脈絡(luò)膜新生血管動物模型的建立與評估

1、脈絡(luò)膜新生血管動物模型的建立與評估【摘要】目的：評價氪激光誘導(dǎo)棕色挪威（brown norway, BN）大鼠脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization, CNV）模型的可行性。方法：BN大鼠32只一眼行氪激光（659nm）眼底光凝，另一眼作空白對照。激光功率、光凝斑直徑和曝光時間分別為360mW、50m及0.05s。分別在光凝后7，14，21，28d隨機選取7只大鼠行眼底照像、熒光素眼底血管造影（FFA）檢查。隨機選取1只大鼠行脈絡(luò)膜血管鋪片檢查。眼球標本行組織病理切片光鏡、免疫組織化學(xué)染色觀察。結(jié)果：光凝后7d，CNV開始形成，21d達到高峰，1428d CN

2、V無明顯變化。721d，F(xiàn)FA顯示造影晚期熒光素滲漏及光鏡下CNV厚度逐漸增加，28d時可能因瘢痕開始形成，故FFA滲漏和CNV厚度開始減少。結(jié)論：氪激光誘導(dǎo)BN大鼠的CNV模型是一種較為理想的模型，F(xiàn)FA及CNV厚度分析是CNV定量研究的有效手段。 【關(guān)鍵詞】 氪激光；脈絡(luò)膜新生血管；動物模型Establishment and quantitative analysis of animal model of choroidal neovascularizationXueJing Li, YouZhi Tang, HuiJuan Wang, Jun Feng, Li ZhangFoundati

3、on item: National Natural Science Foundation of China(No.30472229)Beijing Eye Hospital of China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100040, ChinaAbstractAIM: To investigate the feasibility of Krypton laserinduced choroidal neovasculation (CNV) model in the Brown Norway rats.METHODS: One eye

4、 of 32 rats received a series of 20 spots of laser irradiation (659nm, 360mW, 50m, 0.05s), the other eye were as controls. CNV was evaluated by fundus fluorescein angiography (FFA), high molecular weight FITCDextran (MW 2106) for high resolution angiography in RPEchoroidsclera flat mounts, and histo

5、pathologic examination was performed in 7, 14, 21 and 28 days after photocoagulation. RESULTS: CNV was firstly appeared on day 7 after photocoagulation, reaching the peak on day 21, no significant progress occurred in 1428 days. The fluorescein leakage and the thickness of laserinduced CNV were incr

6、eased from day 7 to day 21, were decreased in day 28. CONCLUSION: The Krypton laser induced model of CNV in the pigment rats may be useful, and the quantitative analysis of FFA and the thickness of CNV are useful for in vivo studies of angiogenesis and its modulation via various therapy.KEYWORDS: Kr

7、ypton laser; choroidal neovasculation; animal model0引言 脈絡(luò)膜新生血管（choroidal neovascularization, CNV）又稱視網(wǎng)膜下新生血管（subretinal neovascularization, SRNV），是導(dǎo)致年齡相關(guān)性黃斑變性、中心性滲出性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變和高度近視等多種眼底疾病視力喪失的主要原因。探討CNV的發(fā)病機制與有效治療是目前國內(nèi)外學(xué)者的研究熱點。我們應(yīng)用659nm氪激光光凝棕色挪威（brown norway, BN）大鼠視網(wǎng)膜，旨在建立一種可行的CNV模型，并采用幾種常見的評價CNV變化的觀察手段

8、對該模型進行評估，以探討CNV生成及變化情況。1材料和方法1.1材料清潔級BN大鼠32只，911周齡，體質(zhì)量200250g，雄性，由北京維通利華實驗動物有限公司提供。實驗前雙眼前節(jié)和眼底檢查均正常。鹽酸奧布卡因滴眼液（商品名倍諾喜，日本參天制藥株式會社），復(fù)方托吡卡胺滴眼液(北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司)，100g/L水合氯醛溶液(解放軍總醫(yī)院)；10g/L甲基纖維素滴眼液(解放軍總醫(yī)院)；200g/L熒光素鈉注射液 (廣西梧州制藥股份有限公司)；兔抗因子多克隆抗體(福州邁新公司)；SP試劑盒及AEC顯色試劑盒（福州邁新公司）；異硫銀酸熒光素葡聚糖(上海聯(lián)合利華公司)。氪激光機(美國Coh

