HLA分型技術(shù)PPT課件

1、2021/3/91 HLA分型技術(shù)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院彭奕冰 主任技師2021/3/92Major Histocompatibility Complex(MHC)What is MHC?HLAH-2Minor histocompatibility antigens2021/3/932021/3/942021/3/95autologous: in the same individual (autograft)isologous: between genetically Identical individuals (isograft), i.e., identical twins (inbred a

2、nimals)homologous: between individuals of the same species (allograft)heterologous: between individuals different species (xenograft)2021/3/962021/3/97minor histocompatibility antigens also cause rejectionThe rejection time is variable but longer than that for major histocompatibility antigenThey ha

3、ve additive effects2021/3/982021/3/992021/3/910class IIclass IDPDQDRBCABCADPDQDR122211931 221 32021/3/911IDKAEclass IIclass Iclass Iclass III(C4, factor-B,TNF, etc.)2021/3/912 HLA基因系統(tǒng)的多態(tài)性及一些主要基因座位的等位基因數(shù)基因系統(tǒng)的多態(tài)性及一些主要基因座位的等位基因數(shù)正式命名顯示多態(tài)性的正式命名顯示多態(tài)性的HLA基因座位有基因座位有31個(gè)，共個(gè)，共2 320個(gè)等位基因。個(gè)等位基因。 圖中所示為常見(jiàn)基因座位的圖中所示

4、為常見(jiàn)基因座位的等位基因數(shù)。等位基因數(shù)。2021/3/913JackJillDPDQDRBCA1234BoKimMoLee134123422021/3/9142021/3/915If Jack and Jill have four children; Bo, Kim, Mo and LeeTheyll all inherit antigens of the parental MHCOft their haplotypes will be of the father or motherUnless during meiosis, a crossover should occur2021/3/91

5、6 Class-I expressed on all nucleated cells in man, and also on erythrocytes in mice. Class-II expressed primarily on antigen presenting cells (dendritic cells, macrophages and B cells, etc.)2021/3/917Alloreactivity of T cells:MLR and CTL generationCD4+TH1CD8+CTLCD8+preCTL2021/3/918Alloreactivity of

6、T cellsT CELLT CELLDRW11DRW17PositiveSelectionThymusAlloreaction(MLR)Proliferation and Differentiation2021/3/919InflammationlysisADCClysisIL2, IFN TNF, NO2IL2, IL4, IL5IL2, TNF, IFN rejection2021/3/920type of rejectionaccelerateddaysreactivation of sensitized T cells (secondary response)acutedays-we

7、eksprimary activation of T cellshyperacuteminutes- hourspreformed anti-donor antibodies and complement2021/3/9212021/3/922Removal of T cells from marrow graft MagnetMagnetic antibodies2021/3/9232021/3/924HLA抗原檢測(cè)法抗原檢測(cè)法2021/3/925微量細(xì)胞毒試驗(yàn)微量細(xì)胞毒試驗(yàn)原理原理當(dāng)特異性抗體與淋巴細(xì)胞表面當(dāng)特異性抗體與淋巴細(xì)胞表面HLA分子分子結(jié)合，激活補(bǔ)體，使細(xì)胞溶解。在顯微鏡下結(jié)合，

8、激活補(bǔ)體，使細(xì)胞溶解。在顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞被活性染料著色?？梢?jiàn)細(xì)胞被活性染料著色。淋巴細(xì)胞只表達(dá)淋巴細(xì)胞只表達(dá)HLA I分子，如欲測(cè)分子，如欲測(cè)定定HLA II類分子，需用細(xì)胞。類分子，需用細(xì)胞。2021/3/926微量細(xì)胞毒試驗(yàn)微量細(xì)胞毒試驗(yàn) HLA I類分型法類分型法方法方法n加板：加板：Terasaki板中加入特異性抗板中加入特異性抗HLA I類分子類分子抗體?？贵w。n分離分離PBMC。制成濃度為制成濃度為1 106/ml的細(xì)胞懸液。的細(xì)胞懸液。n每孔內(nèi)加入每孔內(nèi)加入1 l細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液。n室溫培育室溫培育30min。n1 l兔補(bǔ)體。室溫培育兔補(bǔ)體。室溫培育60min。n每孔內(nèi)加入每孔

9、內(nèi)加入5 l 5%伊紅水溶液。室溫伊紅水溶液。室溫5min。n每孔內(nèi)加每孔內(nèi)加37%甲醛固定。甲醛固定。n倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果。倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果。2021/3/927微量細(xì)胞毒試驗(yàn)微量細(xì)胞毒試驗(yàn) HLA II類分型法類分型法與與HLA類分型法區(qū)別類分型法區(qū)別1須用富含細(xì)胞的淋巴細(xì)胞懸液。須用富含細(xì)胞的淋巴細(xì)胞懸液。2抗體與細(xì)胞培育時(shí)間為抗體與細(xì)胞培育時(shí)間為1h。3加補(bǔ)體后培育時(shí)間為加補(bǔ)體后培育時(shí)間為2h。2021/3/928微量細(xì)胞毒試驗(yàn)微量細(xì)胞毒試驗(yàn)應(yīng)用實(shí)踐應(yīng)用實(shí)踐 個(gè)體個(gè)體HLA分型可用于移植前供者和受者分型可用于移植前供者和受者配型，親子鑒定，法醫(yī)鑒定等。配型，親子鑒定，法醫(yī)

10、鑒定等。2021/3/929交叉配型交叉配型 用于測(cè)定受者血清中受含有抗供者用于測(cè)定受者血清中受含有抗供者HLA的的抗體。如受者血清中具有抗供者紅細(xì)胞血型抗體。如受者血清中具有抗供者紅細(xì)胞血型抗原抗體和抗原抗體和/或抗白細(xì)胞抗原抗體，會(huì)引起超或抗白細(xì)胞抗原抗體，會(huì)引起超急排異反應(yīng)。所以移植前應(yīng)作紅細(xì)胞血型測(cè)急排異反應(yīng)。所以移植前應(yīng)作紅細(xì)胞血型測(cè)定，以及測(cè)定患者血清中是否具有抗供者定，以及測(cè)定患者血清中是否具有抗供者HLA抗體?？贵w。2021/3/930交叉配型交叉配型方法方法1. 分離供體分離供體PBMC。2. 分離受者血清，作分離受者血清，作1：2，1：4和和1：8稀釋。加稀釋。加入入Ter

11、asaki板，每孔板，每孔1 l。其余步驟同微量細(xì)胞毒試驗(yàn)。其余步驟同微量細(xì)胞毒試驗(yàn)。如結(jié)果為陽(yáng)性，表明受者血清中具有抗供者如結(jié)果為陽(yáng)性，表明受者血清中具有抗供者HLA抗體。抗體。2021/3/931細(xì)胞學(xué)分型法細(xì)胞學(xué)分型法 細(xì)胞學(xué)分型法已被血清學(xué)和分子生物學(xué)細(xì)胞學(xué)分型法已被血清學(xué)和分子生物學(xué)方法代替。單相混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)還方法代替。單相混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)還在使用。在使用。2021/3/932分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的HLA分型法分型法原理原理HLA的多態(tài)性是由基因中核苷酸序列突變引起的多態(tài)性是由基因中核苷酸序列突變引起的。同一基因的不同等位基因之間核苷酸序的。同一基因的不同等位基因之間核苷酸序列大多是相同的，變異集中在幾個(gè)列大多是相同的，變異集中在幾個(gè)DNA片段片段中。在這些片斷中，不同的等位基因具有特中。在這些片斷中，不同的等位基因具有特定