天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)

1、天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)夸泴?shí)驗(yàn)須知實(shí)驗(yàn)一 薄層板的制備、活度測(cè)定及應(yīng)用實(shí)驗(yàn)二 粉防已生物堿的提取、分離與鑒定實(shí)驗(yàn)三 掌葉防已堿的提取及硫酸延胡索乙素的制備實(shí)驗(yàn)四 湖北貝母總生物堿的提取與初步鑒定實(shí)驗(yàn)五 秦皮中七葉苷、七葉內(nèi)酯的提取、分離和鑒定實(shí)驗(yàn)六 虎杖中游離羥基蒽醌成分的提取和分離實(shí)驗(yàn)七 蘆丁的提取、分離與鑒定實(shí)驗(yàn)八 穿心蓮內(nèi)酯的提取、分離、鑒定及亞硫酸氫鈉加成物的制備實(shí)驗(yàn)九 薯蕷皂苷元的提取和鑒別 實(shí)驗(yàn)十 中草藥成分鑒別法 附錄一 常用試劑及配制方法 附錄二 常用有機(jī)溶媒的性質(zhì)及回收方法 實(shí)驗(yàn)須知天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)是天然藥物化學(xué)課程的重要組成部分，是使學(xué)生進(jìn)一步理論聯(lián)系實(shí)際，掌握中草藥有效成分

2、提取、分離和鑒定的基本操作技能，提高學(xué)生分析和解決問(wèn)題能力，養(yǎng)成嚴(yán)密科學(xué)態(tài)度和良好工作作風(fēng)必不可少的教學(xué)環(huán)節(jié)。一、天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)須知1. 遵守實(shí)驗(yàn)室制度，維護(hù)實(shí)驗(yàn)室安全，不違章操作，嚴(yán)防爆炸、著火、中毒、觸電、漏水等事故的發(fā)生，若發(fā)生事故應(yīng)立即報(bào)告指導(dǎo)教師。2實(shí)驗(yàn)前作好預(yù)習(xí)，明確實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，了解實(shí)驗(yàn)的基本原理和方法，安排好當(dāng)天計(jì)劃，爭(zhēng)取準(zhǔn)時(shí)結(jié)束。實(shí)驗(yàn)過(guò)程應(yīng)養(yǎng)成及時(shí)記錄的習(xí)慣，凡是觀察到的現(xiàn)象和結(jié)果及有關(guān)的重量、體積、溫度或其他數(shù)據(jù)，應(yīng)立即如實(shí)記錄。實(shí)驗(yàn)完畢后，認(rèn)真總結(jié)，寫(xiě)好報(bào)告，將提取純化所得單體產(chǎn)物包好，貼上標(biāo)簽（日期、樣品名稱、純度、mp、bp、TLC、重量）交給老師。3實(shí)驗(yàn)中應(yīng)保持安靜，

3、不許大聲喧嚷，不許抽煙，不遲到、不隨便離開(kāi)。實(shí)驗(yàn)臺(tái)面應(yīng)保持清潔，使用過(guò)的儀器及時(shí)清洗干凈，存放在實(shí)驗(yàn)柜內(nèi)。廢棄的固體和濾紙等丟入廢物缸內(nèi)，絕不能丟入水槽、下水道和窗外，以免堵塞和影響環(huán)境衛(wèi)生。4使用儀器時(shí)要輕拿、輕放，貴重儀器未經(jīng)教師允許不得擅自動(dòng)用。一旦損壞儀器應(yīng)及時(shí)報(bào)損、補(bǔ)領(lǐng)，不得亂拿，亂用別人的儀器。公用儀器及藥品用完后立即返還原處，破損儀器應(yīng)填寫(xiě)破損報(bào)告單，注明原因。節(jié)約用水、用電、藥用試劑，嚴(yán)格藥品用量。5保持實(shí)驗(yàn)室內(nèi)整潔，學(xué)生采取輪流值日。每次實(shí)驗(yàn)完畢，負(fù)責(zé)整理公用儀器，將實(shí)驗(yàn)臺(tái)、地面打掃干凈，倒清廢物缸，檢查水、電和門窗是否關(guān)閉。 二、實(shí)驗(yàn)報(bào)告格式 天然藥物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告的格式不是

4、固定不變的，可以按題目的內(nèi)容及要求作適當(dāng)調(diào)整。一般包括下列內(nèi)容：1. 題目2目的要求3基本原理 主要的提取分離及鑒定原理。4步驟 簡(jiǎn)明扼要概括實(shí)驗(yàn)步驟，包括現(xiàn)象記錄。5實(shí)驗(yàn)結(jié)果 包括化學(xué)反應(yīng)的試劑、現(xiàn)象及結(jié)論，色譜鑒定條件，產(chǎn)品顏色、晶形、重量、熔點(diǎn)以及得率等。 6討論 包括實(shí)驗(yàn)過(guò)程中主要注意事項(xiàng)、關(guān)鍵步驟、實(shí)驗(yàn)成敗的原因及心得體會(huì)。7思考題 可以根據(jù)老師的要求，回答各實(shí)驗(yàn)中的某些思考題。實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求字跡端正，圖表清楚敘述有條理，盡量做到既有觀察的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象又有說(shuō)明和解釋；既有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)又有分析和結(jié)論；既有成敗的經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)又有自己的實(shí)踐體會(huì)，甚至有改進(jìn)的建議。實(shí)驗(yàn)一 薄層板的制備、活度測(cè)定及應(yīng)用一、

