細菌內(nèi)毒素檢查法講義（課堂PPT）

1、1常勝凱 藥理室2l一、細菌內(nèi)毒素l二、熱原3l細菌內(nèi)毒素是一種革蘭氏陰性細菌細胞壁的產(chǎn)物，當(dāng)其死亡或菌體裂解時釋放出的一類具有多種生物活性的毒性物質(zhì)4l（1）.致熱性：內(nèi)毒素作用人體細胞，使之釋放內(nèi)源性熱原，刺激下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，引起發(fā)熱反應(yīng)。l（2）.耐熱性：需250度干熱30分鐘才能徹底滅活。l（3）.分子極性：多糖鏈親水，脂肪鏈疏水，在水中呈不均勻分布。l（4）.鱟反應(yīng)：能與鱟試劑發(fā)生多級酶促反應(yīng)，形成凝膠。5熱原是指臨床上引起哺乳動物發(fā)熱反應(yīng)的物質(zhì) 細胞分裂素（ IL-1, IL-2, IL-6, IL-8 ）l內(nèi)源性熱原 產(chǎn)生細胞分裂素的物質(zhì) 內(nèi)毒素?zé)嵩瓋?nèi)毒素?zé)嵩璴外源性熱原 非

2、內(nèi)毒素?zé)嵩ú《尽⒓毦?、?菌、抗體-抗原復(fù)合物、細胞分裂素）6l熱原是否就是內(nèi)毒素？l在學(xué)術(shù)上仍有爭議，熱原不僅是細菌內(nèi)毒素。但在藥檢的范疇，細菌內(nèi)毒素是主要的熱原物質(zhì)，可以說無內(nèi)毒素就無熱原，控制內(nèi)毒素就是控制熱原。7l鱟(horseshoe crab)是一類與三葉蟲 (現(xiàn)在只有化石)一樣古老的動物。鱟的祖先出現(xiàn)在地質(zhì)歷史時期古生代的泥盆紀，當(dāng)時恐龍尚未崛起，原始魚類剛剛問世，隨著時間的推移，與它同時代的動物或者進化、或者滅絕，而惟獨只有鱟從4 億多年前問世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鱟有“活化石”之稱。又具有很高的藥用價值。8鱟9l鱟的血液中含有銅離子，它的血液是藍色的。鱟血液顏色

3、呈藍色，是因為鱟血漿的主要成分是血藍蛋白。這種藍色血液的提取物“鱟試劑”。鱟試劑是由海洋生物鱟的血液提取物制成的“鱟試劑”，能夠準確、快速地檢測人體是否因細菌感染而致??；鱟試劑在制藥行業(yè)中，用于檢測細菌內(nèi)毒素。目前使用的鱟試劑分為美洲鱟試劑和東方鱟鱟試劑兩大類。10l整體結(jié)構(gòu)整體結(jié)構(gòu)l1. 綜述部分綜述部分檢查法的描述試驗的準備限值（L）的確定確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）l2. 實驗部分實驗部分凝膠法 光度測定法a 鱟試劑靈敏度復(fù)核 a 標(biāo)準曲線的可靠性實驗b 干擾實驗 b 干擾實驗c 檢查法：限量試驗 c 檢查法 半定量試驗111. 檢查法的描述2. 試驗的準備3. 限值（L）的確定4.

4、確定最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）12l本法是利用鱟試劑與 細菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝聚反應(yīng)的機理，以判斷供試品中的細菌內(nèi)毒素限度是否符合規(guī)定的一種方法。13l細菌內(nèi)毒素檢查包括： 限量實驗 凝膠法 半定量實驗l可使用其中任何一種方法進行試驗?？墒褂闷渲腥魏我环N方法進行試驗。當(dāng)測定結(jié)果有爭議時，除另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準。 濁度法 動態(tài)濁度法光度測定法 終點濁度法 顯色基質(zhì)法 動態(tài)顯色法 終點顯色法 14實驗所需物品l細菌內(nèi)毒素標(biāo)準物質(zhì)l細菌內(nèi)毒素檢查用水 l凝膠法鱟試劑l漩渦混合器l適宜的恒溫器 37 1l電熱干燥箱 250 l實驗器械等15la 國家標(biāo)準品國家標(biāo)準品 以內(nèi)毒素國際標(biāo)準品為基準標(biāo)定效價

