激活Gs蛋白對膽紅素誘導的大鼠小腦顆粒神經元凋亡影響的研究

1、激活Gs蛋白對膽紅素誘導的大鼠小腦顆粒神經元凋亡影響的研究摘要：目的研究激活Gs蛋白對膽紅素誘導的小腦顆粒神經元凋亡的影響及作用機制。方法采用原代培養(yǎng)的新生大鼠小腦顆粒神經元，用霍亂毒素（CT）激活Gs蛋白，用二乙酸熒光素(FDA)染色及四甲基偶氮唑藍(MTT)法測定膽紅素誘導的小腦神經元存活率，125I放射免疫法測定細胞內環(huán)磷酸腺苷（cAMP），F(xiàn)ura-2/AM熒光比值成像技術測定細胞內鈣濃度（Ca2+i）。結果CT誘導細胞內cAMP升高并呈劑量依賴性地保護膽紅素誘導的小腦顆粒神經元凋亡。當加入腺苷環(huán)化酶（AC）刺激劑(Forskolin)及cAMP類似物(8-溴-環(huán)磷酸腺苷)后，雖導致細

2、胞內cAMP升高，但不能阻斷或減弱膽紅素誘導的神經元凋亡。另發(fā)現(xiàn)膽紅素濃度依賴性觸發(fā)細胞內鈣升高，而CT可降低膽紅素導致的細胞內鈣的升高。結論Gs蛋白可能參與了小腦顆粒神經元凋亡的調控，激活Gs蛋白拮抗膽紅素誘導的神經元凋亡的機制是通過降低細胞內鈣而不依賴于cAMP的途徑。關鍵詞：膽紅素；G蛋白質類；神經元；脫噬作用Activation of Gs-protein affects apoptosis of rat cerebellar granule neurons induced by bilirubinLI Xiaoyu(Department of Pediatrics, First Ho

3、spital, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)LIN Suizhen(Department of Pediatrics, First Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzhou 510080, China)XU Xiaolin(Department of Pediatrics, First Hospital, Sun Yatsen University of Medical Sciences, Guangzho

4、u 510080, China)Abstract：ObjectiveTo investigate the effect and the mechanism of activation of Gs-protein on bilirubin-induced apoptosis of rat cerebellar granule neurons. MethodsPrimary cultured rat cerebellar granule neurons were exposed to Cholera toxin (CT). The effect of activation of Gs-protei

5、n by CT on bilirubin-induced apoptosis was observed. The survival rate of neurons was detected by fluorescein diacetate (FDA) staining and MTT assay. The intracellular Ca2+i was measured by the ratio of fura-2/AM with the microspectrofluorometry ratio imaging system. Cytosolic cyclic AMP（cAMP） conte

6、nt was quantitated by using 125I radioimmunoassay. ResultsCT could induce the elevation of cAMP content and protect cerebellar granule neurons from the bilirubin-induced apoptosis in a dose-dependent pattern. However, the exposure of cultured cerebellar granule neurons to Forskolin (which stimulates

7、 adenylate cyclase directly and enhances Gs-cyclase coupling) and 8-bromo-cAMP (a membrane-permeable analogue of cAMP) did not block or attenuate apoptosis of cerebellar granule neurons induced by bilirubin. On the other hand, bilirubin elevated Ca2+i in a concentration-dependent pattern. CT attenua

8、ted the rise of Ca2+i induced by bilirubin. ConclusionGs-protein might play a role in the regulation of apoptosis of cerebellar granule neurons. The mechanism of protection against bilirubin-induced apoptosis of cerebellar granule neurons by activation of Gs-protein was associated with decreasing Ca

9、2+i in a cAMP-independent way.Key words：Bilirubin; G-proteins; Neurons; Apoptosis膽紅素腦病是新生兒高膽紅素血癥中最嚴重的并發(fā)癥，?？蛇z留腦癱、智力低下等嚴重后遺癥1。有關膽紅素神經毒性的分子學發(fā)病機制尚不十分清楚。本室已報道膽紅素可選擇性地誘導新生大鼠小腦顆粒神經元凋亡2，初步揭示了膽紅素神經毒性的分子學發(fā)病機制。眾多研究已發(fā)現(xiàn)細胞凋亡與信號傳導系統(tǒng)Ca2+、cAMP、蛋白激酶C等存在著密切關系，同時激活G蛋白可雙相調節(jié)大鼠小腦顆粒神經元的凋亡3，4。因此,本研究通過檢測細胞存活率、細胞內cAMP的濃度、細胞內C