5、實(shí)驗(yàn)要求1. 掌握薄層板的制備及薄層層析的操作方法2掌握吸附劑活度測(cè)定的原理及方法3應(yīng)用薄層層析法檢測(cè)中草藥化學(xué)成分二、實(shí)驗(yàn)原理當(dāng)一個(gè)混合物被倒入固定相中，并用另一個(gè)流動(dòng)相洗脫時(shí)，由于混合物中各組份與固定相和流動(dòng)相的相互之間的作用不同，致使各組份通過(guò)固定相的速率不同，從而使混合物中各組份得到分離。三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑儀器：烘箱，玻璃板，研缽，水浴鍋，天平，薄層涂布器試劑：氧化鋁，纖維素，聚酰胺, 硅膠, 羧甲基纖維鈉，甲酸，0.01%二甲基黃、蘇丹紅，靛酚藍(lán)，苯，偶氮苯，對(duì)甲氧基偶氮苯，蘇丹黃，蘇丹紅，對(duì)氨基偶氮苯，四氯化碳四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）薄層板的制備1. 加粘合劑的薄層涂布法（1）氧化鋁薄層

6、將吸附劑置于薄層涂布器中，調(diào)節(jié)涂布器的高度，向前推動(dòng)，即得均勻薄層。本實(shí)驗(yàn)主要用下述簡(jiǎn)易操作涂布薄層，取表面光滑、直徑統(tǒng)一的玻璃一支，依據(jù)所制備薄層的寬度、厚度要求，在玻璃棒兩端套上厚度為0.31 mm的塑料圈或金屬環(huán)，并在玻璃棒一端一定距離處套上較厚的塑料圈或金屬環(huán)，以使玻璃棒向前推動(dòng)時(shí)能保持平行方向，操作時(shí)，將氧化鋁粉均均地鋪在玻璃板上，勻速向前推動(dòng)。（2）纖維素薄層一般取纖維素粉1份加水約5份，在燒杯中混合均勻后，倒在玻璃板上，輕輕振動(dòng)，使涂布均勻，水平放置，待水分蒸發(fā)至近干，于100±2干燥3060分鐘即得。（3）聚酰胺薄層取錦綸絲（無(wú)色干凈廢絲即可）用乙醇加熱浸泡23次，除

7、去臘質(zhì)等。稱取洗凈的錦綸絲1克，加85%甲酸10ml，在水浴上加熱使溶，再加70 %乙醇6 ml。繼續(xù)加熱使完全溶解成透明膠狀溶液。將此溶液適量倒在水平放置的，用清潔液洗凈的玻璃片上，并自然向周圍推勻，厚度約0.3 mm，薄層太厚時(shí)，干后會(huì)裂開(kāi)。將鋪好的薄層水平放在盛溫水的盤上，使盤中的水蒸汽能熏濕薄層，盤子加玻璃板蓋嚴(yán)密，薄板放置約1小時(shí)完全固化變不透明白色，再放數(shù)小時(shí)后，泡在流水中洗去甲酸，先在空氣中晾干，后在烘箱中0恒溫加熱活化15分鐘，冷后置干燥器中貯存?zhèn)溆谩?加粘合劑薄層的涂布法（1）硅膠G薄層 取硅膠G或硅膠GF一份，置燒杯中加水約5份混合均勻，放置片刻，隨即用藥匙取一定量，分別倒

8、在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推動(dòng)涂布），均勻涂布成0.250.5 mm厚度，輕輕振動(dòng)玻璃板，使薄層面平整均勻，在水平位置放置，待薄層發(fā)白近干，于烘箱中100活化0.51小時(shí)，冷后貯于干燥器內(nèi)備用?；罨瘻囟群蜁r(shí)間可依需要調(diào)整，一般檢識(shí)水溶性成分或一些極性大的成分時(shí)，所用薄層板只需在空氣中自然干燥，不經(jīng)活化即可貯存?zhèn)溆谩＃?）硅膠（H）羧甲基纖維鈉（CMC-Na）薄層 取羧甲基纖維素0.2 g，溶于25 ml水中，在水浴上加熱攪拌使完全溶解，倒入燒杯中，加薄層層析用硅膠（顆粒度1040 m的約68 g）混成均勻的稀糊，按照硅膠G薄層涂布法制備薄層，或取0.8 %羧甲基纖維納10 ml，倒