5、。系自大腸埃系菌提取精制而成，用于標(biāo)定、復(fù)核、仲裁鱟試劑靈敏度和標(biāo)定細菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準品的效價。 150600-200707 10000EU/支lb 工作標(biāo)準品工作標(biāo)準品 以內(nèi)毒素國家標(biāo)準品為基準標(biāo)定效價。用于試驗中鱟試劑靈敏度復(fù)核、干擾試驗及各種陽性對照。 150601-200968 150EU/支 150601-201072 120EU/支16l用于復(fù)溶內(nèi)毒素標(biāo)準品、稀釋內(nèi)毒素及樣品、溶解鱟試劑等la 凝膠法細菌內(nèi)毒素檢查用水系指內(nèi)毒素含量小于0.015EU/ml的滅菌注射用水lb 光度測定法細菌內(nèi)毒素檢查用水，其內(nèi)毒素含量應(yīng)小于0.005EU/ml171819202122試驗器械試驗器械

6、l移液管（或刻度吸管、微量加樣器及無熱原吸頭）、凝集管（1075mm）、試管、試管架、洗耳球、封口膜、計時器、75%酒精棉、剪刀、砂輪。23l試驗器械的要求試驗器械的要求試驗所用的器皿需經(jīng)處理，以去除可能存在的外源性內(nèi)毒素。常用的方法是在250 干 烤至少30分鐘，也可采用其他確證不干擾細菌內(nèi)毒素檢查的適宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和與微量加樣器配套的吸頭等，應(yīng)選用標(biāo)明無內(nèi)毒素并且對試驗無干擾的器械。試驗操作過程應(yīng)防止微生物是污染。24l供試品溶液的制備供試品溶液的制備某些供試品需進行復(fù)溶、稀釋或在水性溶液中浸提制成供試品溶液。一般要求供試品溶液的pH值在值在6.08.0的范圍內(nèi)。對于過酸

7、、過堿或本身有緩沖能力的供試品，需調(diào)節(jié)被測溶液（或其稀釋液）的pH值，可使用酸、堿溶液或鱟試劑生產(chǎn)廠家推薦的適宜的緩沖液調(diào)節(jié)pH值。緩沖液必須經(jīng)過驗證不含內(nèi)毒素和干擾因子。25藥品、生物制品的細菌內(nèi)毒素限值（L）除藥典有規(guī)定的，一般按以下公式確定： LKMK為人每千克體重每小時最大可接受的內(nèi)毒素劑量，以EU/(kgh)表示，注射劑K= 5EU/(kgh)，放射性藥品注射劑K= 2.5EU/(kgh)，鞘內(nèi)用注射劑K= 0.2EU/(kgh)；M為人用每千克體重每小時的最大供試品劑量，以ml/(kgh)、 mg/(kgh)或U/(kgh)表示，人均體重按60kg計算，人體表面積按1.62計算。注

8、射時間若不足1小時，按1小時計算。供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉(zhuǎn)換為每千克體重劑量（M）按人用劑量計算限值時，如遇特殊情況，可根據(jù)生產(chǎn)和臨床用藥實際情況做必要調(diào)整，但需說明理由。26l限值計算時做必要調(diào)整的幾種情況限值計算時做必要調(diào)整的幾種情況從嚴原則聯(lián)合用藥特殊情況等27l最大有效稀釋倍數(shù)是指供試品溶液被允許稀釋的最大倍數(shù)，在不超過此稀釋倍數(shù)的濃度下進行內(nèi)毒素限值的檢測。MVDcLl L：供試品的內(nèi)毒素限值l c：供試品溶液的濃度l ：在凝膠法中鱟試劑的標(biāo)示靈敏度(EU/ml)， 或在光度測定法中所使用的標(biāo)準曲線上最 低的內(nèi)毒素濃度(如標(biāo)準曲線為50、5、 0.5EU/ml三

9、個濃度組成) 28l計算舉例計算舉例la 當(dāng)L以EU/ml表示時，則濃度C的單位為1.0ml/ml 適用于供試品為溶液狀態(tài)，并且規(guī)定限值為應(yīng) 小于xx EU/ml。l l例例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用l 靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗，則：MVD1.0ml/ml0.5EU/ml0.125EU/ml4倍 29l計算舉例計算舉例lb 當(dāng)L以EU/mg表示時，則C的單位為mg/ml或U/ml適用于供試品為固體狀態(tài)，如粉針；或液體但是規(guī)定限值為應(yīng)小于xx EU/mg或EU/U。l例例：注射用阿莫西林鈉l計算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.25EU/ml的鱟