9、erent公司，型號為Novua 2000)；共焦激光眼底血管造影儀(德國Heideberg公司)；光學(xué)顯微鏡 (德國Leica公司，MPS 30)；激光共焦熒光顯微鏡(美國Bio Rad公司，MRA/2型，配置日本Nikon公司E600熒光顯撇鏡)。1.2方法實驗前 15min大鼠100g/L水合氯醛溶液3.5mL/kg行ip，雙眼復(fù)方托吡卡胺散瞳。大鼠實驗眼結(jié)膜囊內(nèi)滴適量倍諾喜、10g/L甲基纖維素后，眼前放置一53.00D的接觸鏡，用波長為659nm氪激光光凝視網(wǎng)膜，光斑能量輸出功率360mW，直徑50m，曝光時間0.05s，距視盤1.52.0PD處、避開血管、環(huán)繞視盤光凝2排，以光凝后

10、有氣泡產(chǎn)生或伴有輕度出血（有時伴有輕響）標志擊破Bruch膜，記為有效點。共20個激光斑。按隨機數(shù)字分為氪激光光凝視網(wǎng)膜后7，14，21和28d共4組，每組8只大鼠。右眼為實驗眼，左眼為對照眼。1.2.1熒光素眼底血管造影麻醉等準備工作同前。分別于光凝后7，14, 21和28d，將100g/L熒光素鈉1mL/kg ip，行眼底熒光血管造影(fundus fluorescence angiography，F(xiàn)FA )檢查。1.2.2脈絡(luò)膜血管鋪片檢查分別于光凝后7，14，21和28d各取1只大鼠，100g/L水合氯醛麻醉大鼠后，將大鼠仰臥位固定，于胸骨中線左側(cè)23mm剖開胸腔，防止過多出血。迅速剪

11、開肋骨，打開橫隔膜，暴露心臟。小心將23號頭皮針刺入左心室，剪開右心房排液，緩慢但持續(xù)經(jīng)心臟注入含肝素鈉生理鹽水10mL，此后，改為0.1mol/L PBS (pH7.4)灌注，當多數(shù)血液已流出、流出液不見血色(約300mL/kg)后，改成用FITCD乳酸鹽林格氏液20mL(內(nèi)含F(xiàn)ITCD 100mg，明膠2g)緩慢灌流固定大鼠。大鼠四肢及尾部出現(xiàn)肌肉顫動，表示灌流成功。灌流結(jié)束時，大鼠僵硬。摘除眼球后避光置于冰塊冷凍10min，此后避光保存固定于40g/L的多聚甲醛中1h，顯微鏡下沿赤道部打開眼球，去除眼前節(jié)，小心揭除神經(jīng)視網(wǎng)膜層，獲得視網(wǎng)膜色素上皮層（RPE）一脈絡(luò)膜一鞏膜復(fù)合體標本，做4

12、6條放射狀切開后將RPE面向上放置在載玻片上。乙醇脫水，二甲苯透明。利用激光共焦熒光顯微鏡對RPE脈絡(luò)膜一鞏膜復(fù)合體進行觀察和測量。以488nm激光激發(fā)樣品，收集530nm熒光信號。計算機采集數(shù)字圖像（軟件Laser Scanning Microscope Fluoview Version 4.3）。1.2.3病理學(xué)檢查大鼠于FFA檢查后2d過量麻醉處死，立即摘除眼球，置于40g/L多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定24h。經(jīng)梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，平行于角膜至視盤的矢狀位連續(xù)4m切片切至激光斑處。常規(guī)HE染色。因子相關(guān)抗原免疫組織化學(xué)檢測按試劑盒說明書進行，采用SP法染色，AEC顯色，經(jīng)蘇

13、木素復(fù)染后封片。兔抗人因子多克隆抗體的工作濃度為150。著色部位為胞質(zhì)呈紫紅色染色。1.2.4 CNV判定取造影晚期像（FFA5min）觀察CNV形成滲漏情況。計算機圖像分析系統(tǒng)計算每個時間點CNV的熒光素滲漏積分面積。CNV厚度通過光鏡200倍視野下取連續(xù)切片中CNV區(qū)域內(nèi)色素上皮層至視網(wǎng)膜內(nèi)最高點的最大距離，每個時間點取20張切片進行測量，取平均值。 統(tǒng)計學(xué)分析：ImagePro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對FFA熒光素滲漏、脈絡(luò)膜鋪片CNV面積和厚度進行測量。所得數(shù)據(jù)用均數(shù)標準差 (s)表示。采用 SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包對數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗、方差齊性檢驗后用單因素方差分析的方法，

