早期宮頸癌局部浸潤(rùn)與臨床預(yù)后關(guān)系的研究

1、早期宮頸癌局部浸潤(rùn)與臨床預(yù)后關(guān)系的研究                               作者：張凡 常永霞 張九鴻 舒麗莎 陳江平 劉軍超 林媛媛 張劍虹 趙秀芳 成日青 【摘要】  目的：探討早期宮頸癌中局部浸潤(rùn)及其預(yù)后意義。方法：應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)65例早期宮頸

2、癌中MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin，并利用原位雜交檢測(cè)HPV的表達(dá)，分析其與臨床參數(shù)和預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)果：MMP2的表達(dá)與組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)有關(guān)（P<0.05），與UICC分期無(wú)關(guān)（P>0.05）；MMP9的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)有關(guān)（P<0.05）,與組織學(xué)分型、UICC分期無(wú)關(guān)（P>0.05）；CathepsinD的表達(dá)與組織學(xué)分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)、UICC分期均存在相關(guān)（P<0.05）；Ecadherin的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UICC分期有關(guān)（P<0.05），與局部復(fù)發(fā)、組織學(xué)分型無(wú)關(guān)（P>0

3、.05）；HPV的表達(dá)與組織學(xué)分型有關(guān)（P<0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)、UICC分期無(wú)關(guān)（P>0.05）；經(jīng)多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析顯示：組織學(xué)分型、CathepsinD、MMP2的表達(dá)與早期宮頸癌患者術(shù)后生存率有關(guān)（P<0.05）。結(jié)論：MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin參與了早期宮頸癌的局部浸潤(rùn)；組織學(xué)分型、MMP2、CathepsinD的表達(dá)可作為宮頸癌患者獨(dú)立的預(yù)后因素。 【關(guān)鍵詞】  宮頸癌；浸潤(rùn)；免疫組化；CathepsinD；預(yù)后    【ABSTRACT】  Objecti

4、ve: To investigate the local invasion and clinical significance in early Cervical Carcinoma.Methods: The expressions of proteins MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin were detected by immmunohistochemistry method,the expression of HPV was detected by in situ hybridization in sixtyfive patients with early C

5、ervical Carcinoma who were followed up more than ten years.The relationship between the expression of invasion associated with proteins and clinical prognosis were analysed. Results: the expression of MMP2 was associated with lymph node metastasis, histological grading and recurrence (P<0.05)，wer

6、e not associated with UICC staging(P>0.05); the expression of MMP9 was associated with lymph node metastasis and recurrence (P<0.05)，was not associated with histological grading 、UICC staging(P>0.05);the expression of CathepsinD was associated with all parameters (P<0.05);the expression

7、of Ecadherin was associated with lymph node metastasis and UICC grading (P<0.05)，was not associated with recurrence 、histological staging(P>0.05); the expression of HPV was associated with histological staging (P<0.05)，was not associated with lymph node metastasis ， UICC grading， recurrence

8、 (P>0.05); in the multivariate Cox analysis, survival rate was correlated with histological staging MMP2 CathepsinD (P<0.05). Conclution: MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin all take part in invasion of early cervical carcinoma; Histological staging MMP2, CathepsinD can be regarded as independent p

9、rognostic factors in early cervical carcinoma.    【KEY WORDS】  Cervical carcinoma;Invasion;Immunohistochemistry;CathepsinD;Prognosis    宮頸癌是目前危害女性健康的常見腫瘤，其局部浸潤(rùn)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不僅影響手術(shù)效果，而且直接關(guān)系患者預(yù)后。宮頸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制尚不清楚，與預(yù)后關(guān)系研究較少；HPV感染與宮頸上皮的癌變存在密切聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組織化學(xué)和原位雜交檢測(cè)早期宮頸癌中MMP2、MMP9、C

10、athepsinD、Ecadherin、HPV的表達(dá)，希望能為宮頸癌浸潤(rùn)機(jī)制的深入研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，并利用多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型對(duì)其與早期宮頸癌患者的預(yù)后進(jìn)行分析，為準(zhǔn)確評(píng)估患者預(yù)后提供科學(xué)依據(jù)。    1  材料與方法    1.1  一般資料    收集河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院1985.11995.1月住院患者中臨床病理資料齊全，并有10年以上隨訪結(jié)果的宮頸癌65例（隨訪時(shí)間至2004年1月，死亡病例均死于宮頸癌相關(guān)病變），所有病例均為原發(fā)早期宮頸鱗狀細(xì)胞癌，都進(jìn)行了宮頸癌手術(shù)治

