海洋微生物多樣性及其研究方法

1、海洋細(xì)菌多樣性及其研究進(jìn)展浩瀚的海洋是地球上生命的搖籃，它覆蓋地球表面積的70.8%。從海面到海底深層蘊(yùn)藏著數(shù)量驚人的生物、能源、礦產(chǎn)以及空間資源。目前的研究表明，海洋微生物不僅在海洋生態(tài)環(huán)境和物質(zhì)循環(huán)中具有極其重要的作用，也是各種新型生物活性物質(zhì)的潛在來源。由于世界面臨嚴(yán)重的資源、環(huán)境、人口問題，海洋生物資源包括海洋微生物資源的開發(fā)與多樣性研究已成為各沿海國家關(guān)注的熱點(diǎn)。1914年，Issatchenko出版第一本海洋微生物研究專著北冰洋細(xì)菌的研究，確定了海洋微生物學(xué)的研究方向，并使海洋微生物學(xué)發(fā)展成為獨(dú)立的學(xué)科。 Certes, A. 1884. On the culture, free

2、from known sources of contamination, from waters and from sediments brought back by the expeditions of the Travailleur and the Talisman: 1882-1883. C.R.Hebd.Sances Acad. Sci., 98:690-693v ZoBell,C.E. 1946. Marine Microbiology. Chronica Botanica, Waltham, MA.v Johnson,T.W. et al. 1961. Fungi in Ocean

3、s and Estuaries(海灣）. Weinheim published by J.Cramerv Wood,E.J.F. 1965. Marine Microbial Ecology. Chapman &Hall pressv Wood,E.J.F. 1967. Microbiology of Oceans and Estuaries. Elsevier Publishing, Londonv Colwell,R.R., et al. 1974. Effect of the Ocean Environment on Microbial Activities. Universit

4、y Park Press, Baltimore.v Colwell,R.R., et al. 1975. Marine and Estuarine Microbiology Laboratory Manual. University Park Press, Baltimorev Wood,E.J.F. 1975. The living ocean: Marine microbiology. Croom Helmv Litchfield,C.D. 1976. Marine Microbiology. Dowden,utchingon & Ross Inc.v Sieburth,J.McN

5、. 1979. Sea Microbes. Oxford University Pressv Vincent,W.F. 1988. Microbial Ecosystems of Antarctica. Cambridge University press, New Yorkv Austin,B. 1988. Marine Microbiology. Cambridge University Pressv Bartlett,D.H. 2000. Molecular Marine Microbiology. Horizon Scientific pressv Kirchman, D.L. 200

6、0. Microbial Ecology of the Oceans. Wiley_Liss pressv Paul,J.H. 2001. Marine Microbiology (Methods in Microbiolgy, volume 30) Academic Pressv Smith J. 2002. Microbiology of Marine & Freshwater Environments. Chapman & Hallv Munn,C.B. 2004. Marine Microbiology: Ecology and Application. BIOS Sc

7、ientific Publishersv Hobbie,J.E. 1984. Heterotrophic Activity in the Sea (NATO conference series) Plenum Pub Corpv Vreeland,R.H. 1991. Microbiology of Deep-Sea Hydrothermal Vents（熱水口） (Microbiology of Extreme and Unusual Environments). CRC Pressv Karl,D.M. 1995 The Microbiology of Deep-Sea Hydrother

8、mal Vents (Crc Series on Microbiology of Extreme and Unusual Environments). Crc Pr I Llc 。v 薛廷耀編. 海洋細(xì)菌學(xué). 科學(xué)出版社. 1962 北京v 克里斯 A E.著. 孫國玉，李世珍譯. 海洋微生物學(xué)（深海）. 科學(xué)出版社. 1964 北京 v 林永成， 周世寧主編. 海洋微生物及其代謝產(chǎn)物. 化學(xué)工業(yè)出版社. 2003 北京海洋細(xì)菌的多樣性摘自Martinko J M., et al. 1997, Brock Biology of Microorganisms（中譯本）生物系統(tǒng)發(fā)育摘自Martin

9、ko J M., et al. 1997, Brock Biology of Microorganisms（中譯本）細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育微生物種類多樣性What is marine bacteria?關(guān)于物種的概念物種是一個可以相互交配繁殖的自然群體，并與其他群體在生殖上是隔離的（Mayr, 1969）；物種是一個具有自身進(jìn)化趨向和歷史結(jié)局的祖裔群體的單一譜系，并維持其特性與其他類似譜系不同（Wiley, 1978）；微生物的種是一群具有高度表型相似的菌株的集合體，該菌株集合與其他類群的菌株存在明顯差異（Stanier, 1986）； species, units of evolution and e

