PCR引物設(shè)計方法和原理PPT課件

1、2021/3/91PCR引物設(shè)計方法和原理 2021/3/92一、引物設(shè)計的目的一、引物設(shè)計的目的n獲得目標(biāo)片段獲得目標(biāo)片段nDNA測序測序n基因克隆基因克隆n體外轉(zhuǎn)錄體外轉(zhuǎn)錄n突變突變n探針設(shè)計探針設(shè)計n分子標(biāo)記分子標(biāo)記2021/3/93二、引物設(shè)計的類型二、引物設(shè)計的類型n常規(guī)常規(guī)PCR引物引物nPCR同源引物和簡并引物同源引物和簡并引物n探針探針2021/3/94引物設(shè)計的步驟引物設(shè)計的步驟n下載下載DNA模板或蛋白質(zhì)序列模板或蛋白質(zhì)序列n進(jìn)行同源比較，找到保守同源序列進(jìn)行同源比較，找到保守同源序列n設(shè)計引物設(shè)計引物2021/3/95四、四、PCR引物設(shè)計的原則引物設(shè)計的原則n引物長度（

2、primer length）: 18-27 bp n GC鉗(GC clamp: 引物3端出現(xiàn)3 個以上的連續(xù)堿基，如GGG 或CCC，也會使錯誤引發(fā)機(jī)率增加n3末端堿基（3End Sequence）: n Tm 值(melting temperature) ：5260 nGC 含量（composition） ：40-60% 2021/3/96四、四、PCR引物設(shè)計的原則引物設(shè)計的原則nG 值是指DNA 雙鏈形成所需的自由能(internal stability, 用G 值反映) :選用3端G 值較低（絕對值不超過9），而5端和中間G 值相對較高的引物 n引物二聚體(primer dimer)

3、及發(fā)夾結(jié)構(gòu)（duplex formation and hairpin）的能值 :超過4.5kcal/mol易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR 反應(yīng)不能正常進(jìn)行n引物的修飾 :一般是在5端增加酶切位點(diǎn) 2021/3/97Breslauer,鄰近法的相鄰核苷酸的動力學(xué)數(shù)值(自由能)來預(yù)測雙鏈穩(wěn)定性 2021/3/98五、簡并引物的設(shè)計五、簡并引物的設(shè)計2021/3/99五、同源引物設(shè)計 2021/3/910六、網(wǎng)絡(luò)免費(fèi)在線引物設(shè)計軟件六、網(wǎng)絡(luò)免費(fèi)在線引物設(shè)計軟件2021/3/911六、引物設(shè)計常用商業(yè)軟件包六、引物設(shè)計常用商業(yè)軟件包2021/3/912七、Primer Prem

4、ier和和Oligo引物軟件引物軟件使用方法使用方法n常有引物設(shè)計軟件的引物的自動搜索和評價分析常有引物設(shè)計軟件的引物的自動搜索和評價分析 軟件的引物設(shè)計功能主要體現(xiàn)在兩個方面：首先是引物分析評價功能，該功能只有少數(shù)商業(yè)版軟件能夠做到，其中以“Oligo 6”最優(yōu)秀；其次是引物的自動搜索功能，各種軟件在這方面的側(cè)重點(diǎn)不同，因此自動搜索的結(jié)果也不盡相同。據(jù)筆者的經(jīng)驗(yàn)，自動搜索功能以“Premier Primer”為最強(qiáng)且方便使用，“Oligo 6”其次，其他軟件如“Vector NTI Suit”、“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都帶有引物自動搜索功能，但搜索結(jié)果不是十分理想。要想得到效果很好的引物，在自動搜索的基礎(chǔ)上還要輔以人工分析。筆者認(rèn)為引物設(shè)計軟件的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”軟件合并使用，以“Premier”進(jìn)行自動搜索，“Oli