禽流感實驗室檢測方法

1、禽流感實驗室檢測方法一、標本的采集與處理(一)標本的采集1、病毒分離標本的采集病毒分離成功與否很大程度上取決于采集標本的質量，及其保存、運輸?shù)拳h(huán)節(jié)。多數(shù)標本取自患者上呼吸道鼻咽腔，其次為氣管和支氣管分泌物，有時也采用肺活檢材料等。標本采集后應立即放入適當?shù)牟蓸右褐械蜏乇４?，常用的采樣液為：普通肉湯，pH7.4-7.6的Hank's、Eagle's或水解乳蛋白液。為防止細菌和真菌生長，在采樣液中需加入抗菌素，以往抗菌素多用青、鏈霉素，近來發(fā)現(xiàn)不少種類細菌對它們具有耐藥性，故近來多用慶大霉素（其終濃度為每ml采樣液中加入0.1 ml的10mg/ml）和抗真菌藥物（終濃度為每毫升采樣

2、液中加入0.008 ml的250ug/ ml）。主要的采集方法有以下幾種：1)鼻拭子：將棉簽輕輕插入鼻道內鼻腭處，停留片刻后緩慢轉動退出。以同一拭子拭兩側鼻孔。將棉簽浸入4-5 ml采樣液中，尾部棄去。2)咽拭子：用棉簽擦拭雙側咽扁桃體及咽后壁，同樣將棉簽頭浸入4-5 ml采樣液中，尾部棄去。注：亦可將鼻、咽拭子收集于同一采樣管中，以便提高分離率，減少工作量。3)鼻咽抽取物：用與負壓泵相連的收集器（國外有售）從鼻咽部抽取粘液。先將收集器頭部插入鼻腔，接通負壓，旋轉收集器頭部并緩慢退出。收集抽取的粘液，并用采樣液涮洗收集器3次。由于該收集器國內難買到，也可采用國內一種設計裝置（見郭元吉、程小雯著

3、，流行性感冒病毒及其實驗技術。中國三峽出版社P186，1997）。4)鼻洗液：患者取坐姿，頭微后仰，用移液管將1-1.5ml洗液注入一側鼻孔，囑患者同時發(fā)K音以關閉咽腔。然后讓患者低頭使洗液流出，用平皿或燒杯收集洗液。重復此過程數(shù)次。洗兩側鼻孔最多可用10-15 ml洗液。5)漱口液：用10 ml洗液漱口。漱時讓患者頭部微后仰，發(fā)“噢聲”，讓洗液在咽部轉動。然后，用平皿或燒杯收集洗液。注：取鼻洗液和漱口液時，需預先了解患者是否對抗菌素有過敏史，如有則洗液和含漱液中不應含有抗菌素。2、血清標本采集血清標本應包括急性期和恢復期雙份血清。急性期血樣應盡早采集，最遲不超過發(fā)病后7天?；謴推谘獦討诎l(fā)病

4、后2-4周采集。單份血清一般不能用作診斷。血液標本2000-2500rpm離心15min。收集血清，棄血凝塊。血清可在4存放一周，長期保存置-20。(二)標本運送標本應在低溫下，24小時內運送至實驗室。標本至實驗室后，病毒分離標本應盡快進行接種分離，48h內能進行接種的可置于4保存，如未能接種應置-70或以下保存。血清標本可在4存放一周，長期保存置-20或以下。(三)標本處理標本至實驗室后，含棉拭子的標本，先將棉拭子在管壁反復擠壓后取出。鼻腔或咽部洗液，用手將裝標本的管充分振蕩，將粘液打碎。置4待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接種或低溫保存。鼻咽漱液或抽取液：用無菌毛細

5、吸管，在無菌條件下反復吹打收集的溶液，以便打碎粘液，同樣置4待其自然沉淀5-10min，取上清5 ml。上清液可直接接種或低溫保存。注：如采樣液中尚未加抗菌素，應在接種前補加，用量同前，混勻后置4 1-2h后方可接種。二、病毒分離病毒分離是流感診斷最常用和最可靠的方法之一。多用雞胚來分離流感病毒。近來隨著分子生物學技術的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)通過雞胚所分離到的流感病毒，其抗原性與原始標本的有所不同，而通過MDCK細胞分離出的，其抗原性與原始標本的相似。另外由于“O”相毒株的重現(xiàn)，MDCK等一些細胞對“O”相毒株的敏感性大大超出雞胚的敏感性。因此，MDCK等一些細胞已成為流感病毒分離不可缺少的一種宿主系統(tǒng)。

6、MDCK分離的病毒在很多國家尚未批準用于疫苗生產，因此在病毒分離時同時采用雞胚和MDCK細胞兩套系統(tǒng)。流感病毒“O”相毒株不凝集雞紅細胞，故近來在流感病毒鑒定中常用豚鼠或人紅細胞來代替。然而，該兩種細胞無細胞核，沉積慢，一般在紅細胞凝集及凝集抑制測定中需60分鐘才能觀察結果，同時在“U”型孔板中，很難沉積成像眼淚樣的點即當中常有小空洞。(一) MDCK細胞分離1、實驗材料 MDCK細胞 Eagle氏培養(yǎng)液 Hank's溶液 0.25%胰酶和Versene消化液 雙抗（青、鏈霉素）或慶大霉素和抗真菌素 胎?；蛐∨Ｑ?5.6%或7.5%的NaHCO3 細胞培養(yǎng)液配制 每500 ml Ea