10、cology, should be considered as ecologically unique (e.g. different biotypes, virulence（至病） properties, habitats, host ranges) -from: Ward D.M., A natural species concept for prokaryotes. Curr Opin Microbiol 1998, 1:271-277Major horizontal zonation in an ocean profile. (Soruce: Odum1971.) Intertidal

11、:潮間帶neritic淺海區(qū) euphotic zone 透光層 Aphotic zone無光層 Continental shelf大陸架 Continental slope大陸斜坡 Continental rise大陸隆 hadal zone深海帶(6000米以下)abyssal plain深海平原trench溝 Principal environmental characteristics of an estuary.HWOST= high water line of spring tide; LWOST= low water line of spring tide.Thermal Ven

12、t Communitiesv Marine bacteria should exhibit growth at salinities between 20-40 parts per thousand. v True marine bacteria will not grow in the absence of sodium chloride.v Marine bacteria must be capable of growth at the low nutrient concentrations found in the oceans.v Marine bacteria must be cap

13、able of growth at low temperatures.海洋細(xì)菌種類多樣性及其分布古菌（ARCHAEA）嗜泉古菌界（Crenarchaeota）廣域古菌界（Euryarchaeota）初生古菌界（Korarchaeota） 真細(xì)菌（EUBACTERIA）變形細(xì)菌（Proteobacteria）-、-subclass藍(lán)細(xì)菌（Cyanobacteria）革蘭氏陽性細(xì)菌（Gram-positive bacteria）噬纖維菌屬-黃桿菌屬（Cytophaga-Flavobacterium）浮霉?fàn)罹≒lanctomycetales）疣微菌（Verrucomicrobiales）螺旋體（S

14、pirochaeta）綠色非硫細(xì)菌（Green non-sulfur bacteria）海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的部分Proteobacteria類群的細(xì)菌類群屬- ProteobacteriaAgrobacterium，Brucella，Erythrobacter，Hyphomonas，Nitrobacter，Pseudomonas，Rodopseudomonas，Roseibium， Roseobacter，sphingomonas - Proteobacteria（含-亞簇）Achromobacter，Acinetobacter，Aeromonas，Alcaligenes，Alteromonas，

15、Beggiatoa，Candidatus Endobugula sertula （ 共 生 細(xì) 菌 ）Chromobacterium，Colwellia，Hahella，Halomonas，Idiomarina，Leucothrix，Marinobacter，Marinomonas，Moritella，Nitrosomonas，Oceanospirillum，Photobacterium Pseudoalteromonas，Pseudomonas，Psychrobacter，Serratia， Shewanella，sulfur-oxidizing endosymbioticbacteria，

16、Thalassomonas，Thiobacillus，Thiocapsa，Thioflavicoccus ，Thiomicrospira，Vibrio- Proteobacteria“ Candidatus Entothenella palauensis ” ，Desulfobacter，Desulfobacterium，Desulfobotulus，Desulfofustis，Desulfomena，Desulfomonile ， Desulfosarcina，Desulfotalea，Desulfotignum，Desulfovibrio- ProteobacteriaArcobacter

17、，ectosymbiont of Alvinella pompejana，Sulfurospirillum ，Thiovulum海洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的部分革蘭氏陽性細(xì)菌類群屬高 G+C 革蘭氏陽性細(xì)菌Streptomyces，Arthrobacter，Nocadia，Mycobacterium，Corynebacterium，Actinoplanes，Gordonia，Micromonospora，Thermoactinomyces，Rhodococcus，Brevibacterium，Actinomycete低 G+C 革蘭氏陽性細(xì)菌Bacillus，Paenibacillus，Staphyloc

18、occus，Streptococcus，Peptococcus，Micrococcus，Clostridium，Sarcina，Planococcus，Halobacillus海洋細(xì)菌基因資源多樣性目前已克隆的來自海洋細(xì)菌的基因基 因產(chǎn) 物 及 其 功 能微 生 物參 考 文 獻(xiàn)C h i A幾 丁 質(zhì) 酶V i b r i o s p . s t r a i n F i :7B e n d t e t a l . 2 0 0 1O m p 2細(xì) 胞 外 膜 孔 道 蛋白B r u c e l l a m a r i sC l o e c k a e r t e t a l .2 0 0 1L

