微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法綜述

1、環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)研究方法綜述摘 要：對(duì)當(dāng)前國(guó)內(nèi)外環(huán)境微生物多樣性的分子生態(tài)學(xué)研究方法進(jìn)行了總結(jié)和探討，包括微生物化學(xué)成分的分析的方法和分子生物學(xué)的方法，以目前比較成熟前沿的分子生物學(xué)的方法16S rRNA基因序列分析、變性梯度凝膠電泳(DGGE)/溫度梯度凝膠電泳(TGGE)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)和擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析(ARDRA)、末端限制性片段多態(tài)性(T-RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)為例。在環(huán)境微生物多樣性研究中，如果可能的話，需要將各種方法結(jié)合起來(lái)使用，方可掌握有關(guān)環(huán)境生物多樣性的較為全面的信息。更好的揭示環(huán)境變化現(xiàn)狀和預(yù)示環(huán)境的變化趨勢(shì)，為環(huán)境改善修復(fù)提

2、供有利依據(jù)。關(guān)鍵詞：環(huán)境微生物；分子生物學(xué)；DGGE；ARDRA；T-RFLP1 引言環(huán)境微生物是指環(huán)境中形體微小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的生物，包括原核微生物(細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌、放線菌)、真核生物（真菌、藻類(lèi)、地衣和原生動(dòng)物等）。數(shù)量龐大、種類(lèi)繁多的環(huán)境微生物是豐富的生物資源庫(kù)1，也是環(huán)境中最活躍的部分，全部參與環(huán)境中生物化學(xué)反應(yīng)，在物質(zhì)轉(zhuǎn)換、能量流動(dòng)、生物地球化學(xué)循環(huán)及環(huán)境污染物的降解和解毒2過(guò)程中具有極其重要的作用，亦是評(píng)價(jià)各種環(huán)境的重要指標(biāo)之一。比如土壤微生物的數(shù)量分布，不僅可以敏感地反映土壤環(huán)境質(zhì)量的變化，而且也是土壤中生物活性的具體體現(xiàn)3。河道、湖泊中微生物量也可以反映該水體的健康狀況。微生物群落結(jié)

3、構(gòu)和多樣性是環(huán)境微生物生態(tài)學(xué)研究的熱點(diǎn)內(nèi)容。微生物群落結(jié)構(gòu)的研究主要通過(guò)描述微生物群落的穩(wěn)定性、微生物群落生態(tài)學(xué)機(jī)理以及自然或人為干擾對(duì)群落產(chǎn)生的影響，揭示環(huán)境質(zhì)量與微生物數(shù)量和活性之間的關(guān)系4。微生物群落多樣性，是指土壤微生物群落的種類(lèi)和種間差異，微生物群落多樣性包括物種多樣性、遺傳多樣性及生理功能多樣性等5。物種多樣性是群落中的微生物種群類(lèi)型和數(shù)量，其中豐度和均度是多樣性指數(shù)中的兩個(gè)組成部分，也是多樣性分析中最直觀、最容易理解的要素。研究微生物多樣性的傳統(tǒng)方法是將微生物從環(huán)境中分離、實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)和鑒定6。然而，微生物種類(lèi)繁多，自然界中僅有極少數(shù)微生物得到鑒定?，F(xiàn)代分子生物學(xué)方法為全面掌握微生

4、物多樣性提供了可能。2 微生物化學(xué)成分的分析的方法根據(jù)細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)原理，不同種類(lèi)微生物細(xì)胞的化學(xué)組成也不一樣。根據(jù)微生物化學(xué)成組成進(jìn)行微生物多樣性分析是分析微生物群落的方法之一。經(jīng)過(guò)發(fā)展研究，主要有：1.1 群落水平生理學(xué)指紋方法(CLPP)微生物所含的酶與其豐度或活性密切相關(guān)的。如果某一微生物群落中含有特定的酶可催化利用某特定的基質(zhì)，則這種酶-底物可作為此群落的生物標(biāo)記分子之一。由Garland和Mills7于1991年提出的群落水平生理學(xué)指紋方法(CLPP)，是一種通過(guò)檢測(cè)微生物樣品對(duì)底物利用模式來(lái)反映種群組成的酶活性的分析方法。具體而言，CLPP就是通過(guò)檢測(cè)微生物樣品對(duì)多種不同的單一碳