7、gle's 液加： 終濃度 雙抗 5 ml 100U/ml青霉素 100ug/ml鏈霉素 胎牛或小牛血清 0.1-0.15ml/ml 使用前用NaHCO3 將pH調至7.4-7.6。 細胞維持液配制 同培養(yǎng)液，但不含胎?；蛐∨Ｑ?，而含終濃度為2-3 ug/ ml 胰酶，用前用NaHCO3 將pH調至7.6-7.7。注：目前市場上出售已配好的Eagle's試劑有兩種：一種已含有谷氨酰胺，另一種不含。如不含，配工作液時需補加。2、病毒接種和收獲1)      在低倍光學顯微鏡下檢查MDCK細胞生長狀態(tài)。2)  

8、    成片的細胞棄生長液，用Hank's液洗兩遍，將殘余的牛血清洗凈，因牛血清中含有流感病毒非特異性抑制素，會影響流感病毒的復制。3)      每瓶加入接種標本0.5-1.0 ml，輕搖細胞瓶，使標本完全覆蓋細胞，置35吸附1-2h。4)      倒掉感染液，再用Hank's液洗1-2遍，每瓶加入3 ml維持液，置35培養(yǎng)。5)      次日起每天檢查有無細胞病變（CPE）。CPE特征為：細胞

9、腫脹圓化，細胞間隙增大，細胞核固縮或碎裂，嚴重時細胞部分或全部脫落。6)      收獲及紅細胞凝集活性（HA）檢查當CPE出現(xiàn)+ +號時進行收獲，收獲之前也可將細胞凍融1-2次來提高收獲標本的病毒滴度。由于無法證實CPE就是流感病毒所造成。最后還得看維持液中是否有紅細胞凝集活性（HA）。用毛細吸管取維持液3-4滴，放入血凝板孔中，而后加入等容量的1%豚鼠或人紅細胞，輕搖混之，置室溫或4，1h后觀察結果。出現(xiàn)紅細胞凝集的為陽性標本，收獲所有維持液進行病毒鑒定，也可暫冰存之。有時將收獲的維持液，離心棄沉渣，上清中加適量無菌甘油或明膠或1%牛血清白

10、蛋白凍存之。由于維持液中無牛血清，同時含一定量的胰酶和NaHCO3，故不應在4保存，否則易造成HA活性丟失和pH變高。如有清晰的CPE，但HA陰性應進行盲傳。注：維持液中加適量胰酶的目的是為了提高流感病毒在細胞中的復制能力。絕大多數(shù)流感病毒只有血凝素（H）是裂解型的才具有感染性。細胞培養(yǎng)不像雞胚，它的維持液中不含有蛋白水解酶，無法將病毒粒非裂解型的HA0 變成裂解型的HA1+HA2。故必須在維持液中加入適量的胰酶。CPE出現(xiàn)時間隨感染病毒的型別，甚至毒株的差異以及感染量的大小而異。一般標本接種后7天還不出CPE，維持液中又查不出HA活性，可認為陰性標本，棄之。7）傳代及盲傳如收獲的維持液HA滴

11、度不高或量不夠用于鑒定，需在MDCK細胞或雞胚中傳代，把HA滴度提高或量增多。如HA可疑，細胞CPE清晰，此時應在MDCK細胞上盲傳一代，如仍測不出HA，可認為是陰性。如仍有清晰的CPE并能排除細菌所引起也可認為是非流感病毒。3、MDCK細胞傳代(1)         把需用的溶液置室溫或37水浴中預熱。(2)         已成片的MDCK細胞，將其生長液倒掉。(3)     

12、60;   把Versene與0.25%胰酶按7：1比例配成消化液，每小瓶加入消化液3 ml（加入量應根據瓶大小不同而異）。(4)         置37恒溫箱5-10min，在此期間應在光學顯微鏡下觀察1-2次，當細胞變圓，細胞與細胞間互不相聯(lián)，表明消化時間已到。如細胞仍連成片，表明消化時間未到。但千萬不可消化時間過長，造成大量細胞從瓶壁上脫下，甚至造成破碎。(5)         倒掉消化液，每瓶加入9 ml培養(yǎng)

13、液，用毛細吸管將瓶壁上細胞輕輕吹下吹散。(6)         吸出6 ml接種2小瓶，3 ml/瓶，將原瓶留下，置37恒溫箱培養(yǎng)。(7)         一般情況下，1瓶細胞傳3瓶，如細胞急用，可一傳二。不急用，可一傳四等。有時為了控制細胞的代數(shù)，可一傳八，這樣一星期傳一代就可以了。一般情況每2-3天需傳一代。4、MDCK細胞保存及復蘇MDCK細胞對流感病毒的敏感性隨其代數(shù)增加而下降，故各實驗室應使用液氮凍存代數(shù)較低的細胞作為種子。一

14、般保存液為含10%二甲基亞砜和90%小牛血清。（1）MDCK細胞保存將單層細胞消化分散成為單細胞；加入0.9 ml小牛血清和0.1 ml二甲基亞砜；相混收集于保存小管中；緩慢凍存：放42h，轉放-202h，再轉放液氮中長期保存，也可置-70短期保存。（2）MDCK細胞復蘇細胞凍存管從液氮罐取出后，速放37水浴溶化，溶化后加入3 ml培養(yǎng)液，混均后加入細胞培養(yǎng)瓶中，置37CO2孵箱培養(yǎng)。（3）MDCK細胞對流感病毒敏感性測試前面提到MDCK細胞對病毒的敏感性隨其代數(shù)增加而下降。故MDCK細胞在實驗室傳20代以上時，一般需測試一下其對流感病毒的敏感性。其具體測試方法：選一株對MDCK細胞較敏感的流