19、 u x冷 光 形 成V i b r i o fi s c h e r iV . p a r a h a e m o l y t i c u sM c C a r t e r 1 9 9 8 ；S t e v e n s e t a l . 1 9 9 7G r o E S , g r o E LG r o E S , G r o E L( 分 子 伴 娘 )V i b r i o h a r v e y iK u c h a n n y e t a l . 1 9 9 8T n 5影 響 支 架h o l d f a s t 形 成海 洋c a u l o b a c te r s p .（

20、 M C 5 6 ）Y u n e t a l . 1 9 9 4S w m AS w m A多 肽 ，海 洋S y n e c h o c o c c u sB r a h a m s h a 1 9 9 6F l a C D E F G H I J鞭 毛 蛋 白海 洋 古 菌M e t h a n o c o c c u s v o l t a eT h o m a s e t a l . 2 0 0 1R u b i s C Or i b u l o s e - 1 ,5 -b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e /o x y ge n

21、a s e海 洋 細(xì) 菌S 1 8 5 - 9 A 1C a s p i e t a l . 1 9 9 6R p o E細(xì) 胞 一 蛋 白 質(zhì)海 洋V i b r i o a n g u s t u mH i l d e t a l . 2 0 0 0R p o A，r p o DR N A聚 合 酶 -亞 基 ,細(xì) 胞 因 子深 海 嗜 壓S h e w a n e l l av i o l a c e a D S S 1 2N a k a s o n e e t a l .2 0 0 1 a ， 2 0 0 0C y o - o p e r o n對 苯 二 酚 氧 化 酶S h e w

22、 a n e l l a v i o l a c e aN a k a s o n e e t a l .2 0 0 1 bP p o A多 酚 氧 化 酶M a r i n o m o n a sm e d i t e r r a n e aS a n c h e z - A m a t e t a l .2 0 0 1果 膠 酶 基 因果 膠 酶P s e u d o a l t e r o m o n a sh a l o p l a n k ti sT r u o n g e t a l . 2 0 0 1M b l a - 內(nèi) 酰 胺 酶M o r i t e l l a m a r

23、 i n aT a n a k a e t a l . 2 0 0 1A T P s u l f u r y l a s eg e n eA T P 硫 酸 化 酶 基因深 海 熱 液 出 口 共 生 細(xì) 菌文 庫L a u e e t a l . 1 9 9 4A P堿 性 磷 酸 酯 酶海 洋 弧 菌A s g e i r s s o n e t a l .2 0 0 1海洋細(xì)菌的特性及其對多樣性研究的影響海洋細(xì)菌的培養(yǎng)特性1 附著性和集結(jié)性2 生長緩慢3 特殊的培養(yǎng)要求4 存在活的不可培養(yǎng)狀態(tài)（viable-but-nonculturable）海洋細(xì)菌的形態(tài)和生理生化特性1 海洋微生物細(xì)

24、胞形態(tài)的多變性2 生理生化反應(yīng)的多變性3 不易傳代和保存4 難以分類鑒定 各種生態(tài)環(huán)境中可培養(yǎng)的微生物占該生境微生物總數(shù)的比例 要判斷海洋環(huán)境中分離的微生物是海洋生物十分困難。盡管大部分在大海發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌與非海洋細(xì)菌有區(qū)別，但長期以來，卻沒有一個確定的標(biāo)準(zhǔn)用于區(qū)別海洋的與非海洋的細(xì)菌，也沒有對海洋細(xì)菌做出明確定義。海洋細(xì)菌多樣性研究方法及其進(jìn)展Beijerinck, M.W.(1889):v How may one recover samples of water or sediment from the desired location and know that the samples ar

25、e uncontaminated by the overlying water?v How does one culture these mysterious creatures?v What are their requirements for growth ?v Will they even grow in the laboratory at all?v What kinds of microorganisms are there?v Do they fit into the classical taxonomic schemes?取樣的方法1 海水樣品的采集 微生物采水器、錯流過濾設(shè)備2

