大鼠急性脊髓損傷后血小板衍化生長因子_B的表達(dá)

1、大鼠急性脊髓損傷后血小板衍化生長因子_B的表達(dá)         08-11-29 13:30:00     作者：徐錫金    編輯：studa20【摘要】  目的：探討血小板衍化生長因子_B(PDGF_B)在脊髓損傷(SCI)后對(duì)脊髓功能恢復(fù)的作用。方法：健康雌性SD大鼠48只隨機(jī)分為免疫組化組(30只)和反轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)(RT_PCR)組(18只)。麻醉后，用改制的型紐約大學(xué)裝置建立大鼠脊髓急性損傷模型。用免疫組化檢測

2、急性SCI后不同時(shí)段PDGF_B在脊髓中的表達(dá)，用RT_PCR檢測PDGF_B的mRNA在急性SCI后不同時(shí)段表達(dá)的變化。結(jié)果：PDGF_B蛋白表達(dá)：急性SCI后24h，PDGF_B在損傷區(qū)周圍神經(jīng)元的表達(dá)開始增加(592±323)，并于7d后維持在一定水平，14d后PDGF_B陽性細(xì)胞數(shù)增多，28d達(dá)高峰(8500±1349)，主要表達(dá)于壞死區(qū)增生的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。PDGF_B mRNA表達(dá)：SCI后1d，PDGF_B mRNA表達(dá)降低，3d接近正常，隨后略有下降，14d后mRNA表達(dá)升高，28d基本回到正常。結(jié)論：急性SCI后，PDGF_B對(duì)損傷脊髓的功能恢復(fù)有重要作用。

3、 【關(guān)鍵詞】  血小板衍化生長因子 脊髓損傷 神經(jīng)營養(yǎng)因子AbstractObjective: To explore the role of platelet derived growth factor_B(PDGF_B)on spinal cord functional reco_very after acute spinal cord injury(SCI)in rats Methods: Forty_eight health SD female rats were randomly assigned into immunohistochemistry group(n=30),

4、RT_PCR group(n=18). After anesthesia, the rat model with acute SCI was established using the modified weight_drop device from New York University. Immunohistochemistry method was used to detect the expression of PDGF_B protein after SCI,and RT_PCR was used to monitor the changes of PDGF_B mRNA. Resu

5、lts： After SCI, the expression of PDGF_B was different from that of control group. One day later, the numbers of PDGF_B positive cells and the PDGF_B mRNA were showed to increase tendentiously. Until 28 days, the numbers of PDGF_B positive cells reached the peak because of proliferative gligcyte Con

6、clusion: After SCI, PDGF_B plays an important role in spinal cord functional recovery after SCI.    Key Wordsplatelet derived growth factor; spinal cord injury; neurotrophic factor脊髓損傷(SCI)后的神經(jīng)元再生修復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的前沿課題。在SCI的病理過程中，多種神經(jīng)營養(yǎng)因子參與其中。血小板衍化生長因子(Platelet_derived growth factor, PDGF)是

7、由多種細(xì)胞合成和分泌的，它與神經(jīng)細(xì)胞上的特異性受體(PDG_FR)結(jié)合后能促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增殖、分化、趨化和預(yù)防程序性死亡的作用。PDGF，尤其是PDGF_B及其受體在神經(jīng)系統(tǒng)中有廣泛的表達(dá)，與腦部腫瘤、腦血管疾病和脫髓鞘疾病等多種神經(jīng)系統(tǒng)的疾病發(fā)生密切相關(guān)1，為進(jìn)一步了解PDGF_B在中樞神經(jīng)損傷后及修復(fù)中對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，本研究采用紐約大學(xué)(NYU)裝置建立大鼠SCI模型，用免疫組化和反轉(zhuǎn)錄_聚合酶鏈反應(yīng)(RT_PCR)方法，檢測大鼠脊髓急性損傷后不同時(shí)段PDGF_B表達(dá)的變化,觀察PDGF_B表達(dá)的變化規(guī)律，探索對(duì)損傷脊髓神經(jīng)的保護(hù)作用及其對(duì)損傷脊髓功能恢復(fù)的影響。  

8、  1 材料與方法    11動(dòng)物分組健康成年雌性Sprague_Daley(SD)大鼠(南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)48只,體質(zhì)量160200g,隨機(jī)分為免疫組化組又分6個(gè)小組(n5)：正常對(duì)照組、傷后1，3，7，14和28d組和RT_PCR組又分6個(gè)小組(n3)：正常對(duì)照組、傷后1，3，7，14和28d組。12SCI模型制備與取材大鼠按3mL/kg體質(zhì)量腹腔注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)01%(30mg/kg)的戊巴比妥鈉。術(shù)區(qū)備皮，體積分?jǐn)?shù)75%的酒精消毒，鋪巾。做背部正中切口(T9T11)，鈍性分離皮下組織、肌肉，暴露T10棘突。用咬骨鉗仔細(xì)咬去T10棘突及椎板

9、，充分暴露該段脊髓背面及兩側(cè)1。用改制的型NYU裝置(撞擊高度25mm，撞擊針10g，接觸面積2mm2)對(duì)暴露脊髓的T10節(jié)段進(jìn)行撞擊,造成相當(dāng)于中度SCI程度。撞擊成功的標(biāo)志：大鼠尾巴痙攣性擺動(dòng)，雙下肢及軀體回縮樣撲動(dòng)，雙下肢呈馳緩性癱瘓。術(shù)區(qū)撒青霉素粉，用周圍組織填充椎骨缺損部位，分層縫合。術(shù)后皮下注射青霉素10000u，開臺(tái)燈保暖2。術(shù)后1、3、7、14、28d及對(duì)照組按05mL/100g體質(zhì)量腹腔注射01%戊巴比妥鈉，深度麻醉。開胸暴露心臟，行左心室_主動(dòng)脈插管，剪開右心耳，灌注NS200mL，然后灌注預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)3%的福爾馬林200mL，至動(dòng)物肢體僵硬。固定2h后，以撞擊點(diǎn)為中心，

10、取出損傷部位(節(jié)段T9T10)及其近、遠(yuǎn)端各2個(gè)節(jié)段的脊髓，測量其左、右橫徑和前、后徑后用體積分?jǐn)?shù)10的福爾馬林繼續(xù)固定24h，重新修整后石蠟包埋切片(約5m)，每隔20張切取1張。    13方法    131動(dòng)物行為評(píng)分    分別于SCI后3、7、14、21、28d對(duì)兩組進(jìn)行BBB(Basso, Beattie, Bresnahan locomotor rating scale)評(píng)分，檢測其術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)情況1。    132免疫組化    采用鏈霉素生物素蛋白_過氧化物酶連接法：切片以二甲苯脫蠟10min×2次，梯度酒精(100、 90、 85、 75)各洗1min，001mol/LPBS振動(dòng)漂洗5min，微波抗原修復(fù)，入體積分?jǐn)?shù)3的H2O2中處理15min以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水振動(dòng)漂洗3min×3次；然后用正常山羊血清工作液封閉10min；入兔抗大鼠PDGF_B多克隆抗體(1100，武漢博士德公司，中國)4冰箱過夜；生物素化標(biāo)記山羊抗兔IgG 37孵育15min；卵白素標(biāo)記的辣根過氧化物酶復(fù)合物37孵育15min；各步抗體反應(yīng)間均用001mol/LPBS漂洗3min