15、感病毒株，最好為當前在人群中流行的甲型流感病毒。在同一條件下，用早代與要測試的MDCK細胞對其進行TCID50測定。如果測試的TCID50比早代的低2個或以上Lg，表明其對病毒的敏感性已下降，不應繼續(xù)使用；如果兩者相差不超出一個Lg，表明可繼續(xù)使用。(二)雞胚分離及HA測定1、實驗材料·9-11日胚齡雞胚及驗蛋器。禽流感分離時，必需用SPF雞胚。·2.5%碘酒和75%酒精及液體石蠟。·鉆孔器，蠟和膠布及照卵燈。·1 ml注射器和針頭。·鑷子，毛細吸管，橡皮乳頭，試管架，試管。·采集的標本。2、實驗步驟(1)接種（羊膜腔和尿囊腔接種即雙

16、腔法）。1)接種前先用驗蛋器檢查雞胚，棄去死胚，未受精卵及不健康的雞胚。畫出氣室邊緣和胚胎位置。2)在氣室端靠近胚胎側之卵殼上鉆一長方形裂痕（約10×6mm）或兩條相隔3 mm的10 mm長的平行裂痕，勿損傷殼膜。3)鉆口處用75%酒精消毒，用消毒過鑷子除去長方形卵殼和殼膜外層（壁層）或將平行裂痕撕成長方形。4)從孔中滴入一滴無菌的液體石蠟，然后，輕輕晃動雞胚，讓液體石蠟在殼膜內層（臟層）鋪開，此時在照卵燈下即可清晰地看到雞胚的位置。5)注射器吸取處理過的標本0.4 ml，將注射針頭刺入胚胎的顎下胸前，用針頭輕輕撥動下顎和腿，當針頭進入羊膜腔時，能見到雞胚隨著針頭的撥動而動，此時可注

17、入0.1-0.2ml接種物，而后，將針頭退出至尿囊腔再注射0.1-0.2ml接種物。6)注射器取出，用沾有碘酒通過火焰的小塊膠布封口。7)置35恒溫箱孵育72h。(2)收獲1)收獲前先將雞胚移至4過夜，或置-20冷凍1h?？焖倮鋬鰰r間不易過長，一旦雞胚凍成冰塊就無法收獲。4冷藏也不宜過長，過長易造成散黃，影響收獲。2)75%酒精消毒雞胚氣室部分。3)用無菌鑷子將消毒過的殼打碎，再用另一把無菌鑷子將殼膜和絨毛尿囊膜撕開，并將雞胚輕輕推向一側，壓住。4)用毛細吸管先收尿囊液，然后左手持小鑷子夾起羊膜成傘狀，右手用毛細吸管插入羊膜腔吸取羊水，平均每胚可收獲0.5-1.0 ml羊水。如羊水過少，可用同

18、胚少量尿囊液沖洗羊膜腔并吸取洗液。(3)HA活性測定尿囊液和羊水分別取3-4滴于血凝板孔中，加等容量1 %豚鼠或人紅細胞，搖勻，置室溫或4 1h，而后觀察結果。HA陽性標本須進行鑒定。標本可置4保存3-4天，長期保存應置-70或以下低溫凍存。(4)傳代與盲傳HA滴度過低或收獲的量過少（如羊水），應按上法進行傳代來獲得足夠量的病毒。HA測定可疑的標本應按同法盲傳一代，如再陰性，可認為陰性，棄之。一般流感監(jiān)測中，每份標本可只接種2-3個雞胚，當羊水和尿囊液中查不到HA活性，可認為陰性標本，不必進行盲傳。三、病毒鑒定至今對流感病毒鑒定最常用的方法為紅細胞凝集抑制（HI）測定，因該法簡便、易行、結果可

19、信。HI試驗分常量法和微量法兩種。微量HI法是目前國際普遍使用的方法，也是WHO流感監(jiān)測中推薦使用的標準方法。HI試驗的原理是流感病毒表面具有的血凝素蛋白能和含有唾液酸的受體物質特異結合，紅血球漿膜上含有這類物質，當一定量病毒和適當比例的紅血球混合后發(fā)生凝集，此為血凝現(xiàn)象。而用流感病毒特異性抗體和病毒作用，干擾了病毒和紅血球的結合從而抑制了血凝，此為血凝抑制現(xiàn)象。這就是傳統(tǒng)流感病毒的鑒定的理論依據。微量HI法實驗步驟如下：(一)實驗材料1、分離培養(yǎng)物（標本）2、標準血清 常規(guī)鑒定用, 包括甲1、甲3和乙型流感代表株的至少3種抗體；3、紅血球 0.5%雞紅細胞或.75%豚鼠紅細胞4、受體破壞酶（

20、RDE）5、PBS或生理鹽水6、96孔微量板7、可調多通道移液器和單通道移液器及滴頭8、其他水浴箱等(二)HI試驗操作過程1、加PBS或生理鹽水25l于96孔板的第B行至H行的每一孔。2、加1:10稀釋的經受體破壞酶處理過的標準血清50l于A行的每一孔。3、用多通道移液器從A行各孔取25l血清，倍比稀釋至H排各孔，棄去25l。4、25l被檢病毒的4個血凝單位抗原加至各孔，混勻，室溫靜置15-30min，5、然后加50l的紅血球（0.5%雞紅細胞或0.75%豚鼠紅細胞），6、室溫靜置30-60min（雞血球30min；豚鼠血球60min）后觀察結果。結果判定 血凝被完全抑制的血清最大稀釋度的倒數(shù)