9、入廣口瓶（高約1012 cm）中，然后逐步加入薄層層析用硅膠3.3克，不斷振搖成均勻的稀糊，把兩塊載玻片面對(duì)面結(jié)合在一起，這樣每片只有一面與硅膠糊接觸，使薄片浸入硅膠稀糊中，然后慢慢取出，分開(kāi)二塊薄片，將未粘附硅膠糊的那一面水平放在一張清潔的紙上，讓其自然陰干，100下烘30分鐘。冷后于干燥器內(nèi)備用。未消耗的硅膠稀糊可貯存在廣口瓶?jī)?nèi)，以供再用。氧化鋁薄層、氧化鋁羧甲基纖維鈉薄層的制備方法同上，一般所需要氧化鋁比硅膠稍多。目前國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)有預(yù)先制好的薄層板，底板用玻璃、塑料、鋁片等。可按需要用玻璃刀劃割，也有用剪刀剪成所要的大小，使用方便，價(jià)格貴些。3特殊薄層的制備根據(jù)分離工作的特殊需要，可制成以

10、下幾種特制薄層。（1）酸、堿薄層和pH緩沖薄層為了改變吸附劑的酸堿性，以改進(jìn)分離效果，可在吸附劑中加入稀酸溶液（如0.10.5 N草酸溶液）代替水制成酸性氧化鉛薄層使用。硅膠微呈酸性，可在鋪層時(shí)用稀堿溶液（如0.10.5 N氫氧化鈉溶液）代替水制成堿性的硅膠薄層。可用醋酸鈉、磷酸鹽等不同pH的緩沖液代替水鋪層，制成一定pH緩沖的薄層。羧甲基纖維素鈉溶液一般用0.51%濃度，宜預(yù)先配制后靜置，取其上層澄清溶液應(yīng)用，則所制得的薄層表面較為細(xì)膩平滑。常用0.8%濃度。CMC-Na系中粘度、300500厘泊（粘度單位）。CMC-Na系碳水化合物，調(diào)制時(shí)應(yīng)在水浴上進(jìn)行。活化溫度不應(yīng)過(guò)高，防止碳化。（2）

11、絡(luò)合薄層硝酸銀薄層的制法，可在吸附劑中加入525%硝酸銀水溶液代替水制成均勻糊狀，再按常法鋪成薄層，制成薄層避光陰干，于105活化半小時(shí)后避光貯存。制成的薄層以不變成灰色為好，在三天內(nèi)應(yīng)用。也可先把硝酸銀用少量水溶解，再用甲醇稀釋成10%溶液，把預(yù)先制好的硅膠G薄層浸入此溶液中約1分鐘，取出避光陰干，按上法活化，貯存。（二）吸附劑的活度測(cè)定1. 氧化鋁活度的測(cè)定一般可用45種偶氮染料以薄層層析法進(jìn)行測(cè)定。染料試劑的配制：取偶氮苯（Azobenzene）50mg，對(duì)甲氧基偶氮苯（P-Methoxyuzobenzene）,蘇丹黃（Sudan I, Benzeneazo-naphthol），蘇丹紅（

12、Sudan Tetrazobenzol-naphthol），對(duì)氨基偶氮苯（P-Aminoazobenzene）各20mg，分別溶于50ml重蒸餾的四氯化碳（經(jīng)氫氧化鈉干燥）中。常法制備不含粘合劑氧化鋁薄層，以鉛筆尖或毛細(xì)管尖在薄層板一端23 cm處間隔1cm左右輕輕點(diǎn)上5個(gè)可以看清的小點(diǎn)。各吸取約0.02 ml染料試劑分別點(diǎn)于原點(diǎn)上，以四氯化碳為展開(kāi)劑，展開(kāi)時(shí)薄層板與容器底部交角為1040° 之間，展開(kāi)后測(cè)出各斑點(diǎn)的Rf值，從表1確定氧化鋁的活度（一般高活性氧化鋁級(jí)活度使用本法時(shí)，結(jié)果往往偏低）。另取不含粘合劑氧化鋁薄層板一塊，置于水蒸汽飽和容器內(nèi)，23小時(shí)后取出，按上述方法測(cè)定活度

13、。觀察有無(wú)變化。2硅膠活度的測(cè)定一般選用三種染料的薄層層析法進(jìn)行測(cè)定。歐洲藥典1969年記載用0.01%二甲基黃（Dimethy-yellow. P-Dimethylaminoazobenzene）、蘇丹紅（Sudan ）、靛酚藍(lán)（Indophenol blue 4-Tapnthoquinone-4-dimethyl aminoaniline）的苯溶液各10 l點(diǎn)滴于硅膠G或硅膠H薄層上，以苯為展開(kāi)劑，展開(kāi)10 cm（約20分鐘），三種染料應(yīng)明顯分離。靛酚藍(lán)斑點(diǎn)接近于起始線，二甲基黃斑點(diǎn)在薄層的當(dāng)中，蘇丹紅斑點(diǎn)在兩斑點(diǎn)之間，則認(rèn)為薄層板活性符合要求。國(guó)內(nèi)青島海洋化工廠出售薄層層析用的硅膠在吸附