11、療，未作術(shù)后化療、放療等輔助治療。年齡2569歲，平均年齡51歲。無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例。無(wú)局部復(fù)發(fā)42例，局部復(fù)發(fā)23例。按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期：期25例，期40例。資深病理醫(yī)師對(duì)切片進(jìn)行復(fù)習(xí)確診，采用最新Reagan等建立的分類；大細(xì)胞非角化型癌（高分化）8例，角化型癌（中分化）39例，小細(xì)胞非角化癌（低分化）18例。    1.2  免疫組織化學(xué)染色    所有標(biāo)本經(jīng)10%甲醛常規(guī)固定,石蠟包埋,4m連續(xù)切片。MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin一抗試劑均購(gòu)自北京中山試劑公司

12、。主要免疫組化步驟：二甲苯脫蠟、梯度酒精至水，3%雙氧水滅活內(nèi)源性過(guò)氧化酶，PBS緩沖液振洗（采用專用微波爐進(jìn)行抗原微波熱修復(fù)），正常山羊血清封閉、一抗冰箱過(guò)夜，二抗、三抗各1h，DAB顯色1015min，復(fù)染核脫水透明，中性樹膠封片。結(jié)果判斷:著色細(xì)胞<10%為陰性,>10%為陽(yáng)性。MMP2、MMP9、CathepsinD陽(yáng)性表達(dá)定位在腫瘤細(xì)胞質(zhì)，Ecadherin陽(yáng)性表達(dá)定位在細(xì)胞膜。采用HIPAS100圖象分析軟件對(duì)所有切片進(jìn)行圖象分析，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)著色典型區(qū)域且不重復(fù)的視場(chǎng)，測(cè)量每個(gè)視場(chǎng)中陽(yáng)性單位，取其均數(shù)即為該切片的著色強(qiáng)度，所有的結(jié)果都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表

13、示。    1.3  原位雜交染色    HPV16/18原位雜交試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物試劑公司。主要步驟：切片常規(guī)脫蠟入水，3%H2O2室溫處理10min，蒸餾水洗滌5min×3次；胃蛋白酶消化，37溫箱中50min，PBS洗滌5min×3次；滴加預(yù)雜交液，40溫箱中2h，吸取多余液體，不洗，滴加含探針的雜交液，蓋專用蓋片，40溫箱中過(guò)夜；在37水浴中用2×SSC洗滌5min×2次，0.5×SSC洗滌10min×1次，0.2×SSC10min×

14、;1次；滴加封閉液，37溫箱中30min，吸取多余液體，不洗；滴加生物素化鼠抗地高辛，37溫箱中60min，PBS洗滌5min×4次；滴加SABC，37溫箱中30min，PBS洗滌5min×32007年2月張  凡等：早期宮頸癌局部浸潤(rùn)與臨床預(yù)后關(guān)系的研究第1期2007年2月河北北方學(xué)院學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版）第1期表1  MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin、HPV在各組中表達(dá)陽(yáng)性率的比較表2  MMP2、MMP9、CathepsinD、Ecadherin、HPV表達(dá)與臨床病理參數(shù)的相關(guān)分析 注：rP2代表MMP2，rP9代表M

15、MP9，rD代表CathepsinD，rE代表Ecadherin，rH代表HPV次；滴加生物素化過(guò)氧化物酶，37溫箱中30min，PBS洗滌5min×4次。DAB顯色，光鏡下觀察，自來(lái)水中終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，充分水洗，常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明、封片。陽(yáng)性定位于細(xì)胞核。    1.4  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法    應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同組間表達(dá)率的比較采用Fisher精確概率法，各指標(biāo)表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間作直線回歸相關(guān)分析，對(duì)全部病例用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素和多因素生存分析，并對(duì)有預(yù)

16、后價(jià)值的指標(biāo)作KaplanMeier生存曲線。以=0.05作為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。    2  結(jié)果    65例宮頸癌病例中，MMP2陽(yáng)性率為78%（51/65），MMP9陽(yáng)性率為75%（49/65），CathepsinD陽(yáng)性率為6%（37/65），Ecadherin陽(yáng)性率為40%（26/65），HPV的陽(yáng)性率52%（34/65）。MMP2、MMP9在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、UICC 期組分別高于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組、UICC 期組；CathepsinD在低分化組、UICC 期、局部復(fù)發(fā)組分別高于高分化組、UICC 期、局部未復(fù)發(fā)組；Ecad

17、herin在低分化組、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、局部復(fù)發(fā)組分別高于高分化組、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組、局部未復(fù)發(fā)組；HPV在低分化組高于高分化組，在淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組、UICC 期分別高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組、UICC 期（見表1）。    各指標(biāo)的著色強(qiáng)度與腫瘤的各臨床病理參數(shù)之間做直線回歸相關(guān)分析顯示：pgp的表達(dá)與腫瘤分化程度、局部復(fù)發(fā)及UICC分期有關(guān)（P<0.05），與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)；Topo的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P<0.05），與局部復(fù)發(fā)、腫瘤分化程度、UICC分期無(wú)關(guān)（P>0.05）；GST的表達(dá)與腫瘤分化程度、局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及UICC分期均存在相關(guān)（P&l