21、為血凝抑制試驗的終點，該孔稀釋度即為HI試驗的效價。受體破壞酶處理血清目的是去除非特異性血凝抑制素。因為人和動物血清中存在非特異性血凝抑制素，它們是游離在血清中類似病毒受體的唾液酸殘基，能與病毒血凝素分子上的受體結合，會競爭抑制病毒與紅血球的結合，因而造成假陽性，因此HI試驗必須用受體破壞酶處理血清。具體操作如下：1、3體積的RDE，1體積的血清（0.3ml RDE : 0.1ml血清）混合。2、37水浴過夜。3、56 30min失活。4、加入6體積的PBS或生理鹽水混合，使血清稀釋為1:10備用。或者按4:1處理后，倍比稀釋為1:10備用。去除非特異性凝集素處理過的血清可能與紅細胞發(fā)生非特異

22、性凝集。如血清中存在非特異性凝集，按下述方法處理：1、用1體積的紅細胞和20體積的RDE處理過的血清充分混勻。2、擱置4 1小時，其間使沉降紅細胞再懸浮、混勻。3、900 X g 5min離心。4、取上清，反復上述操作直至血清與紅細胞的吸附陰性為止。 4個血凝單位抗原的調制病毒培養(yǎng)陽性的標本首先確定其HA滴度，在此基礎上調制4個血凝單位抗原，用于HI 試驗。HA測定和4個血凝單位抗原的調制方法如下:1、HA測定1）50l的PBS或鹽水加入96孔微量板A-H行的2-12孔。2）被檢病毒各50l分別加入A-H行的第一孔，然后倍比稀釋至第11孔，棄去50l，12孔為陰性對照。3）加50l的紅細胞于每

23、一孔，注意從低濃度至高濃度加入。4）混勻、室溫靜止30min（雞血）或60min（豚鼠血）。5）確定HA滴度。判定：完全血凝的最高稀釋度的倒數(shù)為血凝滴度。完全凝集為+，不完全凝集+/-，無凝集為-。2、4個血凝單位的調制和再確認（復核）(1)調制4個血凝單位1個血凝單位指能引起等量紅細胞凝集的病毒量。HI滴度是基于此測定的。試驗中需調制 4個血凝單位,首先根據HA滴度，用8除其商為8個血凝單位的稀釋度。如某待檢病毒的HA滴度為160，除8等于20。即1:20（某標準參比抗原病毒0.1ml 加 1.9ml PBS）稀釋病毒即得到8個血凝單位。注意HI試驗所需4個血凝單位指25l病毒含4個血凝單位

24、，而第二步確定所稀釋病毒是否為4個血凝單位的HA試驗用50l體系，所以先調制為8個血凝單位。確認4個血凝單位試驗的具體操作如下：1）50l的PBS或鹽水加入96孔板的第2-12孔。2）調制的8個血凝單位抗原100l加入第一孔，然后倍比稀釋至第6孔棄去50l。3）各孔加紅血球50l混勻，視血球的不同靜置 30-60min觀察結果。(2)結果判定若第1、2、3、4孔完全凝集，第5孔不凝集，表明該稀釋病毒準確，可用于HAI試驗。如果第5孔也完全凝集說明該50l病毒含16個血凝單位，需等量稀釋病毒，如果只有前3孔凝集，說明該50l病毒含4個血凝單位，病毒量需加倍。另外，注意4個血凝單位須每次用前新鮮配

25、制。HI試驗鑒定未知病毒時注意事項1、正確選用96孔微量板，根據所用紅血球不同來決定，雞血球選用V型板，豚鼠、人血球用U型板。2、紅血球的濃度和4個血凝單位的正確調制。3、標準參比血清應包括疫苗株和代表株的。4、孵育時間不宜過長，因為有些病毒的血凝現(xiàn)象因病毒游離而很快消失。5、由于流感病毒不同亞型間有交叉反應，判定結果時要注意。如試驗用4種標準血清，待檢病毒只能被甲3抗血清抑制，抗體效價為80，其他血清皆不抑制，那么，該鑒定病毒為甲3型流感病毒，HI效價為80。如果7待檢病毒被甲3抗血清抑制，效價40，甲1抗血清抑制，效價320，其高出甲3抗血清效價4倍以上，故該待檢病毒判定為甲1型流感病毒。

26、標準參照血清對分離物的抑制效價20才可判斷為陽性。若標準參照血清對分離物的抑制效價均<20，速將分離物送國家流感中心進一步鑒定。6、鑒定未知病毒時對照應有紅細胞、陰性血清對照、標準血清對照。HI試驗不適用于流感的早期診斷，但在不能分離病毒或病毒分離陰性時，檢測病人的急性期和恢復期雙份血清有助于近期感染的診斷，即如恢復期血清抗體效價（滴度）高于急性期血清抗體效價4倍確診可成立。(三)世界衛(wèi)生組織（WHO）甲5型（H5）流感病毒鑒定試劑盒的使用1、血凝抑制試驗（HAI）試劑（1）滅活甲5型（H5）病毒抗原 10ml（2）凍干抗甲5型（H5）病毒A/Tern/S.Africa/61（H5N3）

27、羊血清（3）凍干抗甲5型（H5）病毒A/Goose/Hong Kong/4374/99（H5N1）雞血清任何無法用WHO200203普通流感試劑盒鑒定的毒株須用本試劑盒提供的抗甲5型（H5）病毒血清進行鑒定，如果發(fā)現(xiàn)甲5型病毒（只能被抗甲5型（H5）病毒血清抑制而不被抗甲1或抗甲3病毒血清抑制的甲型流感病毒），須立即上報國家流感中心，WHO總部或任一WHO流感協(xié)作中心。2、霍亂濾液（RDE）處理標準抗血清去除非特異性抑制素（可用WHO普通流感試劑盒提供的RDE）（1）用1ml蒸餾水溶解凍干甲5型（H5）病毒抗血清，溶解后的血清可于-20或-70保存。（2）用25ml無菌生理鹽水溶解RDE，分裝