14、其均數(shù)的兩兩比較用SNK檢驗，P0.05為有顯著性意義。2結(jié)果2.1眼底彩照和FFA觀察氪激光光凝BN大鼠視網(wǎng)膜時，光凝斑中央可見氣泡形成，光凝后即刻光凝斑部呈強濃白，外圍灰圈，視網(wǎng)膜水腫 (圖1A)。有時視網(wǎng)膜內(nèi)層或視網(wǎng)膜下少量出血。正常BN大鼠FFA，視網(wǎng)膜血管充盈呈放射狀，脈絡(luò)膜血管充盈并融合成彌漫的背景熒光，無熒光素滲漏。光凝后 7d，光凝區(qū)FFA早期即出現(xiàn)熒光素滲漏，晚期滲漏呈圓盤狀 (圖1B)。光凝后 14d，光凝區(qū)可見熒光素滲漏增加。光凝后 21d，光凝區(qū)可見更多的熒光素滲漏，熒光強度也進一步加強達高峰(圖1C)。光凝后28d，熒光素滲漏程度與21d相比略有減少。7d時CNV滲漏

15、面積為38674.8，為最少；21d時為91457.19，達高峰。光凝后7d與14，21和28d相比差異有顯著性意義(P0.05，表1)。表1 光凝后不同時間熒光素滲漏面積和CNV厚度（略）2.2脈絡(luò)膜血管鋪片觀察激光共焦掃描顯微鏡下見光凝后7d在光凝斑邊緣及光凝斑中心的深部脈絡(luò)膜血管可見FITC顯影（圖2A），光凝后21d見光凝斑深部明顯CNV來源于深部脈絡(luò)膜血管，朝向視網(wǎng)膜神經(jīng)層生長，CNV與周圍的脈絡(luò)膜比較呈網(wǎng)狀高熒光斑（圖2B）。但CNV的面積因背景熒光明顯，故測算不準確。2.3 HE染色結(jié)果正常BN大鼠眼視網(wǎng)膜及脈絡(luò)膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰、完整。實驗眼光凝后7d光斑處RPE層和Bruch

16、膜明顯破壞，外核層破壞或缺損，內(nèi)核層排列紊亂，視網(wǎng)膜水腫，增生細胞自脈絡(luò)膜穿過破損的Bruch膜和RPE層向視網(wǎng)膜內(nèi)層增生，形成早期的CNV，呈紡錘形，CNV厚度為39m，其中可見中性粒細胞、巨噬細胞和遷移增生的RPE細胞（圖3A）。光凝后14d CNV進一步增生，CNV厚度為53m，中性粒細胞和巨噬細胞減少，成纖維細胞和膠原纖維增多，RPE細胞遷移增生包繞新生血管。此后，CNV進一步增生，至21d達到高峰，CNV厚度為55m，但21d時CNV厚度與14和28d相比無明顯變化（圖3B，表1）。2.4 CNV中因子相關(guān)抗原表達因子標記用于顯示血管內(nèi)皮細胞的遷移增生和新生血管的形成。正常視網(wǎng)膜內(nèi)核

17、層微血管及神經(jīng)纖維層大血管、脈絡(luò)膜毛細血管內(nèi)皮細胞可見因子抗原染色呈紫紅色，其他部位無陽性表達。光凝后7d光凝區(qū)視網(wǎng)膜下間隙散在陽性染色細胞（圖4A），光凝后14d光凝區(qū)視網(wǎng)膜下陽性染色細胞逐漸增多至21d時，已經(jīng)可見陽性細胞圍成管腔（圖4B）。3討論 目前，建立CNV動物模型的方法繁多，主要有激光誘導(dǎo)、生長因子誘導(dǎo)、炎癥誘導(dǎo)、缺氧誘導(dǎo)、氧化損傷誘導(dǎo)和手術(shù)誘導(dǎo)的在體動物模型及脈絡(luò)膜植片體外培養(yǎng)的離體動物模型。這些動物模型各有其優(yōu)缺點，但尚無一種模型可以完全模擬人類CNV的發(fā)展過程1,2。通過高能量激光光凝視網(wǎng)膜，隨后發(fā)生損傷修復(fù)反應(yīng)，光凝區(qū)內(nèi)CNV形成，是目前國內(nèi)外普遍使用的CNV動物模型，經(jīng)