10、試劑進行檢驗。l需先稱取一定重量的注射用阿莫西林鈉，在已除去外源性內(nèi)毒素的容器中，用細菌內(nèi)毒素檢查用水配制成一定濃度的溶液。l如稱取100mg注射用阿莫西林鈉，用5ml內(nèi)毒素檢查用水溶解，即成為濃度為20mg/ml的阿莫西林鈉溶液。MVD20mg/ml0.15EU/mg0.25EU/ml12倍30l如果供試品為注射用無菌粉末或原料藥，則MVD 取1，計算供試品的最小有效稀釋濃度c=/L ；l適用于供試品為固體的情況。計算得到的最小有效稀釋濃度即為MVD下的該供試品的濃度。l 例例：注射用阿莫西林鈉l計算限值為0.15EU/mg，使用靈敏度為0.125EU/ml的鱟試劑進行檢驗。l最小有效稀釋濃

11、度lc 0.125 EU/ml0.15EU/mg0.833mg/ml 31凝膠法凝膠法光度測定法光度測定法a 鱟試劑靈敏度復(fù)核a 標(biāo)準曲線的可靠性實驗b 干擾實驗b 干擾實驗c 檢查法：限量試驗c 檢查法 半定量試驗32l目的目的 考察鱟試劑的靈敏度是否準確 考察檢驗人員操作方法是否正確 實驗條件是否符合規(guī)定l何時進行何時進行 使用新批號的鱟試劑 試驗條件發(fā)生可能影響檢驗結(jié)果的改變時 33l取細菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準品或工作標(biāo)準品一支，加入規(guī)定量的細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解其內(nèi)容物，用封口膜將瓶口封嚴，置旋渦混合器上混合15分鐘。l然后進行稀釋，制備成4個濃度的細菌內(nèi)毒素標(biāo)準溶液,即2.0、1.0、0.

12、5、0.25（為所復(fù)核的鱟試劑的標(biāo)示靈敏度），每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混合30秒鐘。34內(nèi)毒素濃度20.50.25陰性對照鱟試劑平行管35l放入371的恒溫器中，保溫60分鐘2分鐘l將試管從恒溫器中輕輕取出，緩緩倒轉(zhuǎn)180，若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性；形成的凝膠不堅實、變形或從管壁滑脫者為陰性；l保溫和拿取試管過程應(yīng)避免受到振動造成假陰性結(jié)果。 36l堅實凝膠l陽性“+”37l未形成凝膠 凝膠不堅實 l陰性“”38l結(jié)果判斷結(jié)果判斷：若最大濃度2管均為陽性，最低濃度0.25管均為陰性，陰性對照管陰性，試驗方有效。l結(jié)果計算結(jié)果計算：反應(yīng)終點濃度的幾何平均值，即為鱟

13、試劑靈敏度的測定值 c=lg-1(X/4) 式中X為反應(yīng)終點濃度的對數(shù)值（lg）。（反應(yīng)終點濃度反應(yīng)終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。） 39內(nèi)毒素濃度20.50.25陰性對照終點鱟試劑平行管0.50.5c=lg-1(lg+lg+lg0.5+lg0.5)/4=0.70740l當(dāng)c在0.52（包括0.5和2）時，方可用于細菌內(nèi)毒素檢查。實驗時，以標(biāo)示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。41l目的：是確定供試品在多大的稀釋倍數(shù)或濃度下對內(nèi)毒素和鱟試劑的反應(yīng)不存在干擾作用，為能否使用細菌內(nèi)毒素檢查法提供依據(jù)。42l當(dāng)進行新藥的內(nèi)毒素檢查試驗前，或無內(nèi)毒素檢查項的品種建立內(nèi)毒素檢查法

14、時，須進行干擾試驗。（注：須三個批號以上的供試品，兩個以上鱟試劑廠家的試劑）l當(dāng)鱟試劑、供試品的處方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗。如：內(nèi)毒素檢查時，供試品陽性對照為陰性時。43l預(yù)試驗l正式干擾試驗44l目的：初步確定供試品的最大不干擾濃度（當(dāng)限值以EU/mg或EU/U活性單位表示）或最小不干擾稀釋倍數(shù)（當(dāng)限值以EU/ml表示），為正式干擾實驗提供依據(jù)；l優(yōu)點：減少摸索過程、節(jié)省成本。45l操作步驟操作步驟：l將供試品溶液進行一系列倍數(shù)的稀釋；l使用鱟試劑對每一稀釋倍數(shù)進行檢驗，每一稀釋倍數(shù)下做2支供試品管和4支供試品陽性對照（即含2.0和