28、包存。（4）56水浴加熱30分種以滅活RDE。（5）待冷卻至室溫后加6份（0.6ml）生理鹽水混合。經RDE處理后血清已1：10稀釋，1ml處理過的血清可檢測20份病毒。3、紅細胞吸附去除血清非特異性凝集素（1）20份經RDE處理的血清加1份洗滌后沉淀的紅細胞，混勻。（2）置4冰箱1小時，其間不時搖動混合。（3）離心沉淀紅細胞（900g，5分鐘）（4）小心吸取上層血清待用。4、血凝試驗（HA）檢測標準抗原及待檢病毒滴度（1）根據所用紅細胞選擇適當96孔微量板（如用豚鼠或人O型紅細胞時，應選用孔底呈U型的微量板，如用火雞或雞紅細胞時，應用孔底呈V型的微量板）。微量板橫向放置：垂直方向稱列，如孔A

29、1H1稱第1列；水平方向稱行，如A1A12稱A行。（2）除第1列外（A1H1），每孔加50l PBS（0.01M, pH 7.2）（3）A1G1每孔各加100l標準抗原或待檢病毒，H1加50l PBS作陰性對照。（4）用多孔加樣器從第1列各孔分別取50l抗原，由第1至第12列做對倍稀釋，最后1列棄去50l。（5）每孔加50l紅細胞，輕彈微量板，使細胞與病毒充分混合。（6）室溫孵育3060分鐘，觀察血凝現(xiàn)象并記錄結果。紅細胞凝集以“+”記錄，只有部分凝集為“+/”，無凝集為“0”，出現(xiàn)全部紅細胞凝集的最高稀釋度為終點，該稀釋度的倒數(shù)即是病毒的血凝滴度。5、制備4個血凝單位的抗原（1）首先計算血凝

30、抑制試驗所需每個抗原的用量，如1份血清作8孔稀釋，每孔用25l，那么測定1份血清需0.2ml抗原。（2）其次計算出病毒稀釋度，用病毒的血凝滴度除8，商即為獲得4個血凝單位的稀釋度。如某病毒的血凝滴度為160，除8等于20。那么1:20稀釋該病毒即可得到4個血凝單位。（3）為了保證血凝抑制試驗中抗原量一致并準確無誤，新配制的4個血凝單位的抗原須復核滴定：取50l 4個血凝單位的抗原，用等量PBS做對倍稀釋。每孔加50l紅細胞，混合后室溫孵育3060分鐘觀察血凝。如只有前4孔出現(xiàn)血凝，說明該病毒稀釋準確（即每50l含8個血凝單位的抗原。因為血凝抑制試驗中只用25 ul抗原，故稱4個血凝單位）。如第

31、5孔也出現(xiàn)血凝，說明每50l含16個血凝單位，須等量稀釋。如僅前3孔出現(xiàn)血凝，說明每50l含4個血凝單位，病毒量須加倍。6、血凝抑制試驗（HAI）鑒定待檢病毒（1）根據所用紅細胞選擇適當96孔微量板，每個微量板可檢測兩種抗原。（2）除A行（A1A12）外，每孔加25 Upbs。A6，A7各加50 uPBS。（3）標準抗血清（經RDE處理）抗甲1型（H1N1）血清 WHO普通流感試劑盒提供抗甲3型（H3N2）血清 WHO普通流感試劑盒提供抗甲5型A/Tern/S. America/61（H5N3）羊血清 WHO甲5型（H5）流感鑒定試劑盒提供抗甲5型A/Goose/Hong Kong/437.4

32、/99（H5N1）雞血清 WHO甲5型（H5）流感鑒定試劑盒提供陰性對照血清 WHO流感鑒定試劑盒提供A1A5及A8A12分別各加一種上述標準抗血清，每孔50l。（4）用多孔加樣器從A行各孔分別取25l血清，由A行至H行做對倍稀釋。最后1行棄去25l。（5）A1H5每孔加25l標準或待檢抗原1，（4個血凝單位抗原）A8H12每孔加25l抗原2，（4個血凝單位抗原）輕彈微量板，使血清與病毒充分混合，室溫孵育15分鐘。第6，7兩列（A6H6及A7H7）不加病毒作陰性對照。（6）每孔加50l紅細胞，混勻，室溫孵育3060分鐘觀察血凝抑制結果。當特異性抗體與相應的血凝素抗原結合后，可抑制病毒引起的血凝

33、現(xiàn)象。血凝抑制效價是抑制血凝出現(xiàn)的血清最高稀釋度的倒數(shù)。如1:80稀釋的血清不出現(xiàn)血凝（完全抑制），而1:160稀釋時出現(xiàn)血凝（無血凝抑制），該血清對測定病毒的血凝抑制效價是80。7、血凝抑制試驗結果報告（參考）199798 WHO流感試劑的血凝抑制實驗參比抗原aA(H1N1)bA(H3N2)cA(H5)dA(H5)eNom.1A(H1N1)2A(H3N2)3A/Duck/Potsdam/863 Test Antigens44A/Hong Kong/156/975 A/Hong Kong/483/976 A/Hong Kong/213/035120<10<10 <1

