三氧化二砷對人宮頸癌Hela細胞的放射增敏作用

1、三氧化二砷對人宮頸癌Hela細胞的放射增敏作用作者：湯繼英1,2， 潘東風1， 石小燕1， 王賢和1， 陳 萍1* 作者單位：(1鄖陽醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院腫瘤科，湖北 十堰 442000;2湖北中醫(yī)學院，湖北 武漢 430061) 【摘要】 目的：探討三氧化二砷(As2O3)對人宮頸癌Hela細胞的放射增敏作用及其機制。方法：MTT法確定As2O3對Hela細胞的半數(shù)致死濃度(ID50);克隆形成法觀察20%ID50的As2O3對Hela細胞的放射增敏作用;流式細胞儀測定細胞周期。結果：細胞生長抑制率隨As2O3濃度增加而增高; As2O3+照射組的細胞存活率、D0值和Dq值均小于單純照射組(P

2、<0.05);存活曲線肩區(qū)(Dq)變小，放射增敏比(SER)為1.39;As2O3和-射線均能使細胞阻滯在G2/M期，聯(lián)合應用比單獨應用抑制作用顯著(P<0.01)。結論：As2O3對宮頸癌Hela細胞株有明顯的放射增敏作用;可能與As2O3改變細胞周期有關。 【關鍵詞】 三氧化二砷;宮頸癌;Hela細胞;放射增敏劑 Irradiation Enhancement of Arsenic Trioxide on Human Cell Line of Cervical Cancer TANG Ji-ying1,2,PAN Dong-feng1,SHI Xiao-yan1,WANG Xi

3、an-he1,CHEN Ping1* (1Department of Oncology,Renmin Hospital,Yunyang Medical College,Shiyan,Hubei 442000;2Hubei College of Traditional Chinese Medicine,Wuhan,Hubei 430061,China) Abstract: Objective To investigate the irradiation enhancement effect of arsenic trioxide on human cervical carcinoma Hela

4、cells and its possible mechanism.Methods MTT assay was used to measure the survival rate of the cervical carcinoma Hela cells.Then the half inhibitory dosage (ID50)was calculated.Colony forming assay was carried out to take count of survival fraction.Cell survival curve was analyzed with Multi-targe

5、t single-hit model and then sensitive enhancement ratio(SER) was calculated.Flow cytometry was performed to assess the influence of arsenic trioxide on cell cycle distribution. Results (1)Inhibitory effect of arsenic trioxide on cell proliferation was in a dose-dependent manner.(2)Cell survival rate

6、 was lower after treatment with the combination of arsenic trioxide and radiation than that of radiation alone,Dq and D0 value were decreased after treatment with the combination of arsenic trioxide and radiation than that of radiation alone(Dq :1.03 Gy vs 1.89 Gy, D0 :2.49 Gy vs 3.45 Gy),with SER b

7、eing 1.39.(3)Both Gy 60Co - and 2mol/L arsenic trioxide could arrest Hela cell to G2/M as assayed by flow cytometry.The inhibitory effect was much more obvious when arsenic trioxide and irradiation were combined than either of them was used alone. Conclusion Arsenic trioxide is able to enhance radia

8、tion effect obviously on human cervical squamous carcinoma Hela cells,which may be due to its regulation on cell cycle. Key words:Arsenic trioxide;Cervical carcinoma;Hela cell;Radiosensitizer 宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，治療以手術及放療為主，lIa期以上多采用放療。目前臨床上提高腫瘤的放射敏感性主要利用化療藥物如順鉑、泰素等，但是由于化療藥物對正常細胞的毒性作用較大，且與放療的副反應有協(xié)同作用，病人一