10、a2+濃度（Ca2+i）的變化，探討激活Gs蛋白對膽紅素誘導的大鼠小腦顆粒神經元凋亡的影響及機制。材料和方法一、材料1主要試劑：霍亂毒素（cholera toxin，CT）、8-溴-環(huán)磷酸腺苷（8-bromo-cAMP）（美國RBI公司），F(xiàn)ura-2/AM、EGTA（美國Molecular Probes公司），神經細胞基礎培養(yǎng)液（basal medium eagles BME）（美國GIBGO公司），二甲亞砜（DMSO）、膽紅素（bilirubin，BR）、四甲基偶氮唑藍（MTT）、福司柯林（forskolin，F(xiàn)K)等藥物（美國Sigma公司）。2動物來源：生后8 d的SD大鼠，體重121

11、6 g，雌雄不限，由中山醫(yī)科大學實驗動物中心提供。二、方法1大鼠小腦顆粒神經元的培養(yǎng)及凋亡模型的建立：按照我室已建立的方法2,5。取生后8 d的SD大鼠的小腦，經過0.5 g/L胰酶消化后制成細胞懸液，加入0.5 g/L胰酶抑制劑和50 mg/L的DNA酶以終止消化，離心5 min(1 500 r/min)，棄上清液，將細胞加入含有10%胎牛血清和25 mmol/L氯化鉀的BME中，以1.5109/L的密度接種于已經用多聚賴氨酸包備的24孔板的培養(yǎng)皿中。接種后24 h加入10 mol/L的Ara-C以抑制膠質細胞的生長，使神經元的純化率達到95%以上。細胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)8 d，加入膽紅素3 m

12、g/L后，經Hoechst 33258染色觀察細胞核形態(tài)學變化,用瓊脂糖凝膠電泳法證實膽紅素可誘導小腦顆粒神經元的凋亡2。2神經元存活率的測定：(1) 熒光染色法5取培養(yǎng)第8天的神經元加入膽紅素3 mg/L后，在不同時間點測定細胞存活率，給藥24 h細胞存活率為51%2，故本實驗均以給藥24 h后測定神經元存活率。每一藥物處理組或濃度組及對照組各設36個復孔，實驗重復3次。方法：去掉培養(yǎng)液, 采用熒光雙染色法觀察神經元生存狀態(tài)及形態(tài)學變化，并在熒光顯微鏡下隨機拍照。(2)MTT法6：在培養(yǎng)液中加入MTT（250 g/ml），置5%CO2、37的培養(yǎng)箱中46 h，去掉培養(yǎng)液，加入DMSO震蕩混勻

13、后，在酶標儀（Elx 800，美國）上測定570 nm和630 nm雙波的吸光度。酶標儀測得的吸光度（A值）與細胞存活率呈正相關（r2=0.992）。計算：細胞存活率（%）=處理組A值/對照組A值100%或直接以測得的A值代表細胞存活率。3. Ca2+i的測定7：采用Fura-2/AM熒光比值成像技術測定Ca2+i。用培養(yǎng)第8天的細胞，加入3 mg/L 的膽紅素3 h后，去除培養(yǎng)基，用含5 g/L小牛白蛋白的緩沖液分別清洗細胞，以清除細胞外的膽紅素；經5 mol/L Fura-2/Am負載45 min后的神經元,洗滌3次,放在倒置熒光顯微鏡下,使用熒光比值成像系統(tǒng)(Imaging 1/FL，美

14、國), 激發(fā)波長為340 nm和380 nm，發(fā)射波長為510 nm，在計算機自動控制下測定340/380熒光比值, 根據(jù)公式計算出Ca2+i。4細胞內cAMP濃度的測定：采用125I標記放射免疫方法測定。按文獻8的方法并稍加修改，細胞在24孔板培養(yǎng)8 d，藥物處理組及對照組各設8個復孔，加藥2 h后棄盡培養(yǎng)基，用冷PBS洗2次，各孔立即加含1%三氯醋酸的70%乙醇溶液（破壞細胞膜和酶的活性，400 l/孔），置-30過夜。再將液體轉移到青霉素小瓶中，6080水浴蒸干，每瓶加50 mmol/L醋酸緩沖液400 l，置-30待測。具體操作按上海中醫(yī)學院提供的125I-cAMP試劑盒說明書進行，根