34、0<10<10<1021280<10 <10<10<10<10<10640 12801280640<10<101280 1280640640<10<10<10<10<10<10<10 (1)c號血清是抗A/Tern/S.Africa/61(H5N3)山羊血清，d號血清是抗A/Goose/Hong Kong/437-4/99雞血清。其余均為綿羊血清，血清須經RDE處理。(2)如果血清出現(xiàn)交叉反應，應根據血凝抑制效價相差4倍以上的原則進行鑒定。(3)本

35、試劑盒提供的最新非致病甲5型禽流感病毒滅活抗原。(4)從人分離到的甲5型禽流感病毒。四、流感病毒微量中和實驗技術常用流感病毒血清學方法主要包括：血凝抑制試驗（HI），病毒中和實驗和酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）。它們不僅是病毒診斷的常用方法，而且已經作為基本研究工具廣泛用于病毒流行病學調查、免疫學研究以及疫苗效果評價等領域。血清學方法不適用于流行性感冒的早期診斷，然而，當流感病毒分離結果為陰性時，可用于診斷近期感染。同時檢測病人急性期（發(fā)病數(shù)日內）和恢復期（發(fā)病24周）雙份血清，如恢復期血清抗體效價比急性期升高4倍或>4倍以上即可確立診斷。中和實驗是一種敏感性高，特異性強的血清學方法，用

36、于測定人或動物血清中的病毒特異性中和抗體水平。實驗由兩個階段組成：（1）病毒抗體中和反應階段，即定量病毒與倍比稀釋血清樣品混合，并作用一定時間；（2）病毒抗體混合物孵育階段，即將病毒抗體混合物接種于敏感宿主（組織培養(yǎng)細胞、雞胚或動物），并培養(yǎng)一段時間。中和實驗是以測定病毒的感染力為基礎，人或動物免疫血清中的病毒特異性中和抗體與病毒表面蛋白結合，從而使病毒失去吸附和感染宿主細胞的能力。結果的判定將依據定量病毒受倍比稀釋免疫血清中和后的殘余感染力。中和實驗技術不僅表現(xiàn)在質的方面，即一種病毒或病毒亞型只能被相應的免疫血清所中和，而且表現(xiàn)在量的方面，即中和一定量病毒的感染力需要一定效價的抗體。病毒中和

37、實驗技術是反映機體抵抗特定病毒感染能力的最可靠方法。流感病毒中和實驗技術有以下優(yōu)點：（1）由于中和抗體作用于流感病毒表面血凝素蛋白（HA），使流感病毒失去感染能力，因此，流感病毒中和實驗主要用于檢測血清中的特異性抗血凝素蛋白抗體。（2）流感病毒中和實驗既能檢測病毒株的功能性變化，又能反映機體的抗病毒水平。（3）該方法主要使用感染性病毒，不需要進行病毒或病毒蛋白的純化，因此，可以被迅速用于檢測新病毒或人群免疫狀態(tài)。微量中和實驗技術已被成功應用于檢測血清中抗流感病毒甲5型抗體，并可以推廣用于檢測血清中其它抗禽流感病毒亞型中和抗體水平，其敏感性高于血凝抑制實驗。由于人群中缺乏抗禽流感病毒特異性抗體，

38、因此，檢測單份血清即可反映人群的免疫狀態(tài)。但是當診斷可疑病患時，則需要同時檢測急性期和恢復期雙份血清中的中和抗體滴度，若恢復期血清抗體水平高于急性期（4倍）即可確立診斷。傳統(tǒng)的流感病毒中和實驗主要基于對MDCK細胞病變抑制作用的觀察，既費時又費力。結合感染細胞快速鑒定方法，改進后的中和實驗可以在兩天內完成，并可一次測定大量血清樣品。流感病毒微量中和實驗技術，是以血清中的病毒特異性中和抗體與流感病毒表面血凝素蛋白相結合，從而抑制病毒感染MDCK細胞為原理，系列稀釋的血清與定量病毒（100TCID50）混合，然后接種于MDCK細胞，過夜培養(yǎng)后，病毒核蛋白（NP）將表達于細胞內，再用ELISA檢測。

39、該實驗分為三個步驟：（1）病毒滴定（2）病毒中和實驗（3）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）。（一）實驗材料1、中和反應實驗材料(1)病毒：一般為雞胚尿囊病毒液，進行中和實驗前，需要進行病毒滴度（TCID50）的滴定。(2)血清樣品包括待檢血清和陽性以及陰性對照血清。人血清實驗前需要56 30分鐘滅活，動物血清需RDE處理。20儲存，避免多次反復凍融。(3)MDCK細胞和細胞培養(yǎng)試劑1)MDCK細胞（狗腎上皮細胞）2)MDCK細胞培養(yǎng)液：DMEM+5%牛血清+抗生素，過濾除菌500毫升 DMEM（修飾的Eagles培養(yǎng)基）5.5毫升 100×抗生素（100單位/毫升青霉素+100微克/毫

40、升鏈霉素）5.5毫升 100×LGlutamine（2毫摩爾）25.5毫升 56、30分鐘加熱滅活的牛血清3)胰酶 / EDTA(4)其它1)平底96孔微量培養(yǎng)板2)病毒稀釋液：DMEM+1%牛血清白蛋白+抗生素，即配即用。 429毫升 DMEM 66毫升 7.5%牛血清白蛋白（BSA） 5毫升 100×抗生素3)TPCK胰酶（使用濃度為2微克/毫升）4)固定液：80%的丙酮，即配即用，4保存 400毫升 丙酮 100毫升 PBS，PH 7.22、ELISA實驗材料(1)抗體1：鼠抗流感病毒甲型核蛋白克隆抗體(2)抗體2：辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG(3)洗滌液：PBS