18、t;0.05）；TS的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UICC分期有關(guān)（P<0.05），與腫瘤分化程度、局部復(fù)發(fā)無(wú)關(guān)（P>0.05）（見表2）。    對(duì)隨訪資料進(jìn)行單因素Cox模型分析，結(jié)果顯示早期宮頸癌腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、UICC分期及MMP2、CathepsinD、Ecadherin的表達(dá)均與術(shù)后生存之間明顯相關(guān)（ P<0.01）。多因素Cox模型分析結(jié)果顯示：只有組織學(xué)分型、MMP2、CathepsinD的表達(dá)與術(shù)后生存時(shí)間之間存在明顯相關(guān)（P<0.05），即腫瘤分化程度越低、MMP2、CathepsinD表達(dá)水平越高，患者的術(shù)后生存時(shí)間越

19、短，生存率越低（圖1圖3）。3  討論    國(guó)際婦產(chǎn)科醫(yī)師聯(lián)合會(huì)認(rèn)為影響宮頸癌的預(yù)后因素包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤三維體積、腫瘤浸潤(rùn)深度。腫瘤浸潤(rùn)深度小于3mm時(shí)5年生存率為99%，但當(dāng)浸潤(rùn)深度大于19mm時(shí)5年生存率僅為63%；腫瘤體積小于2cm3時(shí)5年生存率大于90%，腫瘤體積大于30 cm3時(shí)5年生存率小于65%，腫瘤體積的增大也意味腫瘤浸潤(rùn)深度增加，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)1。早期宮頸癌的局部浸潤(rùn)機(jī)制的研究較少報(bào)道，浸潤(rùn)對(duì)預(yù)后意義研究尤其少。MMP2、MMP9、組織蛋白酶D與多種腫瘤的浸潤(rùn)密切相關(guān)；鈣粘連蛋白在腫瘤發(fā)展的各個(gè)階段出現(xiàn)不同水平的表達(dá)；HPV的

20、感染已成為宮頸癌發(fā)生以及原位癌進(jìn)入到浸潤(rùn)癌的關(guān)鍵因素，本實(shí)驗(yàn)探討上述各指標(biāo)在早期宮頸癌浸潤(rùn)中的表達(dá)情況，以及與患者預(yù)后之間的關(guān)系，從而為深入研究早期宮頸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移機(jī)制提供初步理論依據(jù)，并為宮頸癌的預(yù)后評(píng)估提供可靠的判斷指標(biāo)。                                

21、 MMPs是一族至少包括19類的鋅依賴性內(nèi)肽酶，它們的共同作用可降解所有的細(xì)胞外基質(zhì)成分。MMPs主要以酶原形式分泌到細(xì)胞外，一般情況下它們與組織金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）以11比例結(jié)合形成復(fù)合物。體內(nèi)的MMPs具有基因轉(zhuǎn)錄水平、翻譯后水平調(diào)節(jié)，MMP2和MMP9分子量分別為 72Kda和92KDa，是兩種重要的蛋白酶，與多種腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)2,3。同時(shí)研究顯示MMP2、MMP9與腫瘤血管生成相關(guān)46。因此推測(cè)兩者的表達(dá)直接影響腫瘤患者預(yù)后。我們實(shí)驗(yàn)中MMP2的陽(yáng)性表達(dá)率為78%， MMP9的陽(yáng)性表達(dá)率為75%，而且在腫瘤組織浸潤(rùn)的邊緣存在MMP2、MMP9的高表達(dá)，而在腫瘤內(nèi)部表達(dá)

22、水平較低，同時(shí)兩者的表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期密切相關(guān)，因此MMP2、MMP9的促浸潤(rùn)和血管化作用使腫瘤更易獲取營(yíng)養(yǎng)，便利腫瘤發(fā)展和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，單因素和多因素分析顯示MMP2可作為早期宮頸癌臨床預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。    組織蛋白酶D（CathepsinD CD）為一種分子量為52KD的糖蛋白,存在于乳腺癌細(xì)胞,亦存在于乳腺組織間質(zhì)中,它能降解基底膜促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、刺激癌細(xì)胞生長(zhǎng)。Do NY對(duì)397例乳腺癌冰凍標(biāo)本,用Westernblot法對(duì)CD測(cè)量,發(fā)現(xiàn)高水平的CD,盡管在淋巴結(jié)陰性情況下,乳腺癌患者容易早期復(fù)發(fā)或較早期死亡,認(rèn)為CD可作為預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)3。

