM依賴的蛋白激酶使目標(biāo)蛋白磷酸化.(九,分子克隆中常用

21、的工具酶及良好載體的條件答:(1,常用的工具酶1, 限制性核酸內(nèi)切酶:是細(xì)菌產(chǎn)生的一類能識別和切割雙鏈DNA分子內(nèi)特定的堿基順序的核酸水解酶.2, DNA連接酶:將兩段DNA分子拼接起來的酶.3, DNA聚合酶:催化單核苷酸鏈延伸.4, 逆轉(zhuǎn)錄酶:依賴于RNA的DNA聚合酶,這是一種有效的轉(zhuǎn)錄RNA成為DNA的酶,產(chǎn)物DNA又稱互補(bǔ)DNA.5, 末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶:將脫氧核糖核酸加到DNA的3末端.6, 堿性磷酸酶:催化去除DNA,RNA等的5磷酸基團(tuán).7, 依賴DNA的RNA聚合酶:識別特異性啟動子,RNA轉(zhuǎn)錄.(2,良好載體的條件1,必須有自身的復(fù)制子;2,載體分子上必須有限制性核酸內(nèi)

22、切酶的酶切位點,即多克隆位點,以供外源DNA插入;3,載體應(yīng)具有可供選擇的遺傳標(biāo)志,以區(qū)別陽性重組子和陰性重組子;4,載體分子必須有足夠的容量;5,可通過特定的方法導(dǎo)入細(xì)胞;6,對于表達(dá)載體還應(yīng)具備與宿主細(xì)胞相適應(yīng)的啟動子,前導(dǎo)順序,增強(qiáng)子,加尾信號等DNA調(diào)控元件.(十,藍(lán)-白篩選的原理答:某些質(zhì)粒帶有大腸桿菌的半乳糖苷酶基因片段,在半乳糖苷酶基因的基因區(qū)外又另外引入了一段含多種單一限制酶位點的DNA序列.這些位點上如果沒有克隆外源性DN*段,在質(zhì)粒被導(dǎo)入lac-的大腸桿菌后,質(zhì)粒攜帶的半乳糖苷酶基因?qū)⒄１磉_(dá),與大腸桿菌的半乳糖苷酶基因互補(bǔ),產(chǎn)生有活性的半乳糖苷酶,加入人工底物X-gal和

23、誘導(dǎo)劑IPTG后,出現(xiàn)藍(lán)色的菌落.如果在多克隆位點上插入外源DN*段,將使lac Z基因滅活,不能生成半乳糖苷酶,結(jié)果菌落出現(xiàn)白色.由于這種顏色標(biāo)志,重組克隆和非重組克隆的區(qū)分一目了然.(十一SANGER雙脫氧鏈終止法的原理答:DNA鏈中核苷酸以3',5'-磷酸二酯鍵連接,合成DNA所用的底物是 2'-脫氧核苷三磷酸. 2',3'ddNTP與普通dNTP不同,它們在脫氧核糖的3'位置缺少一個羥基.在DNA聚合酶作用下通過三磷酸基團(tuán)摻入到延伸的DNA鏈中,但由于沒有3'羥基,不能同后續(xù)的dNTP形成磷酸二酯鍵,因此,正在延伸的DNA鏈不能繼

24、續(xù)延伸.在DNA合成反應(yīng)混合物的4種普通dNTP中加入少量的一種ddNTP,鏈延伸將與偶然發(fā)生但卻十分特異的鏈終止競爭,產(chǎn)物是一系列的核苷酸鏈,其長度取決于引物末端到出現(xiàn)過早鏈終止位置間的距離.在4組獨立酶反應(yīng)中分別采用4種不同的ddNTP,結(jié)果將產(chǎn)生4組寡核苷酸,它們將分別終止于模板鏈的A,C,G或T位置.(十二,核酸分子雜交的原理答:具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定的條件下(適宜的溫度及離子強(qiáng)度等堿基互補(bǔ)配對結(jié)合,重新形成雙鏈;在這一過程中,核酸分子經(jīng)歷了變性和復(fù)性的變化,以及在復(fù)性過程中個分子間鍵的形成和斷裂.雜交的雙方是待測核酸和已知序列.(十三,影響雜交的因素答:1,核酸分子的濃