14、劑名稱之后加幾個(gè)字標(biāo)明的意思是：硅膠G（G是Gypsum石膏的縮寫(xiě)，表示加了石膏），硅膠H（H表示不加石膏），硅膠GF254（F254表示加石膏和在波長(zhǎng)254 nm處顯綠色熒光的硅酸鋅錳），硅膠GF365（表示加石膏和在波長(zhǎng)365 nm處顯黃色熒光的硫化鋅鎘）。氧化鋁則類推。表1 氧化鋁活度與偶氮染料比移值關(guān)系偶氮染料氧化鋁活度級(jí)Rf值二級(jí)三級(jí)四級(jí)五級(jí)偶氮苯0.590.720.850.95對(duì)甲氧基偶氮苯0.160.450.690.89蘇丹黃0.020.250.870.98蘇丹紅0.000.100.350.50對(duì)氨基偶氮苯0.000.050.080.19（三）薄層層析的應(yīng)用薄層層析法在中草藥化學(xué)

15、成分的研究中，主要應(yīng)用于化學(xué)成分的預(yù)試、化學(xué)成分的鑒定及探索柱層分離的條件。用薄層層析進(jìn)行中草藥化學(xué)成分檢識(shí)，可依據(jù)各類成分性質(zhì)及熟知的條件有針對(duì)性地進(jìn)行。由于在薄層上展開(kāi)后，可將一些雜質(zhì)分離，選擇性高，可使預(yù)試結(jié)果更為可靠，不僅可通過(guò)顯色獲知成分類型，而且可初步了解主要成分的數(shù)目及其極性大小。例一：湖北貝母生物堿成分的TLC檢識(shí)吸附劑：硅膠CMC- Na薄層樣品：湖北貝母總生物堿氯仿溶液展開(kāi)劑：C6H6-EtOAc-NHEt2（6：4：1）顯色劑：改良碘化鉍鉀噴霧例二：丹參色素的TLC檢識(shí)吸附劑：硅膠G-CMC-Na板樣品：丹參乙醚提取液展開(kāi)劑：石油醚-乙酸乙酯（9：1）記錄TLC結(jié)果五、問(wèn)

16、題與討論1. 硅膠、氧化鋁、聚酰胺各適合于分離哪些類型的化合物？2. 什么是制備薄層？簡(jiǎn)要寫(xiě)出其操作過(guò)程。3. 什么是邊緣效應(yīng)？怎樣產(chǎn)生的？如何克服？實(shí)驗(yàn)二 粉防已生物堿的提取分離與鑒定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊? 掌握生物堿的一般提取方法。2 用低壓柱層析分離、純化單體的方法及薄層層析鑒定二、實(shí)驗(yàn)原理漢防己為防己科千金藤屬物Stephania tetrandra S. Mcore的根，是祛風(fēng)解熱鎮(zhèn)痛藥物，其有效成分為生物堿，主要是漢防己甲素和漢防已乙素。臨床上除用作治療高血壓、神經(jīng)性疼痛、抗阿米巴原蟲(chóng)外，還將粉防已生物堿的碘甲基或溴甲基化合物作為肌肉松弛劑應(yīng)用。此外，漢防已甲素在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中有抗癌和擴(kuò)張

17、血管的作用。漢防已根中總生物堿含量為1.52.3%，主要為漢防已甲素，含量約1%；漢防已乙素，含量約0.5%；輪環(huán)藤酚堿，含量為0.2%；以及其它數(shù)種微量生物堿。1. 漢防已甲素（Tetrandrine，漢防已堿，粉防已堿）無(wú)色針晶，不溶于水和石油醚，易溶于乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醚和氯仿等有機(jī)溶劑及稀酸水中，可溶于苯。Mp 216，有雙熔點(diǎn)現(xiàn)象，自丙酮中結(jié)晶者，150左右熔后加熱又固化，至213復(fù)熔。2. 漢防已乙素（Fangchinoline, 又稱防已諾林堿，去甲粉防已堿）溶解行為與漢防已甲素相似，因有一個(gè)酚羥基，故極性較漢防已甲素稍高，在苯中的溶解度小于漢防已甲素而在乙醇中又大于漢防已

18、甲素，籍此可以相互分離。用不同溶劑重結(jié)昌時(shí)，其晶形和溶點(diǎn)不同：乙醇 細(xì)棒狀結(jié)晶 mp 2456甲醇 細(xì)棒狀結(jié)晶 mp1779丙酮 六面粒狀晶 mp134吡啶-甲醇 mp 1212 環(huán)已烷-乙酸乙酯 mp 1563. 輪環(huán)藤酚堿（Cylanoline）為水溶性季銨生物堿，不溶于極性溶劑，氯化物為無(wú)色，八面體狀結(jié)昌，mp 2146；碘化物為無(wú)色絹絲狀結(jié)晶，mp185；苦味酸鹽為黃色結(jié)晶，mp1546。三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑儀器：滲漉筒，抽濾瓶，索氏提取器，真空泵，低壓柱，空壓機(jī)，烘箱，天平試劑：漢防已，0.5%H2SO4，新鮮石灰乳，乙醚，95%乙醇，NaCl，硅膠，丙酮，環(huán)已烷，乙酸乙酯，二乙胺，改