15、據(jù)標準曲線回歸方程計算出cAMP量，結果以pmol/孔表示。三、統(tǒng)計學處理測量數(shù)據(jù)用均值標準差(s)表示，顯著性檢驗采用方差分析及SNK-q檢驗（用spss 7.0統(tǒng)計軟件包）。所測得cAMP濃度為正態(tài)分布。結果一、激活Gs蛋白對膽紅素神經毒性的影響用培養(yǎng)8 d的大鼠小腦顆粒神經元加入不同濃度的CT（04 mg/L）預處理4 h后，再加入3 mg/L膽紅素，24 h后測神經元存活率，結果CT在0、2、4 mg/L時神經元的存活率分別為(40.02.5)%、(78.02.6)%、(95.02.7)%(實驗重復3次，結果類似)，說明CT呈劑量依賴性地保護膽紅素誘導的神經元死亡（14）。1-4神經元

16、的生存狀況及形態(tài)學變化(熒光雙染色法,綠色為活細胞,紅色為死亡細胞光鏡200)1對照組神經元2BR(3mg/L)處理組3CT(2mg/L)+BR(3mg/L)處理組4CT(4mg/L)+BR(3mg/L)處理組二、激活Gs蛋白后細胞內cAMP濃度的變化培養(yǎng)8 d的大鼠小腦神經元經2 mg/L CT預處理4 h，再加入膽紅素（3 mg/L），作用2.5 h后，收集細胞,測定cAMP濃度。發(fā)現(xiàn)加入CT及腺苷環(huán)化酶（AC）激活劑(FK)組cAMP濃度均較對照組及單獨膽紅素組明顯升高，差異有顯著意義；而單獨膽紅素組cAMP濃度較對照組無明顯改變，F(xiàn)K組cAMP升高較CT組更顯著（5，F(xiàn)值=36.8）。

17、注：BR：膽紅素；CT：霍亂毒素；FK：福司柯林；* P0.05，* P0.001，均為與對照及BR組比較5膽紅素誘導小腦神經元凋亡時細胞內cAMP濃度的變化及CT、FK對其的影響(n=8)同一批細胞在BR作用24 h后同時以MTT法檢測細胞存活率，發(fā)現(xiàn)加入CT處理組細胞存活率高于單獨BR組，而加入FK及膜滲透性的cAMP類似物8-brome-cAMP預處理細胞后細胞存活率與單獨BR組比較無明顯差異，對BR的神經毒性無保護作用（6），說明CT激活Gs蛋白保護BR的神經毒性是不依賴cAMP途徑的。注：BR：膽紅素；CT：霍亂毒素；FK：福司柯林；8-bro-cAMP：8-溴-環(huán)磷酸腺苷；與BR組

18、比較，* P0.016各藥物對小腦顆粒神經元存活率的影響(n=6)三、膽紅素誘導神經元死亡時Ca2+i的變化及CT的影響用培養(yǎng)8 d的大鼠小腦顆粒神經元加入膽紅素10 mg/L后在不同時間里測定細胞內膽紅素所發(fā)出的熒光強度(其熒光強度與膽紅素的量呈正相關)2，發(fā)現(xiàn)加入膽紅素作用2.53 h時細胞內熒光強度最強。故加入濃度為2.5、5、10和20 mg/L的膽紅素2.5 h后，測定，Ca2+i分別為(28416)、(36132)、(80869)和(82053）nmol/L(各濃度組細胞數(shù)為60),說明膽紅素劑量依賴性地觸發(fā)Ca2+i的升高。用CT預處理細胞后，再加入3 mg/L膽紅素作用2.5

19、h后測定Ca2+i，發(fā)現(xiàn)單獨膽紅素組Ca2+i較對照組、CT組及CT+BR組顯著升高（表1），兩兩比較差異均有顯著意義，說明Ca2+參與了膽紅素誘導的細胞凋亡,而CT保護BR對神經元的毒性可能是通過降低細胞內鈣而實現(xiàn)的。表1CT對膽紅素引起的小腦顆粒神經元Ca2+i升高的影響(s, nmol/L)組別細胞數(shù)(個)Ca2+i對照組60175.32.1CT組60162.53.0*CT+BR組60151.71.9*BR組60271.714.2*注：與BR組相比, *P0.01；與對照組相比, *P0.001討論 膽紅素神經毒性的分子學機制目前尚不十分清楚。膽紅素引起新生兒腦損傷的典型特點是腦的局部區(qū)