5、源的利用能力，來(lái)確定哪些基質(zhì)可以作為能源，從而產(chǎn)生對(duì)基質(zhì)利用的生理代謝指紋。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)有韓蕙等人8利用BIOLOG YT、FF微孔板分別考察了4個(gè)真菌群落代謝活性及群落間的代謝相似性,并與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）結(jié)構(gòu)相似性分析對(duì)比試圖探討代謝相似性與結(jié)構(gòu)相似性的內(nèi)在聯(lián)系,探討了超低溫凍存法作為樣品保存手段對(duì)真菌群落特征BIOLOG分析結(jié)果的影響。還有楊永華等9用CLPP方法對(duì)農(nóng)藥污染土壤中的微生物群落進(jìn)行了研究，測(cè)定結(jié)果顯示，污染土壤的Shannon指數(shù)和均度、Simpson指數(shù)、Mclntosh指數(shù)和均度都明顯低于無(wú)污染的土壤。這表明，農(nóng)藥污染導(dǎo)致了土壤中微生物

6、代謝功能多樣性的下降，同時(shí)也導(dǎo)致了微生物種類(lèi)的減少。1.2 生物標(biāo)記物法（Biomarkers）生物標(biāo)記物通常是微生物細(xì)胞的生化組成成分，其總量通常與相應(yīng)生物量呈正相關(guān)。特定的Biomarkers標(biāo)志著特定的微生物，一些生物標(biāo)記物的組成模式(種類(lèi)、數(shù)量和相對(duì)比例)可作為指紋估價(jià)微生物群落結(jié)構(gòu)。生物標(biāo)記物法（Biomarkers）包括：醌指紋法(Quinones Profiling)；磷脂脂肪酸（phospholipid fatty acid, PLFA）、甲基脂肪酸酯（Fatty acid methyl ester, FAME）譜圖分析法；目前應(yīng)用最廣的是PLFA和FAME兩種。以脂肪酸甲酯分

7、析法為例，脂肪酸甲酯分析法就是基于生物標(biāo)記分子基礎(chǔ)之上，不依賴(lài)微生物培養(yǎng)技術(shù)，提供微生物種群中脂肪酸組成信息的一種分析法。脂肪酸是細(xì)胞中相對(duì)穩(wěn)定的組成成分，不同微生物的脂肪酸在組成和含量上有較大差異，它和微生物的遺傳變異、耐藥性等有極為密切的關(guān)系。大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌(G+)中支鏈C15:0脂肪酸豐度很高，而在大多數(shù)革蘭氏陰性菌(G-)菌中C16：0豐度較高10。一些細(xì)菌如考克斯氏體屬、土拉弗朗西絲菌屬11、假單孢菌屬和結(jié)核分枝桿菌屬細(xì)菌12有其特殊的脂類(lèi)，可經(jīng)磷脂脂肪酸分析實(shí)現(xiàn)鑒定，因此脂肪酸圖譜的改變就代表著微生物種群的改變。FAME法已經(jīng)廣泛應(yīng)用到化學(xué)物質(zhì)污染和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)引起的微生物種群

8、組成和結(jié)構(gòu)改變的研究中13。近些年來(lái)，磷脂脂肪酸分析方法也逐漸被應(yīng)用于土壤微生物多樣性的研究中來(lái)，并作為土壤微生物種群變化的監(jiān)測(cè)指標(biāo)14。3 以PCR為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)分析方法用于微生物群落結(jié)構(gòu)分析的基因組DNA的序列包括：核糖體操縱子基因序列(rDNA)、已知功能基因的序列、重復(fù)序列和隨機(jī)基因組序列等。最常用的標(biāo)記序列是核糖體操縱子基因(rDNA)。rRNA(rDNA)在細(xì)胞中相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)含有保守序列及高可變序列，是微生物系統(tǒng)分類(lèi)的一個(gè)重要指標(biāo)。16SrDNA廣泛存在于所有原核生物的基因組中。序列變化比較緩慢，與物種的形成速度相適應(yīng)，而且一般不發(fā)生水平轉(zhuǎn)移。應(yīng)用分子生物學(xué)方法，克服了傳統(tǒng)微