19、良碘化鉍鉀四、實(shí)驗(yàn)步驟1. 生物堿的提取分離（1）總生物堿的提取及親脂性與親水性生物堿的分離 漢防已藥材粗粉100g 0.5%H2SO4液滲漉（注一）酸水滲漉液（為原料的310倍量V/V） 加新鮮石灰乳調(diào)pH910，靜置，抽濾 泥黃色沉淀 堿水液 （水溶性季銨堿及水溶性雜質(zhì)） 將沉淀與凈砂拌勻（注二） 80烘干，置索氏提取器中用乙醚（約180 ml）提取至 提盡生物堿（注三） 回收乙醚（注四） 乙醚提取物 用95%乙醇4060 ml回流熱溶后 傾入500 ml水中，加30 g NaCl鹽析 水溶上加熱至凝結(jié)，靜置 抽濾 白色沉淀（親脂性叔胺總堿，以漢防已甲素、乙素為主）注一：將漢防已藥材粗粉加

20、適量酸水液，以能將生藥粉末潤(rùn)濕為度（約150 ml），充分拌勻，放置半小時(shí)，均勻而致密地裝入滲筒內(nèi)，用錐形瓶底部或其它平底工具壓緊，供滲漉用，流速約1.5 ml/分。注二：凈砂必須事前洗凈烘干，拌和量最好不要超過(guò)120 g，以免索氏提取器一次裝不下或裝得過(guò)多，提不盡生物堿。注三：檢查生物堿是否提盡的方法，是取最后一次乙醚提取液約數(shù)滴，揮去乙醚，殘?jiān)?%HCl 0.5 ml溶解后，加改良碘化鉍鉀試劑一滴，無(wú)沉淀折出或明顯渾濁時(shí)，表明生物堿已提盡，或基本提盡。反之，應(yīng)繼續(xù)提取。注四：先將提取器內(nèi)濾紙筒取出。然后將提取玻璃筒內(nèi)最后一次乙醚提取液傾出（另器貯存），再將提取玻璃筒安裝好，繼續(xù)加熱，回收

21、燒瓶中乙醚于玻璃筒中，至燒瓶?jī)?nèi)的乙醚提取液體積較小時(shí)，停止回收，將燒瓶中乙醚提取液傾出。2. 低壓柱層析分離漢防已甲素和乙素低壓柱層析在低壓下（0.53 kg/cm2，一般0.31.2 kg/cm2）采用顆粒直徑介于經(jīng)典柱層析（100200 m）和HPLC（37 m）之間的薄層層析用硅膠（或氧化鋁）H或G（5075 m）作為填充劑的一種層析柱，其基本原理與HPLC相同，分離效果也介于經(jīng)典柱與HPLC之間。用減壓干法裝柱，鋪層緊密均勻，層析帶分布集中整齊，同時(shí)薄層層析的最佳分離溶劑系統(tǒng)可以直接用于低壓柱層析。它是一種分離效果較好，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作方便，快速的方法，適宜于天然產(chǎn)物的常量制備性分離。（

22、注）氣體輸入裝置，可采用小型空氣壓縮機(jī)或氮?dú)怃撈?. 裝柱 減壓干法裝法，層析柱規(guī)格：柱長(zhǎng)30 cm，內(nèi)徑2 cm，共裝硅膠約30 g（高約22 cm）。（1）拌樣加樣 取漢防已堿約150 mg，加少量丙酮熱溶（剛?cè)転槎龋┯玫喂芗拥?.5 g硅膠上，仔細(xì)拌勻，水浴上蒸干，碾細(xì)，通過(guò)一個(gè)長(zhǎng)頸漏斗小心加在柱頂，輕輕垂直頓擊，待樣品表面平整不拌動(dòng)時(shí)，上面再蓋約12 cm高的空白硅膠，再加蓋一園形濾紙片，壓緊。（2）洗脫 先檢查從空壓機(jī)至層析柱各閥門管道是否正常，關(guān)緊各個(gè)閥門，開(kāi)動(dòng)空壓機(jī)至額定壓力（5.8 kg/cm2）待用。用滴管順層析柱柱壁仔細(xì)加入少量洗脫劑（環(huán)已烷-乙酸乙酯-二乙胺/6：2：0.

23、8），當(dāng)液面達(dá)到一定高度時(shí)，再一次加入其余洗脫劑（共約250ml），迅速在柱頂上裝上玻璃標(biāo)口塞接頭，用鐵夾夾緊（防加壓時(shí)接頭沖開(kāi)）。小心開(kāi)啟空壓機(jī)閥門，再開(kāi)針形閥和空氣過(guò)濾減壓器（注意：壓力過(guò)大，玻璃柱會(huì)炸，一般2 kg是安全的，必要時(shí)可戴防護(hù)面罩）。調(diào)動(dòng)所需壓力，0.61.2 kg/cm2，約40分鐘后流出，控制流速1 ml/min，每10分鐘左右一管，收1215份，洗脫全過(guò)程約3小時(shí)。（3）檢查 各流份分別移入小玻璃蒸發(fā)器中，于水浴上濃縮，分別通過(guò)TLC檢查，吸附劑：硅膠G，展開(kāi)劑：環(huán)已烷-乙酸乙酯-二乙胺/6：3：1，改良碘化鉍鉀試劑噴霧顯色，以漢防已甲素、乙素為標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，合并相同組分