25、度和長度:核酸濃度越大,復(fù)性速度越快.探針長度應(yīng)控制在50-300個堿基對為好.2,溫度:溫度過高不利于復(fù)性,而溫度過低,少數(shù)堿基配對形成的局部雙鏈不易解離,適宜的溫度是較TM值低25度.3,離子強(qiáng)度:在低離子強(qiáng)度下,核酸雜交非常緩慢,隨著離子強(qiáng)度的增加,雜交反應(yīng)率增加.高濃度的鹽使堿基錯配的雜交體更穩(wěn)定,所以進(jìn)行序列不完全同源的核酸分子雜交時必須維持雜交反應(yīng)液中的鹽濃度和洗膜液中的鹽濃度.4,雜交液中的甲酰胺:甲酰胺能降低核酸雜交的TM值.它有以下優(yōu)點:在低溫下探針更穩(wěn)定;能更好地保留非共價結(jié)合的核酸.5,核酸分子的復(fù)雜性:是指存在于反應(yīng)體系中的不同順序的總長度.兩個不同基因組DNA變性后的

26、相對雜交速率取決于樣品濃度絕對一致時的相對復(fù)雜性(即DNA中的堿基數(shù).6,非特異性雜交反應(yīng):在雜交前應(yīng)對非特異性雜交反應(yīng)位點進(jìn)行封閉,以減少其對探針的非特異性吸附作用.(十四,探針的種類和優(yōu)缺點2,基因組探針:從基因組文庫里篩選得到一個特定的基因或基因片段的克隆后,大量擴(kuò)增,純化,切取插入片段,分離純化為探針.3,寡核苷酸探針:根據(jù)已知的核酸順序,采用DNA合成儀合成一定長度的寡核苷酸片段作為探針.4,RNA探針:采用基因克隆和體外轉(zhuǎn)錄的方法可以得到RNA或反義RNA作為探針.(十五,探針的標(biāo)記法答:1,缺口平移法:此法是利用適當(dāng)濃度的DNase 在DNA雙鏈上隨機(jī)切割單鏈,造成單鏈切口.切口

27、處產(chǎn)生一個5末端和3末端,3末端就可以作為引物,在大腸桿菌DNA聚合酶的催化下,以互補(bǔ)的DNA單鏈為摸板,依次將dNTP連接到切口的3末端的羥基上,合成新的DNA單鏈;同時DNA聚合酶的53的核酸外切酶活性在切口處將舊鏈從5末端逐步切除,新合成鏈不斷延伸,從而使原DNA分子上的部分核苷酸殘基被標(biāo)記的核苷酸所取代.2,隨機(jī)引物法:隨機(jī)引物是人工合成的長度為6個寡核苷酸殘基的寡聚核苷酸片段的混合物.對于任何一個用作探針的DN*段,隨機(jī)引物混合物中都會有一些六核苷酸片段可以與之結(jié)合,起到DNA合成引物的作用.將這些引物與變性的DNA單鏈結(jié)合后,以4種dNTP(其中一種是標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP為底物,合

28、成與探針DNA互補(bǔ)的切帶有標(biāo)記物的DNA探針.3,PCR標(biāo)記法:在PCR反應(yīng)底物中,將一種dNTP換成標(biāo)記物標(biāo)記的dNTP, 這樣標(biāo)記的dNTP就在PCR反應(yīng)的同時摻入到新合成的DNA鏈上.4,末端標(biāo)記法:只是將DN*段的一端進(jìn)行標(biāo)記.(十六,PCR的基本原理答CR是在試管中進(jìn)行的DNA復(fù)制反應(yīng),基本原理是依據(jù)細(xì)胞內(nèi)DNA半保留復(fù)制的機(jī)理,以及體外DNA分子于不同溫度下雙鏈和單鏈可以互相轉(zhuǎn)變的性質(zhì),人為地控制體外合成系統(tǒng)的溫度,以要重復(fù)進(jìn)行DNA模板解鏈,引物與模板DNA結(jié)合,DNA聚合酶催化新生DNA的合成,即高溫變性,低溫退火,中溫延伸3個步驟構(gòu)成PCR反應(yīng)的一個循環(huán),此循環(huán)的反復(fù)進(jìn)行,就

29、可使目的DNA得以迅速擴(kuò)增.DNA模板變性:模板雙鏈DNA 單鏈DNA,94.退火:引物+單鏈DNA 雜交鏈,引物的Tm值.引物的延伸:溫度至70 左右, Taq DNA聚合酶以4種dNTP為原料,以目的DNA為模板,催化以引物3'末端為起點的5'3'DNA鏈延伸反應(yīng),形成新生DNA鏈.新合成的引物延伸鏈經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板PCR,就是如此反復(fù)循環(huán),使目的DNA得到高效快速擴(kuò)增.(十七,PCR引物設(shè)計的基本要求答:1,引物長度一般為1530個核苷酸.過短影響PCR的特異性,過長會提高相應(yīng)退火溫度,使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶最適溫度74,影響產(chǎn)物的