41、+0.05%TWEEN20 4升 PBS，PH 7.2 2毫升 TWEEN20(4)封閉液：PBS+1%牛血清白蛋白+0.05TWEEN20 867毫升PBS，PH 7.2 132毫升牛血清白蛋白 1毫升TWEEN20(5)底物和底物溶液： 常用的辣根過氧化物酶（HRP）所用底物為磷苯二胺（OPD） 底物溶液為PH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液（0.05M） 底物和底物溶液：10毫克OPD 20毫升檸檬酸緩沖液（含0.015%雙氧水） 即配即用 磷酸鹽檸檬酸緩沖液，PH5.0 58.8克檸檬酸三鈉 1升蒸餾水 用鹽酸調節(jié)PH為5.0 加0.015%雙氧水，（臨用前加入） * 如果使用磷酸鹽檸檬酸緩沖

42、液膠囊（Sigma）1個膠囊加入100毫升蒸餾水，臨用前配制(6)終止反應液：1N硫酸（28毫升濃硫酸+1升蒸餾水）3、其他細胞培養(yǎng)和酶聯(lián)免役吸附實驗的常用設備和儀器（參照英文講義）備注：A.以上實驗材料購自Gibco,，Hyclone，Dynatech，Kirkegaard&Perry和Sigma公司，材料編號（CAT#）參照英文講義。B.實驗材料的配制，例如0.25%的胰酶等，請參照黃楨祥主編的醫(yī)學病毒學基礎及實驗技術一書。（二）質量控制病毒中和實驗技術是一個相當復雜的過程，參與中和反應的因素有病毒、抗血清和宿主細胞。這些因素的變化都會影響中和實驗的結果。因此，對中和實驗的整個過程

43、進行嚴格的質量控制。每次測定必須設立陽性和陰性血清對照，陽性和陰性細胞對照，以及對病毒使用劑量進行滴定。1、血清對照血清對照包括人或動物血清陽性和陰性對照。即血清中含有（陽性對照）或不含有（陰性對照）對測定病毒特異性的中和抗體。血清對照一般分裝成多份，20保存，并避免反復凍融使用。(1)陰性血清對照1）動物血清一般來自未免疫或未感染動物，即與待檢血清同種動物的正常血清。2）人血清一般來自與待檢血清年齡相同的正常人群，該人群未曾暴露于待檢病毒。3）測定過程中，陰性對照血清與待檢血清應處于相同稀釋水平。(2)陽性血清對照1）動物血清一般來自免疫后或感染后動物。2）人血清一般采用急性期和恢復期雙份血

44、清做對照。* 人血清使用前須經加熱滅活處理，動物血清則須經霍亂濾液RDE（即受體破壞酶）處理，以排除非特異性反應因素。2、病毒和細胞對照每次實驗必須設立陽性和陰性細胞對照，以及對加入病毒工作液進行滴定檢查，以便獲得準確可靠的實驗結果。(1)陽性和陰性細胞對照一般設立4個重復孔為陽性細胞對照，即將細胞與100倍組織細胞半數(shù)感染劑量（100TCID50）的病毒進行混合培養(yǎng)。同時設立4個孔為陰性細胞對照，即將細胞與病毒稀釋液進行混合培養(yǎng)。陽性細胞對照：50微升病毒稀釋液+50微升病毒+100微升MDCK細胞。陰性細胞對照：100微升病毒稀釋液+100微升MDCK細胞(2)病毒工作液滴度檢查一般第1孔

45、加入含有200TCID50的100微升病毒液，然后進行2倍稀釋，再與MDCK細胞進行混合培養(yǎng)。病毒滴度檢查：50微升2倍系列稀釋病毒液（第1孔為100TCID50） +50微升病毒稀釋液+100微升MDCK細胞（1.5×104細胞/孔）（三）實驗步驟1、病毒滴度測定（組織培養(yǎng)半數(shù)感染量TCID50滴定） (1)流感病毒制備利用雞胚尿囊腔接種法制備流感病毒，收獲尿囊液，血凝實驗測定病毒的存在，分裝后70凍存。(2)病毒的稀釋1)取1管凍存病毒尿囊液，1:100稀釋（100微升病毒液+9.9毫升稀釋液）2)第1排孔加入146微升1:100稀釋過的病毒液，然后做系列半對數(shù)稀釋，使之成10-

46、2、10-2.5、10-3、10-3.510-7。每孔含100微升病毒液，每個稀釋度重復4孔，詳細操作參見圖1。* 人流感病毒一般在胰酶存在的條件下才能感染MDCK細胞，因此病毒稀釋液中需加入2微克/毫升的TPCK胰酶。某些毒性很高的禽流感病毒在無胰酶存在的條件下即可感染MDCK細胞，因此在測定新病毒滴度時，最好配制含有和不含有胰酶的兩種稀釋液，以獲得最佳結果。(3)MDCK細胞的準備1)使用前2天將MDCK細胞1:100傳代，使之7090%成片，處于對數(shù)生長期的細胞對病毒具有最大的敏感性，細胞過度生長以及代數(shù)太高（大于30代）將使細胞對病毒的敏感性降低。2)棄去細胞培養(yǎng)液，用5毫升胰酶 /