26、 海洋沉積物的采集 底棲生物采泥器、shinkai6500、Kaikov 依賴微生物分離培養(yǎng)的研究方法v 不依賴微生物分離培養(yǎng)的研究方法海洋細(xì)菌多樣性研究方法依賴微生物培養(yǎng)的研究方法1 海洋細(xì)菌的分離培養(yǎng)2 海洋細(xì)菌的分類鑒定特定海洋細(xì)菌類群的分離方法古 菌（ H. volcanii）細(xì) 菌（ E. coli）真 核 生 物（ Dictyosteliumdisoidenum）古 菌7059-6354-56細(xì) 菌7553古菌、細(xì)菌和真核生物核糖體小亞基RNA基因序列的同源性（%）16S rRNA基因（16S rDNA）的特點(diǎn)1 存在于所有的生物細(xì)胞中，具有相似的結(jié)構(gòu)和功能2 具有分子計時器的特點(diǎn)

27、，分子序列變化緩慢3 基因中存在進(jìn)化速率不同的結(jié)構(gòu)區(qū)域，交替分布，互不影響，可用于親緣關(guān)系遠(yuǎn)近不同的生物之間的系統(tǒng)學(xué)研究 16S rRNA基因（16S rDNA）的結(jié)構(gòu)模式圖 V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 Variable region Conserved region通過比較不同微生物16S rDNA序列之間的差別，可能發(fā)現(xiàn)某種生物類群相關(guān)的特征性核苷酸序列或突變，這些特征性核苷酸序列，為各種微生物資源的鑒定、分類建立起一個簡單而統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。大腸桿菌 r DNA小亞基二級結(jié)構(gòu)模式圖不依賴微生物分離培養(yǎng)的研究方法顯微鏡直接檢查法脂肪酸分析基因序列分析探針雜交分析脂肪酸分

28、析 脂肪酸指紋圖譜是細(xì)菌分類和鑒定中十分有用的技術(shù)，尤其是磷脂酸（phospholipid ester-linker fatty acid， PLFA），不同類群的細(xì)菌具有特征性的磷脂酸組成，它們易于從土壤、沉積物等環(huán)境樣品的微生物細(xì)胞中抽提出來，因此可用于評估自然環(huán)境包括海洋環(huán)境中活的微生物生物量或微生物種群結(jié)構(gòu). Gruntzig v., et al., 1985 FEMS Microbiol Ecol. 31:147-158基因序列分析擴(kuò)增性rDNA限制性酶切片段多態(tài)性分析（ARDRA ）末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）變性（或溫度）梯度凝膠電泳（DGGE or TGGE）rDN

29、A間隔區(qū)分析（RISA）熒光原位雜交技術(shù)（FISH）rRNA點(diǎn)/狹線印跡雜交（rRNA dot/slot blot )海洋細(xì)菌多樣性研究中常用的基因分析技術(shù)基于核糖體RNA基因序列分析的流程基因序列分析 由于核糖體RNA基因（rDNA）具有高度的保守性，在所有的細(xì)胞生物中都存在，且序列不受環(huán)境影響，從而成為迄今為止在細(xì)菌多樣性研究中應(yīng)用最多的核基因。 基本研究步驟：（1）環(huán)境樣品中總DNA的提取和純化；（2）rDNA的PCR擴(kuò)增；（3）擴(kuò)增產(chǎn)物的克??；（4）克隆產(chǎn)物的序列測定；（5）序列的比較分析和系統(tǒng)學(xué)研究。 Stahl D.A., et al. 1985 Appl Environ Micr

30、obiol. 49:1379-1384海洋沉積物中DNA提取方法之比較DNA 提提取取方方法法操操 作作 要要 點(diǎn)點(diǎn)特特 點(diǎn)點(diǎn)間間接接提提取取法法通過緩沖液反復(fù)洗滌、差速離心，將微生物菌體與沉積物顆粒分開，再從菌體中提取 DNA得到的 DNA 質(zhì)量較好；但總DNA 回收率低（33-35%） ，且回收率受樣品性質(zhì)的影響極大直直接接提提取取法法在沉積物中直接裂解微生物后提取DNA操作簡單，DNA 回收率較高；但得到的 DNA 中含有大量雜質(zhì)混混合合提提取取法法通過緩沖液反復(fù)洗滌，將微生物菌體與沉積物顆粒分開，提取菌體 DNA，同時采用直接法提取沉積物殘存的 DNA回收率較高，雜質(zhì)含量得到部分減少擴(kuò)