30、生成.3,引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu).引物的連續(xù)互補(bǔ)序列,一般不超過3bp.4,兩個引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,尤其應(yīng)避免3'端的互補(bǔ)重疊.5,引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不超過70%,引物3'末端連續(xù)8個堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列,否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增.6,引物3'端堿基是引發(fā)延伸的起點,因此一定要與模板DNA配對.引物3'端最佳堿基選擇是G 和C,形成的堿基配對比較穩(wěn)定.7,引物與模板結(jié)合時,引物的5'端最多可以游離十幾個堿基而不影響PCR反應(yīng)的進(jìn)行.8,引物的5'端可以修飾,如附加限制酶位點,引入突變位點,用

31、生物素,熒光物質(zhì),地高辛標(biāo)記,加入其它短序列包括起始密碼子,終止密碼子等.(十八,PCR的反應(yīng)條件答:1,PCR反應(yīng)的緩沖液:Tris -HCl緩沖液KCl 促進(jìn)引物的退火,濃度太高時會抑制Taq DNA聚合酶活性.加入BSA或明膠有利于保護(hù)TaqDNA聚合酶活性.必要時加入適量二甲基亞砜(DMSO或甲酰胺利于破壞模板二級結(jié)構(gòu),提高PCR反應(yīng)特異性.2,鎂離子濃度一般用量1.5-2.0 mmol/L,Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+.Mg 2+濃度過低,會顯著降低酶活性.Mg 2+濃度過高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng).Mg 2+濃度還會影響引物的退火,模板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度,從而影響擴(kuò)

32、增片段的產(chǎn)率.3,底物濃度工作濃度20-200umol/L, dNTPs濃度過高可加快反應(yīng)速度,也增加堿基的錯配率和實驗成本.降低濃度會導(dǎo)致反應(yīng)速度下降,可提高反應(yīng)的特異性.在PCR反應(yīng)中,4種dNTP必須以等摩爾濃度配制,以減少PCR反應(yīng)的錯配誤差并提高使用效率.4,Taq DNA聚合酶 75-80時具有最高的聚合酶活性,150個核苷酸/秒;具有良好的熱穩(wěn)定性,95仍有活性,應(yīng)用濃度一般為1-2.5u/100ul反應(yīng)體積.5,引物 0.1-0.5umol/L.引物濃度偏高會引起錯配或非特異性擴(kuò)增,生成引物二聚體,使目的DNA片段產(chǎn)率下降.退火溫度與引物Tm值有關(guān),引物Tm值在55-80 范圍

33、較為理想.6,反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)(十九,影響大腸桿菌系統(tǒng)外源基因表達(dá)的因素答:1,啟動子的強(qiáng)弱;2,基因的劑量;3,影響RNA轉(zhuǎn)錄和翻譯效率的因素:SD序列,mRNA;4,外源基因密碼子的選擇;5,表達(dá)產(chǎn)物的大小;6,表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性.(二十,大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)外源基因必須具備的條件答:1,要求外源基因的編碼區(qū)不能含有內(nèi)含子;2,表達(dá)的外源片段要位于大腸桿菌啟動子的下游,并形成正確的閱讀框架;3,轉(zhuǎn)錄出的mRNA必須有與大腸桿菌16S rRNA3,末端相匹配的SD序列,才能被有效的翻譯成蛋白質(zhì).4,蛋白產(chǎn)物必須穩(wěn)定,不易被細(xì)胞內(nèi)蛋白酶快速降解,且對宿主無害.(二十一,真核細(xì)胞表達(dá)外源基因的條件答:1,首先必須具備哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的功能元件.要求哺乳動物細(xì)胞表達(dá)載體帶有能在真核細(xì)胞中表達(dá)外源基因的真核轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件;2,注意選擇轉(zhuǎn)染的受體細(xì)胞,不同類型的細(xì)胞具有不同的特性;3,注意選擇適當(dāng)?shù)倪x擇標(biāo)記.(二十二,轉(zhuǎn)基因動物的概念,原理及應(yīng)用答:1,概念:是指用人工方法將外源基因?qū)牖蛘系交蚪M內(nèi),并能穩(wěn)定傳代的一類動物.它的特點是"分子及細(xì)胞水平操作,組織及動物整體水平表達(dá)".2,基本原理:將目的基