9、生物生態(tài)學(xué)研究技術(shù)的局限性，能獲取更加豐富的微生物多樣性信息，推動(dòng)著當(dāng)今微生物生態(tài)學(xué)研究的進(jìn)一步發(fā)展。下面介紹近年來(lái)分子生物學(xué)在微生物生態(tài)學(xué)研究中較為成熟的技術(shù)。如圖1，圖1是分子生物技術(shù)在微生物多樣性研究中的應(yīng)用圖解。圖1 分子生物技術(shù)在微生物多樣性研究中的應(yīng)用圖解2.1 16S rRNA基因序列分析16S rRNA基因序列分析主要是基于已建立的16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)庫(kù)，用于確定細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育來(lái)判斷物種間進(jìn)化關(guān)系，通過(guò)比較16SrRNA基因的序列，可確定新的離菌株在進(jìn)化上的地位，并使序列探針能夠識(shí)別未知菌。目前，16S rRNA基因序列分析已被廣泛應(yīng)用于微生物多樣性的研究，為微生物的系

10、統(tǒng)發(fā)育和未知菌的鑒定提供了全新的方法，并取得了一些有意義的結(jié)果。1970年Woese利用16S rRNA寡核苷酸序列分析技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了一類(lèi)在系統(tǒng)發(fā)育上與其它細(xì)菌存有很大差異的微生物-古細(xì)菌，奠定了有關(guān)古生物、真細(xì)菌和真核生物“三域”理論的基礎(chǔ)15,16。戴欣等17通過(guò)構(gòu)建16S rRNA基因庫(kù)對(duì)中國(guó)南海南沙海區(qū)沉積物中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了分析,表明在中國(guó)南沙海區(qū)沉積物中存在豐富的微生物多樣性,并潛藏著特有的微生物資源。孫磊等18通過(guò)對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因克隆文庫(kù)中陽(yáng)性克隆的序列測(cè)定證實(shí)引物對(duì)799f-1492r完全適用于非培養(yǎng)的分子生物學(xué)方法對(duì)水稻內(nèi)生細(xì)菌的研究，對(duì)水稻（Oryza s

11、ativa L.）內(nèi)生細(xì)菌和根結(jié)合細(xì)菌群落多樣性及群落動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了分析。2.2 變性梯度凝膠電泳(DGGE)溫度梯度凝膠電泳 (TGGE)DGGETGGE是兩個(gè)相似的研究微生物多樣性的方法。這種技術(shù)最初是為了檢測(cè)DNA序列中的點(diǎn)突變。Muyzer等191993年開(kāi)始利用這個(gè)技術(shù)來(lái)研究微生物的遺傳多樣性。主要步驟是：提取土壤樣品中的DNA，利用通用引物PCR擴(kuò)增16S或18S中的目的片段，在變性劑梯度或者溫度梯度的聚丙烯酰胺凝膠中電泳。為了保證DNA片段在聚丙烯酰胺凝膠中分離時(shí)至少部分DNA保持雙鏈，在正向引物的5 端加上3540個(gè)堿基的GC發(fā)卡，否則在梯度凝膠中DNA將完全變性成單鏈。理論上

12、，DGGE可以分開(kāi)只有一個(gè)堿基差別的DNA序列。DGGETGGE方法可以探測(cè)到低豐度的種群。段學(xué)軍等20。利用DGGE技術(shù)評(píng)價(jià)了重金屬鎘污染對(duì)土壤微生物群落影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度鎘脅迫下稻田土壤間的菌種有明顯差異。羅海峰等21用此技術(shù)檢測(cè)乙草胺對(duì)農(nóng)田土壤細(xì)菌多樣性影響，結(jié)果顯示，乙草胺在一定程度上改變了土壤細(xì)菌的多樣性，特別是對(duì)土壤中的Proteobacteria的-Proteobacteria和-Proteobacteria的影響明顯。王曉丹等22以北京翠湖濕地污水塘、表流濕地和潛流濕地為研究對(duì)象，在了解水質(zhì)的基礎(chǔ)上，采用PCR-DGGE和16S rDNA文庫(kù)技術(shù)對(duì)樣品細(xì)菌多樣性和優(yōu)勢(shì)群落