23、Ortiz Mendoza CM用免疫組化方法對(duì)281例乳腺導(dǎo)管浸潤(rùn)癌研究,對(duì)病人進(jìn)行74個(gè)月隨訪發(fā)現(xiàn),CD高表達(dá)盡管與淋巴結(jié)、受體或絕經(jīng)等情況無(wú)關(guān),但其提示生存期短、預(yù)后差7。Myo K等認(rèn)為CD的纖溶酶原的水解片段有抑制血管生成作用，缺氧導(dǎo)致的環(huán)氧化酶2的高表達(dá)對(duì)CD有明顯的抑制作用，使的后者的抗血管生成作用受抑制，血管密度增加8。我們實(shí)驗(yàn)中CD的陽(yáng)性率為56%，其表達(dá)水平與腫瘤分化程度、臨床分期、局部復(fù)發(fā)密切相關(guān)，腫瘤分化低、臨床分期晚、局部腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)CD出現(xiàn)高表達(dá)；多因素分析顯示CD可作為早期宮頸癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。    Cadherin是一族依賴細(xì)胞外C

24、a2+的細(xì)胞粘附受體,介導(dǎo)同種親和性的細(xì)胞細(xì)胞間粘附,并參與建立和維持細(xì)胞間連接,他們廣泛分布于上皮細(xì)胞、間胚層細(xì)胞和胎盤等處，對(duì)維持上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)形態(tài)的完整性、極性形態(tài)和組織結(jié)構(gòu)起關(guān)鍵作用9，10。Ecadherin（Ecad）在細(xì)胞分裂、粘附和腫瘤早期浸潤(rùn)中有調(diào)控作用,其陽(yáng)性表達(dá)有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的功能,其表達(dá)降低或缺失,會(huì)破壞粘著連接,使腫瘤細(xì)胞間的粘附性減弱易于脫落或遷移,而向外周浸潤(rùn)性生長(zhǎng)或轉(zhuǎn)移,這已在多種腫瘤(如肺癌、乳腺癌、大腸癌、膀胱癌、肝癌等)的研究中得到證實(shí)11。我們實(shí)驗(yàn)Ecad的陽(yáng)性率為40%，同時(shí)腫瘤細(xì)胞在部分浸潤(rùn)癌出現(xiàn)表達(dá)缺失，部分病例出現(xiàn)高表達(dá)，推測(cè)上皮惡變后細(xì)胞粘附力降

25、低，利于腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落，同時(shí)局部出現(xiàn)浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的細(xì)胞必須相互粘附才能形成浸潤(rùn)灶，向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；且表達(dá)水平與腫瘤的組織分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)密切相關(guān)，但統(tǒng)計(jì)分析顯示Ecad不能作為早期宮頸癌的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。    20世紀(jì)70年代中葉以來(lái)，HPV逐漸被視為宮頸腫瘤形成病因?qū)W的關(guān)鍵因素。早期研究顯示宮頸鱗狀細(xì)胞癌中HPVDNA的檢出率超過(guò)60%，其中HPV16所占比例最高（50%以上），HPV18為15%，HPV45和HPV31分別為9%、6%1214。HPV基因組包含三個(gè)區(qū)，即早期基因區(qū)和晚期基因區(qū)。早期基因區(qū)編碼多種蛋白質(zhì)，其中E6和E7是保守序列，在所有H

26、PV相關(guān)病變中都有表達(dá)，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞增生和轉(zhuǎn)化。我們實(shí)驗(yàn)中HPV的陽(yáng)性率為52.3%，與報(bào)道接近，同時(shí)其表達(dá)水平與宮頸癌腫瘤細(xì)胞的分化密切相關(guān)，已有的文獻(xiàn)也支持我們的結(jié)論。HPV16陽(yáng)性宮頸癌患者5年生存率58%，HPV18陽(yáng)性者為38%，說(shuō)明HPV與患者的預(yù)后相關(guān)，但我們的實(shí)驗(yàn)未得出HPV為宮頸癌患者的預(yù)后指標(biāo)，可能與我們選取的病例均為早期宮頸癌患者有關(guān)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1 Branca M, Ciotti M, Giorgi C,et al. Matrix metalloproteinase2 (MMP2) and its tissue inhibitor (TIMP2) are

27、 prognostic factors in cervical cancer, related to invasive disease but not to highrisk human papillomavirus (HPV) or virus persistence after treatment of CINJ.Anticancer Res， 2006，26(2):154315562 Zhai Y, Hotary KB, Nan B,et al. Expression of membrane type 1 matrix metalloproteinase is associated wi

28、th cervical carcinoma progression and invasionJ.Cancer Res, 2005,65(15):654365503 Do NY, Lim SC, Im TS. Expression of cerbB receptors, MMPs and VEGF in squamous cell carcinoma of the head and neckJ.Oncol Rep, 2004,12(2):2292374 TalvensaariMattila A, TurpeenniemiHujanen T, Puistola U. Matrix metalloproteinase 9 and relapse in patients with early stage squamous cervical carcinomaJ.Int J