腫瘤靶向性藥物載體葉酸_淀粉納米顆粒的研制與應(yīng)用

1、論 文第51卷 第10期 2006年5月腫瘤靶向性藥物載體葉酸-淀粉納米顆粒的研制與應(yīng)用肖蘇堯 童春義 劉選明* 俞丹密 劉巧玲 薛昌剛 唐冬英 趙李劍(湖南大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)研究院, 化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 長(zhǎng)沙 410082. *聯(lián)系人, E-mail: sw_xml)摘要 用反相微乳液法和交聯(lián)法制備了帶負(fù)電的交聯(lián)淀粉納米顆粒(StNP), 經(jīng)過(guò)葉酸活性物質(zhì)(FA-PEG-NH2)修飾, 成功制備了葉酸-淀粉納米顆粒(FA-PEG/StNP). 原子力顯微鏡和Zeta-Sizer粒度儀檢測(cè)表明所得顆粒的平均直徑約為130 nm. FA-PEG/StNP與抗癌藥物多柔比星(DO

2、X)經(jīng)滲透結(jié)合, 獲得了載藥葉酸-淀粉納米顆粒, 用紫外分光光度法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)納米顆粒結(jié)合DOX的飽和量為28 µg/mg, 并對(duì)藥物DOX具有明顯的緩釋效果. 經(jīng)過(guò)與肝癌細(xì)胞BEL7404共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn): 載藥FA-PEG/StNP和載藥StNP的半致死濃度LC50比DOX的半致死濃度明顯提高, 表明FA-PEG/StNP和StNP都能顯著降低DOX的細(xì)胞毒性. 而含相同量藥物DOX的載藥FA-PEG/StNP和載藥StNP與肝癌細(xì)胞BEL7404共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn): 前者的細(xì)胞致死率是后者的3倍, 結(jié)果證實(shí)了修飾在顆粒上的FA能顯著提高顆粒對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向作用, 使更多藥物作用于腫瘤細(xì)胞,

3、提高了作用效果. 所制備的葉酸-淀粉納米顆粒具有藥物緩釋、靶向識(shí)別、降低毒副作用的特點(diǎn), 可以作為腫瘤靶向性藥物載體.關(guān)鍵詞 葉酸受體 腫瘤細(xì)胞 靶向藥物載體 淀粉納米顆粒藥物的低毒和高效對(duì)疾病的臨床治療十分重要. 為此, 近年來(lái), 藥物靶向傳遞的研究越來(lái)越受到研究者的重視. 自從發(fā)現(xiàn)葉酸受體在絕大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞膜內(nèi)有大量表達(dá)而正常細(xì)胞很少有表達(dá)以來(lái), 葉酸/葉酸受體介導(dǎo)靶向傳遞的研究成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)問(wèn)題1. 葉酸是小分子量維生素, 相對(duì)于單分子抗體等蛋白質(zhì), 具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、價(jià)格低廉、無(wú)免疫原性等特點(diǎn), 而且葉酸與葉酸受體結(jié)合力強(qiáng), 能被高效介導(dǎo)進(jìn)入腫瘤細(xì)胞, 是一種很有應(yīng)用價(jià)值的靶向物質(zhì).

4、 結(jié)合到藥物緩釋的要求, 人們又將葉酸通過(guò)化學(xué)鍵合連接到藥物載體上, 如脂質(zhì)體2,3、多聚物4,5、蛋白質(zhì)6, 以及它們制成的納米顆粒79, 這樣就能有效地同時(shí)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向識(shí)別和藥物緩釋, 避免藥物對(duì)正常細(xì)胞的傷害, 提高腫瘤的治療效果.淀粉作為一種天然生物材料, 與其他很多藥物材料相比, 具有很好的生物相容性、無(wú)免疫原性, 在空氣中很穩(wěn)定, 與大多數(shù)藥物之間不發(fā)生作用, 在體內(nèi)的降解速度較快, 其水解產(chǎn)物為還原糖, 易在體內(nèi)消化, 而且廉價(jià)易得, 長(zhǎng)期以來(lái)就是醫(yī)藥領(lǐng)域中最常用的藥物填充劑. 近年來(lái)發(fā)現(xiàn)淀粉經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)變性還可以獲得更多的特性, 可以作為藥物載體材料廣泛應(yīng)用