13、結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。結(jié)果表明在水質(zhì)有明顯變化的同時(shí)，微生物數(shù)量、細(xì)菌多樣性及優(yōu)勢(shì)群落都發(fā)生了明顯變化。DGGETGGE可信度高，重復(fù)性好，快速，同時(shí)可以分析多個(gè)樣品，相對(duì)較經(jīng)濟(jì)。但是DGGETGGE受樣品DNA提取質(zhì)量、PCR結(jié)果的影響較大。另外，不同序列的DNA片段在聚丙烯酰胺凝膠中也可以有相同的移動(dòng)特性，因此，一個(gè)條帶不一定就代表一個(gè)種23。在利用DGGETGGE圖譜得到的部分種群指紋信息進(jìn)行多樣性研究時(shí)，還可以對(duì)特異性的條帶割膠回收，PCR擴(kuò)增并測(cè)序，或轉(zhuǎn)膜與特異性引物雜交，這樣就可以提供更多有關(guān)群落內(nèi)部特定類(lèi)群的信息。同時(shí)，一些研究者已經(jīng)開(kāi)始用DGGE研究代謝基因，比如甲烷加氧酶24。這將提

14、供土壤微生物的特殊功能(例如污染物降解功能)多樣性的信息。2.3 單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)同DGGETGGE一樣，SSCP技術(shù)最初是用來(lái)檢測(cè)DNA已知或者特異構(gòu)象，或者點(diǎn)突變的。由于二級(jí)結(jié)構(gòu)不同，單鏈DNA在聚丙烯酰胺凝膠中泳動(dòng)速度不同，借此而被分開(kāi)。當(dāng)DNA片段大小相同且沒(méi)有變性劑存在的情況下，DNA序列決定了泳動(dòng)的速度。該方法已經(jīng)應(yīng)用到根際微生物種群組成、厭氧反應(yīng)器中細(xì)菌群落變化等方面的研究中。然而一些單鏈DNA可以形成不止一個(gè)穩(wěn)定的構(gòu)象，因此在凝膠中多個(gè)條帶可能代表同一種序列。Vacca等25利用PCR-SSCP圖譜分析六個(gè)處理生活污水的實(shí)驗(yàn)型人工濕地進(jìn)出口、植物根區(qū)及基質(zhì)不同深度的微

15、生物群落的多樣性，以判斷濕地中填料類(lèi)型、植物種植與否對(duì)菌群的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的微生物群落的存在與基質(zhì)類(lèi)型有關(guān)。謝冰等26利用PCR-SSCP技術(shù)對(duì)上海夢(mèng)清園蘆葦人工濕地進(jìn)出口微生物的多樣性， 得出異養(yǎng)菌、硝化細(xì)菌和反硝化細(xì)菌各個(gè)季節(jié)的分布不一，微生物功能群的分布與濕地中不同營(yíng)養(yǎng)水平有關(guān)。2.4 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP)和擴(kuò)增核糖體DNA限制性分析(ARDRA)RFLP、ARDRA是一種基于DNA多態(tài)性的研究微生物多樣性的方法。在Liu等27的研究中，PCR擴(kuò)增的rDNA被四堿基的限制性?xún)?nèi)切酶酶切，利用瓊脂糖或者非變性聚丙稀酰胺凝膠分離不同長(zhǎng)度的片段。但是有時(shí)候在不同的種群中，條帶太復(fù)

16、雜而無(wú)法利用RFLP來(lái)分析，因?yàn)?個(gè)種就可能有6個(gè)限制性片段。如果用六個(gè)堿基的酶來(lái)酶切DNA，每個(gè)種的限制性片段就會(huì)減少，從而增加了這種方法的可操作性。郭逍宇，董志，宮輝力等人28為探討再生水替代自來(lái)水進(jìn)行草坪灌溉的可行性，對(duì)根際層LB培養(yǎng)基10-4稀釋度平板上分離的細(xì)菌單菌落提取基因組DNA,擴(kuò)增16S rDNA片段并用限制性?xún)?nèi)切酶Hinf對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增rDNA限制性分析(ARDRA)，并采用綜合多樣性指數(shù)(H)，豐富度指數(shù)(R2)和均勻性指數(shù)(E1)等指標(biāo)評(píng)價(jià)再生水灌溉對(duì)根際微生物多樣性的影響。夏月等29通過(guò)對(duì)未污染土壤細(xì)菌16S rDNA的克隆,獲得了經(jīng)內(nèi)切酶Hae消化的不同16S