20、域或某些神經元對損傷的選擇性易感，如：小腦、基底節(jié)、浦肯野細胞、海馬細胞等9。本研究室已報道膽紅素在體外可選擇性地誘導原代培養(yǎng)的新生大鼠小腦顆粒神經元的凋亡，這一現(xiàn)象與以往臨床和病理觀察結果相符。像細胞生長、分化一樣,大量研究證明細胞凋亡涉及不同信號傳遞系統(tǒng)的調節(jié)。Yan等4報道激活G蛋白雙向調控小腦顆粒神經元的凋亡,當CT激活Gs時,可拮抗由非去極化濃度的氯化鉀(5 mmol/L)所誘導的小腦顆粒神經元的凋亡。而用蜂毒多肽Mastoparan激活Gi/Go蛋白時則可誘導小腦顆粒神經元的凋亡。同時發(fā)現(xiàn)，非去極化狀態(tài)的氯化鉀使Ca2+i降低，而Mastoparan使Ca2+i明顯升高，提示Gs蛋

21、白-cAMP、Ca2+信號系統(tǒng)在調控神經元生存起著重要的作用。本研究結果發(fā)現(xiàn)Gs蛋白激活劑CT可呈劑量依賴性地保護膽紅素誘導的小腦顆粒神經元凋亡，說明Gs蛋白可能參與了膽紅素誘導的神經細胞凋亡的調控。G蛋白又稱鳥甘酸結合蛋白，存在于細胞膜上，是生物體內重要的細胞內外信號傳導系統(tǒng)。細胞質膜上存在著cAMP和肌醇脂質信使系統(tǒng)均與G蛋白緊密相關。目前將G蛋白主要分為5類：Gs、Gi、Gp、Gt、和Go。Gs的主要功能是激活腺苷環(huán)化酶(AC)；Gs蛋白對CT敏感，造成Gs蛋白持續(xù)激活；而Gi蛋白的主要功能是抑制AC，其對百日咳桿菌毒素敏感10。另外Gs蛋白還可能有直接調節(jié)神經細胞鈣通道，尤其是電壓依賴

22、性通道的作用11，那么在膽紅素誘導神經元凋亡的過程中，Gs蛋白是通過cAMP的途徑還是Ca2+途徑參與對凋亡的調節(jié)呢？實驗結果表明，加入CT激活Gs蛋白后，細胞內cAMP明顯升高，對膽紅素導致的神經毒性有保護作用，但加入腺苷環(huán)化酶激活劑FK，以及cAMP類似物8-brome-cAMP后，對BR的神經毒性并無保護作用，說明CT激活Gs蛋白后，并不是通過cAMP途徑而起到生物效應的。因此，進一步測定Ca2+i， 發(fā)現(xiàn)膽紅素可引起Ca2+i升高。Ca2+i的升高介導的細胞凋亡的機制被認為是與鈣調蛋白活化蛋白酶，引起細胞周期停止在G2期，進而導致細胞凋亡，還可通過活化蛋白酶、磷酸脂酶、磷酸化酶等傳遞死

23、亡信號，最后其直接作用的就是活化核酸內切酶，導致DNA被酶切而片段化12。加入CT后降低膽紅素引起Ca2+i升高，而起到對膽紅素引起的神經毒性的保護作用。近年來觀察到神經遞質可通過G蛋白介導對神經細胞電壓依賴性離子通道直接發(fā)揮調制作用，而不經過目前已知的多種第二信使的介導，已有報道在培養(yǎng)的小腦顆粒細胞谷氨酸通過百日咳桿菌毒素敏感G蛋白（Gi/Go）抑制L型鈣通道11。因此，推測Gs蛋白的激活通過對鈣通道的調節(jié)或其他途徑降低了膽紅素誘導的Ca2+i的升高而保護膽紅素誘導的神經毒性。(本文編輯：魏均民)基金項目：國家自然科學基金資助項目（39770782)；廣東省自然科學基金資助項目（970052

24、)作者單位：李曉瑜(廣州, 中山醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院兒科510080)林穗珍(廣州, 中山醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院兒科510080)許小林(藥理教研室)皮榮標(藥理教研室)顏光美(藥理教研室)參考文獻：1俞惠民, 洪文瀾, 施麗萍. 新生兒高間接膽紅素血癥患兒遠期隨訪觀察. 中華兒科雜志, 1996, 34:324-326. 2林穗珍, 李曉瑜, 顏光美. 膽紅素誘導大鼠小腦顆粒神經元凋亡的研究. 中華醫(yī)學雜志, 1999, 79:125-128. 3劉睿, 編譯. 調節(jié)細胞凋亡的信號傳導機制. 國外醫(yī)學免疫學分冊, 1995, 5:270-272. 4Yan GM, Lin SZ, Irwin RP, et al. Activation of G protein bidirectionallt affects apoptosis of cultured