24、，分別獲得甲、乙素粗品，用丙酮重結(jié)晶，測(cè)定mp。（二）鑒定方法1. 衍生物制備取漢防已甲素0.2 g，溶于2 ml丙酮中，滴加苦味酸飽和水溶液至不再析出黃色沉淀為止。抽濾收集沉淀，順次以少量水、乙醚洗滌，乙醇重結(jié)晶，得漢防已甲素苦味酸鹽，mp 235242（dc）。2. 有機(jī)胺堿的TLC吸附劑：青島海洋化工廠薄層層析硅膠G，用0.3 %CMC-Na水液制板，110活化1小時(shí)。樣品：分出的漢防已甲素、乙素、總堿展開(kāi)劑：環(huán)己烷- EtOAc-NHEt2（6：2：1）顯色劑：改良碘化鉍鉀試劑（展開(kāi)后用電吹風(fēng)吹干再噴顯色劑，以免二乙胺干擾）現(xiàn)象：甲素顯色后顯淡棕色，2小時(shí)左右就褪色，而乙素顯棕色，久置

25、不褪色，可幫助其辨認(rèn)。五、問(wèn)題與討論1. 試比較漢防己甲素、乙素的極性大小，并預(yù)測(cè)低壓柱分離時(shí)他們流出的先后順序。2. 簡(jiǎn)述影響生物堿堿性的因素。實(shí)驗(yàn)三 掌葉防己堿的提取與分離及延胡索乙素制備一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?. 掌握季銨生物堿的一種提取方法。2. 掌握生物堿的一般理化性質(zhì)及其結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)系。3. 了解黃藤生物堿的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)的關(guān)系。4. 熟悉生物堿沉淀反應(yīng)的條件和方法。5掌握制備生物堿結(jié)晶性鹽的方法和精制。6掌握四氫巴馬汀的制備方法。二、實(shí)驗(yàn)原理掌葉防已堿又稱巴馬?。╬almatine），硫酸延胡索乙素又稱消旋四氫巴馬汀硫酸鹽（dltetrahydro palmatine sulphate）

26、。延胡索乙素（Corydalis B）為鎮(zhèn)靜安定藥，用于緩解胃系統(tǒng)的疾病所引起的疼痛、臨產(chǎn)陣痛、頭痛、失眠等。中藥延胡索（元胡，Corydalis yanhusuo W.T. Wang的塊根）中含延胡索乙素的量很少，而其脫氫化合物巴馬汀在某些植物中含量卻很高。在中國(guó)華南一帶的防已科植物黃藤（Fibreursa recisa paerre）的根莖中含巴馬汀，再經(jīng)氫化反應(yīng)，制備延胡索乙素。黃藤曾列入本草綱目，李時(shí)珍謂“藤生生嶺南，狀若防已，但人常服此藤，縱飲食有毒，亦自然不發(fā)”?，F(xiàn)代民間作為清熱消炎藥，常用于外傷感染、扁桃體炎、咽喉炎、結(jié)膜炎、熱痢及黃疸等。黃藤根莖及根中所含成分主要為巴馬汀，尚含

27、少量藥根堿、黃藤素甲、黃藤素乙、內(nèi)脂及甾醇，又謂在根莖、根及樹(shù)皮中含小檗堿。1 掌葉防已堿（巴馬汀，Palmatine）本品系季銨生物堿，溶于水、乙醇，幾乎不溶于氯仿、乙醚、苯等溶劑，掌葉防已堿鹽酸鹽即氯化巴馬汀（palmation Chloride）C21H22O4N ·Cl·3H2O為黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)205（分解），其理化性質(zhì)與鹽酸小檗堿類似。巴馬汀氫碘酸鹽（palmatine icdide）C21H22O4N·I·2H2O為橙黃色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)241（分解）。2. 藥根堿（雅托堿·Jatrorrhizine）本品系具酚羥基季銨鹽，其理化

28、性質(zhì)與巴馬汀類似，但較易溶于苛性堿液中，其鹽酸在水中的溶解度亦比鹽酸巴馬汀為大，可籍此性質(zhì)予以分離。藥根堿鹽酸鹽（Jatrorrhizine Chloride）C20H20O4N·Cl·H2O為銅色針狀結(jié)晶，溶點(diǎn)204206，其苦味酸鹽（Jatrorrizine picrate）C20H20O4N·C6H2O7N2為橙黃色柱狀結(jié)晶，溶點(diǎn)217220（分解）。3. 小檗堿（黃連素Berberine）本品系季銨生物堿，其游離堿為黃色長(zhǎng)針狀結(jié)晶，C20H18O4N·OH·5H2O，溶點(diǎn)145，在100干燥，失去結(jié)晶水轉(zhuǎn)為棕黃色。小檗堿能緩緩溶于水（1