17、 rDNA的ARDRA類(lèi)型，并對(duì)測(cè)序的19個(gè)克隆子建立了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。此外，還對(duì)不同Cd和Pb污染水平的土壤微生物進(jìn)行了群落水平上的ARDRA分析.結(jié)果表明，5mg.kg-1Cd和500mg.kg-1Pb污染對(duì)微生物群落組成有一定影響，但此范圍內(nèi)的重金屬含量微生物群落多樣性沒(méi)有相關(guān)性影響。Ibekwe等30在變化植物密度和組成的濕地中研究微生物群落的組成與水質(zhì)之間的關(guān)系，六個(gè)月中每星期對(duì)濕地的不同位點(diǎn)的水化學(xué)指標(biāo)、硝酸鹽、正磷酸鹽、懸浮固體進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)50%的植物覆蓋率能將96.3%的硝酸鹽去除。2.5 末端限制性片段多態(tài)性(T-RFLP) 此法與RFLP原理相同，只是在PCR引物的一端用熒光

18、染料進(jìn)行標(biāo)記，比如TET(4，7，2，7-四氯-6羧基熒光素)或者FAM(亞磷酰胺-5-羧酸熒光素)。只需檢測(cè)被標(biāo)記的末端限制性片段，就可以分析復(fù)雜群落。它提供了關(guān)于多樣性的信息，卻簡(jiǎn)化了條帶圖譜。條帶組成還可以被用來(lái)量度不同樣品中種的豐富度、平均度和相似性。此外，該法可以自動(dòng)化，對(duì)大量土樣進(jìn)行分析。引物均是根據(jù)現(xiàn)有的16S，18S rRNA和ITS數(shù)據(jù)庫(kù)里的信息設(shè)計(jì)。到目前為止，這些引物只代表了可培養(yǎng)微生物類(lèi)群，并沒(méi)有代表實(shí)際樣品中真正的微生物多樣性。另外，應(yīng)用不同的內(nèi)切酶將產(chǎn)生不同的種群基因指紋，因此有必要利用至少2-4種不同的限制性酶進(jìn)行T-RFLP分析。許多研究者認(rèn)為，一旦T-RFLP

19、方法標(biāo)準(zhǔn)化，此法是研究環(huán)境微生物多樣性的有用工具31。Nicorarat等32利用T-RFLP技術(shù)對(duì)處理酸化煤礦水的人工濕地系統(tǒng)中微生物的多樣性進(jìn)行分析。將RFLP的結(jié)果與先前的有機(jī)體培養(yǎng)PCR、DGGE和FISH研究結(jié)合起來(lái)，說(shuō)明了相對(duì)低的微生物多樣性及嗜溫硫桿菌在好氧濕地基質(zhì)中具有優(yōu)勢(shì)。Ishida等33通過(guò)T-RFLP方法測(cè)定不同的水力負(fù)荷及水位波動(dòng)對(duì)濕地底泥中微生物結(jié)構(gòu)的影響，并根據(jù)營(yíng)養(yǎng)物的去除情況確定濕地的性能。Searcy等34利用PCR擴(kuò)增每個(gè)生物菌膜樣本上真核細(xì)菌的16S rDNA及亞硝酸還原酶基因，用T-RFLP技術(shù)分析擴(kuò)增產(chǎn)物判斷整個(gè)菌群及反硝化細(xì)菌群落的多樣性。Sleyt

20、r等35利用T-RFLP技術(shù)分析比較蘆葦濕地和芒竹濕地植物根區(qū)的微生物群落結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)不同的濕地在相似的條件下運(yùn)行具有相似的菌群結(jié)構(gòu)。在國(guó)內(nèi)相關(guān)研究也有很多。林煒鐵等36利用T-RFLP(末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)技術(shù)，分析硝化細(xì)菌富集反應(yīng)器中的微生物群落結(jié)構(gòu)，并對(duì)硝化細(xì)菌的豐度進(jìn)行半定量研究。結(jié)果表明，培養(yǎng)48h后，硝化細(xì)菌富集效果最佳，多樣性指數(shù)與初始培養(yǎng)相比下降了62.80，富集出的硝化細(xì)菌主要為亞硝酸鹽氧化菌(Nitrobacter)。依此對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)提供了可靠的科學(xué)依據(jù)。T-RFLP技術(shù)與生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合，能夠?qū)Νh(huán)境中的微生物多樣性進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的檢測(cè)，是一種比較靈敏的微生物生態(tài)學(xué)研究方

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