18、常用于觀察血管生長因子的表達水平、研究基因敲除特異性基因的作用、評價抑制劑和藥物以及光動力療法等對CNV的治療效果等35。但是，激光器的種類不同，使用的參數(shù)亦有不同。既往曾有人使用氪激光（647nm），參數(shù)為光斑能量輸出功率250mW，直徑50m，曝光時間0.05s，在距視盤1.52.0PD處，避開血管，環(huán)繞視盤光凝1排10點成功誘發(fā)出小鼠CNV模型1，本實驗考慮到大鼠視網(wǎng)膜面積較小鼠大、視網(wǎng)膜神經(jīng)纖維層厚度較小鼠厚，將原參數(shù)光斑能量輸出由250mW更改為360mW，將原光凝10點改為環(huán)繞視盤光凝2排（20點）亦成功誘發(fā)出BN大鼠的CNV模型，該模型同其他激光器誘發(fā)出的CNV大鼠模型在FFA滲

19、漏發(fā)生、CNV厚度變化等情況一致6，可以作為理想的動物模型做進一步的中藥干預(yù)觀察研究；而且該模型在7d后即有CNV形成，滲漏高峰在1428d，成模速度快、維持時間較長且穩(wěn)定，且該模型將激光點數(shù)增加，使樣本量加倍，更有利于病理切片的制備，更利于相關(guān)指標的測算。觀察評價CNV的方法主要有活體的影像學(xué)檢查和組織病理學(xué)檢查?；铙w的影像學(xué)檢查主要有FFA、吲哚氰綠血管造影（ICGA）、光學(xué)相干斷層掃描（OCT）觀察等。FFA是用來動態(tài)監(jiān)測CNV形成過程的主要手段，是較組織學(xué)方法快速和簡便的觀察手段。新生血管在造影早期就出現(xiàn)熒光，晚期伴有熒光素滲漏，根據(jù)熒光素滲漏程度可判斷CNV形成的大小。ICGA與FF

20、A顯示的CNV病變部位一致，對黑色素、出血及滲出物的穿透力更強，但熒光效應(yīng)弱，為熒光素鈉的1/25，顯示的圖像沒有FFA清晰，故本文僅選擇了FFA作為觀察CNV的指標，但應(yīng)注意FFA上的熒光滲漏與真正的血管滲漏之間的關(guān)系不清楚，只能作為間接反映CNV滲漏的指標，組織學(xué)方法才是判斷CNV形成的“金標準”。OCT檢查由于鼠眼較小，操作困難，故未采用。FITC右旋糖酐標記CNV的技術(shù)原理為高相對分子量的FITC右旋糖酐（2106）固定后能滯留在血管內(nèi)，F(xiàn)ITC可被激光激發(fā)表現(xiàn)出綠色熒光從而標記出CNV，該方法可以成功標記缺氧誘導(dǎo)的鼠血管增生性視網(wǎng)膜病變模型中視網(wǎng)膜鋪片上的新生血管7。后來，這種方法被

21、Edelman等3證實，可以用于評估CNV。但是，在我們的實驗中發(fā)現(xiàn)該方法不穩(wěn)定，有的圖片可以清晰辨認CNV（圖4B），有的圖片在光凝斑處未見到CNV，卻有明顯的背景熒光遮蔽（可能是光凝造成的組織損傷形成的脂褐素樣物質(zhì)發(fā)出的自發(fā)熒光造成的），因此，CNV的面積測量不夠準確，在實驗中僅將其作為一形態(tài)學(xué)指標加以描述，未計入統(tǒng)計學(xué)分析。組織學(xué)方法需要大樣本，可以利用光鏡、電鏡、熒光顯微鏡及共聚焦顯微鏡從不同水平觀察。我們選擇HE染色大體觀察CNV的大小，通過每眼連續(xù)切片中直徑最大和中央厚度最大的切片作為對該眼CNV評價的指標，經(jīng)統(tǒng)計分析與楊秀梅等8的結(jié)果一致，說明該動物模型具有良好的可重復(fù)性，而且，進一步通過因子抗原標記血管內(nèi)皮細胞，證實確有CNV形成，下一步擬通過大樣本因子抗原標記物的累積光密度分析看CNV的密度變化情況。我們發(fā)現(xiàn)，盡管28d與7，14d相比，F(xiàn)FA滲漏面積和CNV厚度無統(tǒng)計學(xué)差異，但與其他學(xué)者6,8的研究結(jié)果不一致，28d已經(jīng)表現(xiàn)出下降的趨勢，考慮與光凝20點后誘發(fā)更為強烈的損傷反應(yīng)，使隨后的愈合反應(yīng)加速進行有關(guān)。因此，為避免自發(fā)的創(chuàng)傷愈合反應(yīng)對實驗結(jié)果的影響，我們將觀察周期截止至28d。 總之，氪激光誘導(dǎo)的BN大鼠模型是一有效的CNV模型，因子