15、0.25濃度標(biāo)準內(nèi)毒素的該濃度的供試品稀釋液）；l另做2支陰性對照和2支陽性對照。 46l預(yù)試驗結(jié)果判斷：預(yù)試驗結(jié)果判斷：l當(dāng)陰性對照為陰性，陽性對照為陽性時，實驗為有效；l當(dāng)系列濃度中出現(xiàn)供試品溶液2管為陰性，供試品陽性對照2管為陽性時，供試品陽性對照0.25管均為陰性時，認為供試品在該濃度下不干擾實驗，此稀釋倍數(shù)即為最小不干擾稀釋倍數(shù)。l即可選擇該稀釋倍數(shù)和相鄰濃度進行正式干擾實驗。 47l目的：檢驗在某一濃度下的供試品對于鱟試劑與內(nèi)毒素的反應(yīng)有無干擾作用。l通過比較鱟試劑與在水溶液中的內(nèi)毒素和供試品溶液中的內(nèi)毒素反應(yīng)的差異程度，來確定供試品在該濃度下是否對內(nèi)毒素檢查有干擾。48正式干擾試

16、驗正式干擾試驗l操作：用內(nèi)毒素檢查用水和供試品將同一支內(nèi)毒素標(biāo)準品分別制備一系列濃度的內(nèi)毒素溶液l操作： 內(nèi)毒素檢查用水 同一支內(nèi)毒素 標(biāo)準品 供試品溶液l同時制備2支供試品陰性對照供試品陰性對照和2支陰性對照。含2.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素標(biāo)準溶液含2.0、0.5、0.25的內(nèi)毒素的供試品溶液 49編 號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶劑稀釋用液稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液2B2/供試品溶液供試品溶液12421440.5480.254C2/檢查用水檢查用水12421440.5480.254D無/檢查用水2A：供試品溶液 B：供試品陽性對照 C：陽性對照 D：陰性對照50l當(dāng)

17、供試品陰性對照當(dāng)供試品陰性對照A和陰性對照和陰性對照D都為陰性，并且都為陰性，并且系列溶液系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時，試驗的結(jié)果在鱟試劑靈敏度范圍內(nèi)時，試驗方為有效。方為有效。l分別計算用檢查用水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（ES）和用供試品溶液和稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值（Et）； ES =lg-1(XS/4) Et =lg-1(Xt/4)l當(dāng)ES在0.52(包括0.5和2)及Et在0.5ES 2 ES（包括0.5 ES和2 ES）時，認為供試品在該濃度下無干擾作用。 51內(nèi)毒素濃度2.00.50.25終點終點內(nèi)毒素/檢查用水（系列溶液C）

18、陰性對照（溶液D）內(nèi)毒素/供試品溶液（系列溶液B）2.02.0供試品陰性對照（溶液A） ES =lg-1(XS/4) Et =lg-1(Xt/4)1.4152l當(dāng)存在干擾時，可通過對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋或有關(guān)其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。導(dǎo)致干擾的因素：排除干擾的方法：pH值稀釋抗凝因子中和螯合劑過濾葡聚糖加熱53l由于干擾實驗檢驗的是在供試品存在的情況下內(nèi)毒素與鱟試劑的反應(yīng)是否正常，與所使用鱟試劑的靈敏度無關(guān)，因此在干擾實驗中原則上可使用任一靈敏度的鱟試劑。l建議使用較低靈敏度（如0.5或0.25EU/ml）的鱟試劑，可盡量避免供試品所含的內(nèi)毒素對干擾實驗造成

19、的陽性影響。54l凝膠限度試驗?zāi)z限度試驗l凝膠半定量試驗?zāi)z半定量試驗55l檢驗供試品中的內(nèi)毒素含量是否小于限度的定性方法。編 號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶液平行管數(shù)A供試品溶液無/供試品溶液2B供試品陽性對照2/供試品溶液2C陽性對照2/檢查用水2D陰性對照無/檢查用水2當(dāng)陰性對照溶液D的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性，陽性對照溶液C的平行管均為陽性，試驗有效56例例：替硝唑注射液，計算限值為0.5EU/ml，使用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑進行檢驗，計算： MVD1.0ml/ml0.5EU/ml0.25EU/ml2倍l供試品溶液：2倍替硝唑稀釋液l供試品陽性對