29、：20）、乙醇（1：100），較易溶于熱水、熱乙醇，微溶于丙酮、氯仿、苯，幾乎不溶于石油醚中。小檗堿與氯仿、丙酮、苯均能形成加成物。小檗堿鹽酸鹽（Berberine Chloride）C20H16O4N·Cl2H2O，熔點(diǎn)205（分解），微溶于冷水，較易溶于沸水，其硝酸鹽及氫碘酸鹽，極難溶于水（冷水約1：2000），小檗堿的中性硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽在水中溶解度較大。小檗堿的鹽類在水中的溶解度：鹽酸小檗堿 1：500硫酸小檗堿 1：30（酸性鹽1：100）枸櫞酸小檗堿 1：125磷酸小檗堿 1：154. 四氫巴馬汀（Tetrahydropalmatine）:延胡索乙素為消旋四氫巴馬汀

30、，系叔胺堿，其游離堿C21H25O4N溶點(diǎn)146148，不溶于水，能溶于熱乙醇（在冷乙醇中溶解度較小），易溶于氯仿、苯、乙醚中。延胡索乙素的酸性硫酸鹽為無(wú)色針狀結(jié)晶，溶點(diǎn)245246，在冷水中溶解度較小，在熱水中較大。其中性硫酸鹽為長(zhǎng)柱狀結(jié)晶，熔點(diǎn)220，在水中溶解度較酸性硫酸鹽為大，其鹽酸鹽難溶于水。左旋四氫巴馬汀即顱痛定（Rotundine）熔點(diǎn)141142，D16-257.5°（C=1.1氯仿）。本品在華千金藤（Stephania sinica Diels）及圓葉千金藤（S. rotundalour）的塊根（山烏龜）中含量較多。5黃藤素甲本品為制備氯化巴馬汀的乙醇母液中的少量成

31、分，為季銨堿鹽的鹽酸鹽C26H29O7N·HCl·H2O熔點(diǎn)196198，+273.3°（C=1，乙醇），其還原物為白色針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)134186，+146.6°（C=1，酸）。6黃藤素乙本品系粗制巴馬汀氫化、堿化分去四氯巴馬汀后母液中的微量物質(zhì)，溶于氯仿。以氯仿-乙醇重結(jié)晶得黃色結(jié)晶，熔點(diǎn)192193，+233.3（C=1，氯仿）。7黃藤內(nèi)酯本品得自粗氯化巴馬汀重結(jié)晶的不溶于水物質(zhì)中，反復(fù)以酒精、丙酮重結(jié)晶，得光亮棱狀結(jié)晶，C27H23O9，熔點(diǎn)273，+36.60 (C=1，乙醇)。8黃藤甾醇本品得自制備氯化巴馬汀的乙醇母液中，分出的少量油層經(jīng)10%

32、KOH皂化得到的白色針晶，熔點(diǎn)136137，+24.51(C=1，氯仿)。9主要提取成分的理化性質(zhì)：（1）氯化巴馬?。篗p 209210（分解）UV MeOH max nm: 224, 265-273, 337-347, 430MeOH min nm: 249，302，377IR V KBr maxcm-1: 2940, 1600, 1510, 1450, 1362, 1329, 1270, 1230, 1215, 1190, 1135, 1105, 1062, 1017, 905, 902, 882, 869, 807NMR (CF3COOH)d: 3.97 (3H, S, OCH3); 4

33、.03 (3H, S, OCH3); 4.09 (3H, S, OCH3)；4.23 (3H, S, OCH3); 3.26 (2H, t, C5-H); 4.39 (2H, t, C6-H); 6.96 (1H, S, Ar-H)；7.54 (1H, S, Ar-H); 7.94 (2H, S, Ar-H); 8.44 (1H, S, C13-H); 9.51 (1H, S, C3-H)（2）消旋四氫巴馬?。簃p 149UV MeOH max (lg): 232 (3.835) IR V KBr maxcm-1 2935，2915，2320，2780，2715，1605，1505，1487，

34、1448，1420，1335，1352，1300，1266，1248，1220，1204，1135，1100，1075，1020，950，352，890，700NMR(CDCl3)d: 3.32 (12H, S, 4×OCH3)；3.54, 4.22 (2H, Abq, J=16Hz C3-H)；6.58 (1H, S, Ar-H),6.70 (1H, S, Ar-H)；6.75, 6.94 (2H, Abq, J=8Hz, Ar-H)（3）巴馬汀：MS m/e 353（M+1），337，332，307三、實(shí)驗(yàn)儀器與試劑儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，真空泵，抽濾瓶，布氏漏斗，水浴鍋，噴霧瓶試劑：