47、EDTA洗細胞一次，然后棄去。3)加4到5毫升胰酶 / EDTA覆蓋細胞（162cm2的細胞培養(yǎng)瓶）37 5%CO2溫箱中消化1020分鐘。4)待細胞開始脫落時，加510毫升MDCK細胞培養(yǎng)液，吹打分散細胞，并將細胞轉入離心管中，用PBS洗2次，以去除牛血清。5)將細胞懸浮于病毒稀釋液中，用1毫升吸管充分吹打分散細胞，在細胞計數(shù)板上計數(shù)細胞數(shù)量。6)用病毒稀釋液將細胞稀釋成1.5×105細胞/毫升。7)加100微升細胞（1.5×104細胞/孔）于已稀釋好病毒的微量細胞培養(yǎng)板中。8)在37 5%CO2溫箱中培養(yǎng)1822小時。(4)測定組織細胞半數(shù)感染劑量（TCID50）1)棄

48、去微量培養(yǎng)板中的細胞液，250微升PBS洗細胞一次。2)棄去PBS（不要讓細胞干燥），加入100微升/孔固定液。3)覆蓋微量培養(yǎng)板，于室溫固定細胞10分鐘。4)棄去固定液，讓微量培養(yǎng)板室溫干燥。5)用ELISA檢測細胞感染（參見ELISA部分）6)利用ELISA檢測儀，于490納米波長，測定每孔吸光度（OD）值，計數(shù)細胞陰性對照孔的平均OD值。7)若含有不同稀釋度病毒孔平均OD值是細胞陰性對照孔平均OD值的2倍以上，則判斷為病毒生長陽性。8)根據Reed和Muench方法對病毒滴度進行計算，最終獲得TCID50/100微升（參見附錄和表2）。9)在進行中和實驗前，稀釋病毒液，使之50微升中含有

49、100TCID50流感病毒。2、病毒微量中和實驗(1)待檢血清的準備和稀釋1)檢測對一種病毒的中和抗體需要10微升血清，每份血清需要進行至少1次重復測定（共需至少20微升血清/每種病毒），每塊板可檢測11份樣品。2)人血清需56加熱滅活30分鐘。3)實驗設計請參照圖2。4)每孔中加入50微升病毒稀釋液。5)第1排中（A1A11）再加入40微升病毒稀釋液，使之成為90微升/孔。6)加入10微升待檢血清于第1排A1A11。7)將待檢血清作系列倍比稀釋（AH）使之成為1:10、1:20、1:401:1280。(2)病毒的準備1)稀釋病毒至100TCID50/50微升。根據病毒特性選擇是否在病毒稀釋液

50、中加入TPCK胰酶（大約5毫升/每板）。2)除細胞陰性對照孔（4孔）外，每孔加入50微升病毒工作液。3)加50微升病毒稀釋液于細胞陰性對照孔。4)選擇1列孔做病毒工作液滴度核實。第1孔加入200TCID50/100微升病毒工作液，做系列倍比稀釋，使之成100TCID50，50，25，12，60.7。然后每孔加入50微升病毒稀釋液，使體積至100微升/孔。5)搖勻病毒血清混合物，放37溫箱作用2小時。(3)MDCK細胞的準備。（參見病毒滴定測定部分）加100微升細胞液（1.5×104細胞/孔）于含有病毒血清混合物以及倍比稀釋病毒工作液的微量板中，37溫箱孵育1822小時。* 當測定大量

51、樣品時，每疊培養(yǎng)板一般不超過45塊，各疊板之間要保持一定距離，以確?；旌衔锸軣峋鶆?，從而達到良好的中和效果。(4)細胞的固定1)棄去微量培養(yǎng)板中的細胞液。2)250微升PBS洗細胞一次。3)棄去PBS（不要讓細胞干燥），加入100微升/孔固定液。4)覆蓋微量培養(yǎng)板，于室溫固定細胞10分鐘。5)棄去固定液，讓微量培養(yǎng)板室溫干燥。3、酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）ELISA的基本原理是：酶結合物與相應抗體或抗原特異性結合，再遇酶底物時，在酶的強烈催化下使原來無色的底物產生化學反應，即形成有色的產物，便可用肉眼或分光光度計定量檢測其含量。該方法具有特異性、敏感性、快速性和簡易性等優(yōu)點。在流感病毒微量

52、中和實驗中，酶結合物（HRP標記的羊抗鼠IgG抗體）與存在于MDCK細胞膜上的病毒核蛋白抗原-核蛋白單克隆抗體復合物結合，HRP酶催化OPD，使無色底物形成橙黃色化合物，再由ELISA檢測儀測定吸光度值，從而獲得中和抗體滴度。(1)實驗操作1)用250微升PBS洗滌微量培養(yǎng)板3次，以去除殘余的丙酮。2)用封閉液1：4000（或最佳稀釋度）稀釋抗體1（抗流感病毒核蛋白-NP單克隆抗體）3)每孔加入稀釋后的100微升抗體1，室溫作用1小時。4)用250微升洗滌液洗板4次以除去抗體1。5)用封閉液1:2000（或最佳稀釋度）稀釋抗體2（HRP標記的羊抗鼠IgG）。6)每孔加入稀釋后的100微升抗體2，室溫作用1小時。7)用250微升洗滌液洗滌板6次以除區(qū)抗體2。8)每孔加OPD底物100微升（10毫升OPD+20毫升檸檬酸緩沖液+10微升30%雙氧水，即用即配）。9)室溫放10分鐘左右顯色，直至細胞陽性對照孔變橙黃色，而細胞陰性對照孔尚未變色時，每孔加1M硫酸100微升終止反應。10)在ELISA測定儀上（490納米）讀出每孔OD值。(2)結果判定下列公式用于判定中和反應結果（細胞陽性對照平均OD值細胞陰性對照平均OD值）2+細胞陰性對照平均OD值=XX=細胞半數(shù)感染閾值，每孔OD值低于X值時，判定為中和