31、增性rDNA限制性酶切片段多態(tài)性分析(Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis，ARDRA) 將16S rDNA-PCR技術(shù)與RFLP技術(shù)相結(jié)合而發(fā)展起來的微生物多樣性研究技術(shù)；即采用識別4個堿基的限制性內(nèi)切酶對克隆獲得的16S rDNA進(jìn)行酶切，通過電泳分析酶切后的片段長度多態(tài)性。 Rooney-Vara J.N., et al. 1998 Syst Appl Microbiol. 21:557-568末端限制性片段長度多態(tài)性(Termanal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP) 利

32、用一定的標(biāo)記引物對樣品中DNA進(jìn)行特異擴(kuò)增，然后進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切，檢測末端限制性片段的多態(tài)性。 Moesender M.M., et al. 1999 Appl Environ Microbiol. 65:3518-3525變性梯度凝膠電泳技術(shù)(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis, DGGE) 使用一對特異性引物PCR擴(kuò)增環(huán)境樣品中的16S rRNA基因，產(chǎn)生長度相同但序列不同的DNA片段混合物，該混合物在含梯度濃度變性劑（變性劑濃度由低到高）的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，在一定溫度下，同一變性劑濃度下，序列不同的產(chǎn)物，其解鏈的溫度和程度不同，導(dǎo)致電泳

33、的遷移率不同，從而將不同序列（只要有一個堿基的差別）的DNA分開。 Benlloch S., et al. 2002 Environ Microbiol. 4(6):349-360rDNA間隔區(qū)分析(rDNA internal spacer analysis，RISA) 利用16S rDNA 3保守區(qū)和23S rDNA 5保守區(qū)設(shè)計引物，PCR擴(kuò)增環(huán)境樣品中的16S-23 rDNA間隔區(qū)，通過分析該擴(kuò)增片段的核苷酸序列或比較其差異，進(jìn)行微生物多樣性研究。 Garca-Martnez J. et al. 1999 J Microbiol Method 36:55-6416S 23s rDNA間隔

34、區(qū)示意圖熒光原位雜交(Fluorescence in situ Hybridization, FISH) 將熒光標(biāo)記的具有屬種（或類群）特異性的寡核苷酸探針與經(jīng)固定的環(huán)境樣品中的DNA或RNA進(jìn)行雜交，并通過掃描共聚焦顯微鏡（scanning confocal laser microscopy， SCLM）檢測雜交信號。該技術(shù)廣泛應(yīng)用于環(huán)境中特定微生物的種群鑒定、種群數(shù)量分析及特異微生物跟蹤檢測。 Ravenschlag K., et al. 2000 Appl Environ Microbiol 66:3592-3602 用于海洋細(xì)菌多樣性分析的探針1 基于不同的域、科、屬、種乃至亞種核糖體

35、RNA基因（rDNA）設(shè)計的特異性探針2 針對海洋特有細(xì)菌類群設(shè)計的寡核苷酸探針3 針對某些特殊生理類群細(xì)菌核糖體RNA或功能基因設(shè)計的寡核苷酸探針探探 針針 序序 列（列（5-3） 適合的微生物類群適合的微生物類群 GAM660 TCCACTTCCCTCTAC Marine -Proteobacteria, endosymbionts DSS225 TGGTACGCGGGCTCA TCT Svalbard clone group SV AL1 cl81-644 CCCA TACTCAAGTCCCTT Svalbard clones Sva0081 and Sva0863 GCTGTACTCA

36、AGTTACCCAGTTCTAA Bacterial endosymbiont SAR11-A1 SAR11-A2 SAR11-B2 SAR11-B3 SAR11-D4 SAR11-G1 AAGCTTTCTCCGTAAAGACTTA T； GCAGGCTCA TCCAA TGGT CGGGCTCA TCTTTCGGC CTCTTCGCDTCTCAYTGTAAGT AA TGTTAGTAACTAAACGTAGGG CCTGTGAAGGCTTA TTCAGTA TT Marine SAR11 lineage NOR1-56 TTACCGCTCGGACTTGCA Marine NOR1 lineag

37、e NOR2-1453 GGTCA TCGCCA TCCCC Marine NOR2 cluster groupA SAR86-1249 GGCTTAGCGTCCGTCTG Marine SAR86 cluster Bn1253 CA TCGCTGCTTCGCAACCC Symbiont specific Bn240f TGCTA TTTGA TGAGCCCGCGTT Symbiont specific GP1 GP2 GP3 GP4 GP5 CA TCA TCTAGCAAGCTAGACA TG CAGCGA TTAGCAAGCTAA TCCTG CAGCGAAGTGCAAGCACTTCCTG