35、黃藤，1%Hac，NaOH，NaCl，80%乙醇，鹽酸，硫酸，丙酮，碘化鉍鉀，硅鎢酸，苦味酸，鞣酸，硅膠，CMC- Na，氯仿，甲醇，氨水四、實(shí)驗(yàn)步驟（一）巴馬汀提取及延胡索素制備的方法巴馬汀為季銨生物堿，溶于水和極性大的有機(jī)溶劑（如甲醇、乙醇等），所以可用甲醇、乙醇或水進(jìn)行提取。然后通過(guò)鹽析，降低其在水中的溶解度而沉淀，與其它雜質(zhì)分離。巴馬汀是有機(jī)堿，盡管它帶正電荷，但和水的親和力仍小于NaCl，NaCl和水的強(qiáng)親和力，降低了巴馬汀在水中的溶解度，使它被“擠”出。巴馬汀鹽酸鹽在冷水中溶解度?。ū塞}酸小檗堿略大）可以利用此性質(zhì)進(jìn)行分離。方法一：1. 流程 （浸出） （中和 鹽析） （精制）黃藤

36、粗粉 浸出液 巴馬汀 1%Hac NaOH NaCl 80%乙醇熱溶后加鹽酸2. 工藝（1）浸出：取黃藤粗粉100 g，用1%醋酸冷浸（以浸沒(méi)原料為度，約500 ml）12天，尼龍布過(guò)濾，藥渣再加500 ml醋酸冷浸一天，合并濾液（留取1 ml作生物堿定性反應(yīng)）。（2）鹽析、中和：濾液用40% NaOH液調(diào)節(jié)至pH9，同時(shí)加入7%精制食鹽，即有黃色不溶物析出，80保溫，使沉淀凝聚，靜置，傾出上層清液，用菊形濾紙過(guò)濾，得巴馬汀游離堿粗品，烘干。（3）精制：將粗巴馬汀，加80%乙醇100 ml，加熱回流使溶，約十分鐘，趁熱抽濾，殘?jiān)偌由倭恳掖纪ㄌ幚硪淮?，抽濾，最后用滴管取乙醇淋洗布氏漏斗上不溶

37、物，合并濾液并向?yàn)V液中滴加6N鹽酸至pH2放置，即有金黃色針狀結(jié)晶析出，抽濾，再用乙醇重結(jié)晶一次。方法：將氯化巴馬汀粗晶置三角燒瓶?jī)?nèi)，用滴管加入95%乙醇使結(jié)晶恰溶解（在水浴上加熱），抽濾得澄清液，加塞放置析晶。若濾液在抽濾時(shí)已析出結(jié)晶，可將它在水浴上加熱至結(jié)晶全溶再加瓶塞放置，這樣析出的晶形好。若濾液體積太大，可濃縮至瓶壁邊沿略顯固體時(shí)加塞析晶。母液適當(dāng)濃縮，又可析出一部分氯化巴馬汀。（4）還原：取氯化巴馬汀精制品1g，置50100 ml圓底燒瓶中加蒸餾水10 ml，濃硫酸0.5 ml，鋅粉0.7g（工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)分批加入鋅粉），直火加熱保持沸騰，反應(yīng)45小時(shí)（反應(yīng)過(guò)程中溶液顏色逐漸變淡直至無(wú)色

38、）。反應(yīng)完畢，趁熱傾出上層清液，再用蒸餾水少許（12 ml）稍加熱洗滌反應(yīng)瓶及鋅渣12次，合并溶液放冷即有延胡索乙素酸性硫酸鹽析出。抽濾，取結(jié)晶置25ml錐形瓶中，用70%乙醇10 ml加熱溶解。趁熱抽濾，再用少量乙醇（12 ml）洗滌容器，向熱濾液（約60）中滴加氨水至pH9，立即析出鱗片狀結(jié)晶。抽濾，用蒸餾水洗（此處所得結(jié)晶加水能否溶解？加氯仿能否溶解？），干燥得延胡素乙素游離堿，烘干。（5）成鹽：稱取延胡索乙素游離堿0.5克，置于25毫升錐形瓶（或小燒瓶）中加90%乙醇4毫升，在水浴上加熱使溶解，用粗毛細(xì)管滴加5%硫酸乙醇液至剛果紅試紙呈淡藍(lán)色（pH約5），放冷析晶。將微黃柱狀結(jié)晶，抽濾，50以下干燥，即延胡索乙素中性硫酸鹽?？捎盟亟Y(jié)晶一次，干燥后測(cè)熔點(diǎn)。溶點(diǎn)，得率。以醋酸水小樣提取，一般得率12 %，用乙醇回流提取得率34 %。取黃藤粗粉100 g，用95%乙醇回流浸取三、四次合并乙醇至約120 ml，即可按（3）精制項(xiàng)下操作，加鹽酸得氯化巴馬汀。3. 提取工藝說(shuō)明（1）黃藤中含有多糖類物質(zhì)，多糖類物質(zhì)溶于水，往往影響水浸液鹽析及中和后的過(guò)濾，故宜在靜置后先傾斜棄去大部分澄清液再用布袋過(guò)濾收集沉淀，原料藥材亦不宜粉碎太細(xì)。（2）氯化巴馬汀為金色針狀結(jié)晶，并有強(qiáng)烈的黃色熒光。四氫巴馬汀為無(wú)色片狀結(jié)晶，不具熒光。因此，反應(yīng)液的顏色可作為還原終點(diǎn)的判斷。還原開(kāi)