9、般難以耐受。近年來研究發(fā)現(xiàn)許多中草藥具有抗腫瘤、放療增效等作用, 三氧化二砷(As2O3)就是其中的一種。As2O3是中藥砒霜的主要成分，對卵巢癌、惡性膠質(zhì)瘤、淋巴瘤等1-3腫瘤的放療具有增敏效應，但其在宮頸癌方面的研究則較少。本研究擬觀察As2O3對Hela細胞的放射增敏作用,并探討其可能的作用機制。 1 材料與方法 1.1 材料 人宮頸癌Hela細胞(武漢大學中南醫(yī)院腫瘤研究所);亞砷酸氯化鈉注射液(哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司，用生理鹽水配制成1 mmol/L的儲存液，4 冰箱備用，使用前用培養(yǎng)液稀釋至所需濃度);GWXJ80型60Co遠距離治療機;流式細胞儀(美國Beckman Colute

10、r公司)。 1.2 細胞培養(yǎng)及照射條件 宮頸癌Hela細胞培養(yǎng)于含10%新生牛血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，并置于含5%CO2的37 溫箱中培養(yǎng)。60Co遠距離治療機室溫下照射，-射線的劑量率40 cGy/min。 1.3 Hela細胞對As2O3藥物敏感性測定 亞砷酸氯化鈉注射液稀釋至0.5、1、5、10、25、50 、75 、100 mol/L 8個濃度，每個濃度設5個復孔，取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)過夜(每孔1×l04個細胞，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液200 L)，次日換液,加As2O3使其終濃度如上。培

11、養(yǎng)48小時后每孔加入MTT(5 g/L) 20 l，繼續(xù)孵育4 h，吸去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜(DMSO) 200 L，振動10 min后酶標儀檢測波長為572 nm的吸光度值，計算細胞抑制率。抑制率=1-(實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%，繪圖后求半數(shù)致死劑量(ID50)值。 1.4 克隆形成法觀察放射增敏作用 按放療劑量0、1、2、4、6、8 Gy分為6個組，于25 cm2培養(yǎng)瓶中分別接種不同數(shù)量的細胞，每組設3個平行樣本，每個劑量組分別設單純照射(單放組)和照射+2 mol/L As2O3(藥放組)，待細胞貼壁后藥放組加入As2O3，使其終濃度為20%ID50，2

12、4 h后接受照射，照射后24 h棄掉含藥物的培養(yǎng)液，換含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)1113 d后固定、染色，計數(shù)含50個細胞以上的克隆數(shù)。 存活分數(shù)的計算方法為：處理組克隆形成率/對照組克隆形成率，采用"多靶單擊模型4"擬合細胞存活曲線，計算放射增敏比(SER)。"多靶單擊模型"方程：SF=1-(1-e-D/D0)N, Dq=D0N，其中SF為細胞存活率，D為放射劑量(Gy)，D0代表平均致死量，Dq代表準域劑量，N為外推數(shù)。 1.5 細胞周期分析 將細胞接種于培養(yǎng)瓶中，分為空白組、As2O3組(單藥組)、單純照射(單放組)、照射

13、+2 mol/L As2O3(藥放組)，每個組設3個平行樣本，待細胞貼壁后藥物干預組加藥， 終濃度為2 mol/L As2O3，24 h后單放及藥放組接受2 Gy放療，收集處理后的1.0×106個細胞用PBS清洗2次(1 500 r/min，5 min)，加入70%冷乙醇4 固定過夜，清洗去除固定液，加入PBS 100 L混勻細胞，再加入10 g/L RNAase 2 L，充分混勻，置37 水浴鍋中加溫30 min，加碘化丙啶(PI)染色液 (20 g/mL)，常溫避光30 min后，流式細胞儀檢測，Multicycle軟件分析，結果以細胞周期各時相細胞百分率表示。 1.6 統(tǒng)計學方

14、法 所得數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(x±s)的形式表示，Execl軟件模擬細胞生長抑制曲線，SPSS 13.0軟件模擬生存曲線并進行方差分析，以P<0.05為差別有顯著性，以P<0.01為差別有極顯著性差異。 2 結果 2.1 Hela細胞對As2O3藥物敏感性 細胞生長抑制率隨As2O3濃度的增加而增大，繪圖后求半數(shù)致死劑量(ID50)值10.86 mol/L(見圖1)。 圖1 三氧化二砷對Hela細胞的生長抑制 2.2 As2O3對Hela細胞的放射增敏作用 放射劑量-細胞存活曲線見圖2，多靶單擊模型主要參數(shù)見表1。結果顯示As2O3對宮頸癌Hela細胞有放射增敏作