38、 CA TCTTCTAGCAAGCTAGAAA TG CAGCGA TAGCAAGCTA TCCTG Marine-clone cluster MALF-1/1b Marine -Proteobacteria CYA664 GGAA TTCCCTCTGCCCC Marine Cyanobacteria 海洋特有細(xì)菌類群的16S rDNA 探針 探針 2 探針 4計算機(jī)分析雜交圖象并由探針的雜交情況推導(dǎo)樣品的多樣性 探針 5探針 3 探針 1DNA 樣品與基因芯片上16S rDNA 特征性寡核苷酸探針結(jié)合基因芯片技術(shù)在海洋細(xì)菌多樣性分析中的應(yīng)用Eilers et al.（2000）：對德國北海浮

39、游細(xì)菌的研究表明，培養(yǎng)獲得的兩個優(yōu)勢細(xì)菌類群（Roseobacter和Cytophaga-Flavobacterium）中，前者在16S rDNA克隆文庫中找到了相關(guān)序列，而后者沒有；Webster et al.（2001）：從海綿共生體中獲得的16S rDNA克隆文庫中，沒有序列與分離培養(yǎng)獲得的共生細(xì)菌16S rDNA序列相似；Acinas et al.（1999）：海水浮游細(xì)菌16S rDNA克隆文庫中優(yōu)勢類群SAR86 cluster，目前沒有在任何可培養(yǎng)的細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)； study（2002）：南沙沉積物16S rDNA克隆文庫中，沒有序列與分離培養(yǎng)獲得的細(xì)菌16S rDNA序列相似新

40、技 術(shù) = 新 發(fā) 現(xiàn)直接鏡檢研究法海洋細(xì)菌形態(tài)多樣性附生玻片法海洋細(xì)菌形態(tài)多樣性取樣設(shè)備深海嗜壓（耐壓）細(xì)菌稀釋培養(yǎng)法寡營養(yǎng)細(xì)菌基于 16S rDNA 序列分析的技術(shù)海洋細(xì)菌系統(tǒng)類群多樣性新的細(xì)菌系統(tǒng)類群SAR11v Giovannoni SJ., et al. 1990 Genetic diversity in Sargasso Sea bacterioplankton. Nature 345(6270):60-63v Britschgi TB., Giovannoni SJ. 1991 Phylogenetic analysis of a natural marine bacteriop

41、lankton population by rRNA gene cloning and sequencing. Appl Environ Microbiol 57(6):1707-1713v Field KG., et al. 1997 Diversity and depth-spcecific distribution of SAR11 cluster rRNA genes from marine planktonic bacteria. Appl Environ Microbiol 63(1):63-70v Connon SA., Giovannoni SJ. 2002 High-thro

42、ughput methods for culturing microorganisms in very-low-nutrient media yield diverse new marine isolates. Appl Environ Microbiol 68(8):3878-3885v Rappe MS., et al. 2002 Cultivation of the ubiquitous SAR11 marine bacterioplankton clade. Nature 418(6898):630-633v Morris RM., et al. 2002 SAR11 clade do

43、minates ocean surface bacterioplankton communities. Nature 420(6917):806-810關(guān)于海洋細(xì)菌多樣性研究若干問題的討論Marine Microorganisms as a Biomedical Source: Are They Unculturable or Uncultured?Uphoff et al.(2001) ：設(shè)計了12種不同的培養(yǎng)基，與12種不同的培養(yǎng)條件搭配對，對海洋浮游細(xì)菌進(jìn)行研究，得到了屬-Proteobacteria、-Proteobacteria、high-GC Gram-positives以及Cytophaga/Flavobacterium /Bacteroides等類群的細(xì)菌；Eilers et al.（2000）：改進(jìn)培養(yǎng)方法，獲得一些海洋細(xì)菌，這些細(xì)菌的16S rDNA序列表明它們與西太平洋一類尚未培養(yǎng)的細(xì)菌類群NOR1一致；Eilers et al. （2001）：分離獲得了全球分布的原來未獲培養(yǎng)的屬-Proteobacteria的NOR5細(xì)菌類群；Webster et al.（2001）：應(yīng)用新的分離培養(yǎng)方法，從海綿中得到了與FISH的結(jié)果具有較大的一致性的共生細(xì)菌的類群；Joulian et al.（2001）：培養(yǎng)獲得的硫酸鹽還原細(xì)菌與克隆文庫中部分序列所代表的屬種是