20、照為：含0.25EU/ml標(biāo)準內(nèi)毒素的2倍替硝唑稀釋液l陽性對照為：濃度為0.25EU/ml的標(biāo)準內(nèi)毒素溶液57供試品溶液供試品溶液供試品陽性對照供試品陽性對照陰性對照陰性對照陽性對照陽性對照 試驗有效試驗有效58供試品溶液供試品溶液供試品陽性對照供試品陽性對照陰性對照陰性對照陽性對照陽性對照 此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量小于0.5EU/ml，符合規(guī)定供試品溶液供試品溶液供試品陽性對照供試品陽性對照陰性對照陰性對照陽性對照陽性對照 此批替硝唑注射液的內(nèi)毒素含量不小于0.5EU/ml，不符合規(guī)定59供試品溶液供試品溶液供試品陽性對照供試品陽性對照陰性對照陰性對照陽性對照陽性對照 須復(fù)試復(fù)試時，供

21、試品溶液需做4支平行管，若所有平行管均為陰性，判供試品符合規(guī)定；四管中如有一管為陽性，即可判供試品不符合規(guī)定。供試品溶液供試品溶液供試品陽性對照供試品陽性對照陰性對照陰性對照陽性對照陽性對照 60l半定量試驗是使用凝膠法估測估測供試品中內(nèi)毒素含量的方法，系通過反應(yīng)終點濃度來量化供試品中內(nèi)毒素的含量。l原理：通過供試品系列稀釋液與鱟試劑反應(yīng)，其反應(yīng)終點濃度的稀釋倍數(shù)與鱟試劑靈敏度的乘積即為供試品的內(nèi)毒素含量。61l操作：用檢查用水將供試品溶液從已確定的不干擾濃度和稀釋倍數(shù)下開始進行對倍稀釋，制備成2、4、8倍的稀釋液，但最大稀釋倍數(shù)不得超過所使用鱟試劑的MVD。62編號內(nèi)毒素濃度/配制內(nèi)毒素的溶

22、劑稀釋用液 稀釋倍數(shù)所含內(nèi)毒素的濃度平行管數(shù)A無/供試品溶液檢查用水12224282B2/供試品溶液22C2/檢查用水檢查用水12221240.5280.252D無/檢查用水2A：沒有超過MVD并且通過干擾試驗的供試品系列稀釋液；B：供試品陽性對照（為確證不存在干擾作用）；C：標(biāo)準內(nèi)毒素系列（為確證本試驗的操作和環(huán)境都符合規(guī)定）；D：陰性對照。63l當(dāng)陰性對照溶液D的平行管均為陰性；l供試品陽性對照溶液B的平行管均為陽性；l系列溶液C的反應(yīng)終點濃度的幾何平均值在0.52之間，則試驗有效。l若內(nèi)毒素濃度小于規(guī)定的限度，判供試品符合規(guī)定。l若內(nèi)毒素濃度大于或等于規(guī)定的限度，判供試品不符合規(guī)定。64

23、內(nèi)毒素濃度2.00.50.25終點標(biāo)準內(nèi)毒素系列溶液C0.5稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A42供試品陽性對照溶液B 陰性對照溶液D CElg-1(X/2)=lg-1(lg4+lg2)/2=2.8365l例例：右旋糖酐20葡萄糖注射液，限值為0.5EU/ml； 通過使用3個鱟試劑廠家的鱟試劑對3個不同廠家的7個樣品進行干擾試驗證實：右旋糖酐20葡萄糖注射液稀釋2倍后即不干擾內(nèi)毒素檢查； 使用靈敏度為0.03EU/ml的鱟試劑對一批右旋糖酐20葡萄糖注射液進行凝膠半定量試驗。MVD0.5EU/ml0.03EU/ml16.67倍 從已確定不干擾的稀釋倍數(shù)2倍起，再進行1、2、4、8倍稀釋(相當(dāng)于將供試品原液進行了2、4、8、16倍稀釋，最終的稀釋倍數(shù)沒有超MVD)。 66內(nèi)毒素濃度0.060.030.0150.0075終點標(biāo)準內(nèi)毒素系列溶液C0.0150.03稀釋倍數(shù)1248供試品系列溶液A40.0320.03供試品陽性對照溶液B 陰性對照溶液D CElg-1(X/2)=lg-1(lg4+lg2)/2=2.830.0849EU/ml67l如果檢驗時采用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內(nèi)毒素濃度時要將結(jié)果乘上稀釋倍數(shù)。 由于檢驗時采用的是右旋糖酐20葡萄糖注射液的最小不干擾稀釋倍數(shù)2倍稀釋液，因此