15、用，經(jīng)藥物處理后平均致死劑量(D0)降低，存活曲線肩區(qū)(Dq)變小。表1 照射后Hela細胞存活曲線主要參數(shù) 2.3 細胞周期分析 流式細胞儀檢測細胞周期結果表明，放射及藥物均能提高G2/M期的細胞比例，二者聯(lián)合能顯著提高效果(P<0.01)(見表2)。表2 As2O3與放療對Hela細胞周期的影響(%) 3 討論 As2O3是中藥砒霜的主要成分，其臨床適應癥不僅僅局限于白血病的治療，對實體瘤的臨床應用研究也日趨增多。有關As2O3對細胞殺傷機制的研究大多與As2O3具有放射增敏效應有關1-3，但As2O3對宮頸癌放射增敏的研究報道甚少5。本研究利用 MTT法確定As2O3對宮頸癌細胞系

16、Hela的細胞毒作用,證實細胞生長抑制隨As2O3濃度的增加而增強，48 h半數(shù)致死劑量(ID50)值10.86 umol/L,說明As2O3與放射治療聯(lián)合對宮頸癌具有增敏作用。 "多靶單擊模型"擬合經(jīng)典的細胞存活曲線,其參數(shù)D0值為平均致死劑量,是一次照射能殺滅63%的細胞或37%細胞存活的劑量;Dq值是肩寬參數(shù),它表明細胞亞致死損傷修復能力的大小,Dq值小表明細胞對亞致死損傷的修復能力較弱，本實驗存活曲線參數(shù)亦證實了As2O3對離體宮頸癌細胞的放射增敏作用。提示As2O3通過抑制Hela細胞的修復而起到放射增敏作用。 有研究認為As2O3可以上調(diào)細胞周期蛋白B的表達，該

17、蛋白是調(diào)節(jié)G2/M期轉(zhuǎn)換的關鍵調(diào)控蛋白之一，可以促進Bcl-2磷酸化，從而導致G2/M期阻滯6-7。沈志忠等8認為As2O3作為一種巰基抑制劑，可能通過原漿毒作用與細胞內(nèi)的巰基成分微管相交聯(lián)，阻滯微管的形成與聚合，改變細胞內(nèi)微絲的形態(tài)結構進而影響細胞周期，導致G2/M期阻滯，產(chǎn)生抗癌或抑癌作用。Liu Q等9認為As2O3可以導致胃癌CGL-2細胞DNA雙鏈損傷，并且抑制DNA損傷的G2稽查點活化，使CGL-2細胞系阻滯于G2/M，可能進一步促進CGL-2系的凋亡。As2O3誘導細胞凋亡并促細胞阻滯于G2/M期在對多發(fā)骨髓瘤細胞及胃癌MKN45細胞系的研究中也得到證實10-11， 并且這種效應

18、呈時間-劑量依賴性。本研究流式細胞分析結果顯示放療及As2O3均能致Hela細胞G2/M期阻滯，而G2/M的細胞對射線最敏感，因此As2O3誘導宮頸癌細胞周期阻滯可能是其放射增敏的機理之一，但長期應用As2O3是否會引起致癌、致畸等毒副作用則有待更深入研究。 (感謝鄖陽醫(yī)學院附屬人民醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所全體工作人員對本實驗給予的指導與幫助!) 【參考文獻】 1張大昕,王 兵,胡雷光.三氧化二砷對卵巢癌細胞的放射增強作用J.中華放射腫瘤雜志，2003,12(1):16-18. 2Ning S,Knox SJ.Optimization of combination therapy of arseni

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