5、于醫(yī)藥領(lǐng)域10,11. 作者已成功研制出陰離子交聯(lián)淀粉納米顆粒12. 本文在原有工作基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行淀粉納米顆粒的葉酸生物學(xué)修飾, 研制具有腫瘤靶向的葉酸-淀粉納米顆粒, 并對(duì)制備的葉酸-淀粉納米顆粒在藥物緩釋、靶向性識(shí)別、降低藥物毒副作用等方面進(jìn)行探討.1 材料與方法1.1 材料試劑: 葉酸(folate, FA)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)、異硫氰酸熒光素(FITC)、聚乙二醇二氨(PEG-(NH2)2, MW3350)和鹽酸多柔比星(DoxorubicinHCl, DOX)均購(gòu)自Sigma公 司, 可溶性淀粉等其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純.細(xì)胞材料: 肝癌細(xì)胞BE

6、L7404, 本實(shí)驗(yàn)室提供. 儀器: SPI-400型原子力顯微鏡(日本精工), Zeta- Sizer粒度儀(英國(guó)Malvern公司), UV-1600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京瑞利公司), Axiovert 200 Zeiss熒光顯微鏡(德國(guó)Carl Zeiss 公司), Hitachi F-2500型熒光分光光度計(jì), MK3酶標(biāo)儀(美國(guó), Thermo Electron), 19HW-1型恒溫磁力攪拌器(中國(guó)江蘇), SCIENTZ-D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(中國(guó)寧波新芝). 1.2 方法() 淀粉納米顆粒的制備. 參照文獻(xiàn)12, 略做修改, 制備方法如下: 稱取1 g可溶性淀粉配成8%的水溶

7、液, 沸水浴中加熱水解, 直到溶液澄清, 室溫放置冷卻. 量取甲苯和氯仿以31的體積比混合, 加入占總體積2%的表面活性劑SPan80, 以 6001151第51卷 第10期 2006年5月論 文r/min的速度攪拌混勻, 形成油相. 取淀粉水解液加入油相中(V油/V水=15/1), 繼續(xù)攪拌一定時(shí)間至形成微小的乳液. 加入占淀粉質(zhì)量0.05%的交聯(lián)劑POCl3, 繼續(xù)攪拌反應(yīng)50 min, 用丙酮和乙醇洗滌乳液3次, 冷凍干燥, 即可得到帶負(fù)電的交聯(lián)淀粉納米顆粒.() FA-PEG-NH2的制備. FA-PEG-NH2的合成原理如圖1所示, 葉酸的羧基被DCC和NHS活化后與PEG-(NH2

8、)2的一個(gè)氨基結(jié)合, 得到FA-PEG-NH2. 具體方法如下: 葉酸13.2 mg葉酸溶于1 mL DMSO, 攪拌下加入一定量的DCC和NHS, 加入100 mg PEG- (NH2)2, 室溫反應(yīng)4 h. 加入5 mL水, 過(guò)濾除去不溶物, 上清液冷凍干燥, 乙醚洗滌干燥物, 得到淺黃色固體FA-PEG-NH2. 紅外分光光度法檢測(cè)所得固體產(chǎn)物.() FA-PEG/StNP的制備. 稱取1 mg淀粉納米顆粒溶于1 mL去離子水中, 超聲分散, 加入0.1 mg FA-PEG-NH2, 通過(guò)氨基與淀粉顆粒結(jié)合, 常溫共育 3 h, 離心洗滌, 沉淀重懸于PBS (pH 7.4), 得到FA

9、- PEG/StNP. 1 mg FA-PEG/StNP懸浮于雙蒸水中, 用-淀粉酶消化除去淀粉, 反應(yīng)條件為37下振搖2 h, 再用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)消化液中葉酸的含量, 檢測(cè)波長(zhǎng)為363 nm, 其他物質(zhì)在該波長(zhǎng)處無(wú)吸收. 以FA-PEG-NH2的水溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線.() FA-PEG/StNP的原子力顯微鏡檢測(cè). FA- PEG/StNP配制成1 mg/mL的水溶液, 用原子力顯微液做標(biāo)準(zhǔn)曲線.() 藥物釋放檢測(cè). 10 mg 載藥FA-PEG/StNP復(fù)合物溶于PBS (pH 7.4)中, 裝于透析袋中, 50 mL PBS (pH 7.4)為透析液, 于37下透析釋放, 100 r

10、/min振蕩, 每隔一定時(shí)間取出5 mL透析液, 再加入5 mL PBS以維持透析液的體積. 用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)透析液中DOX的量, 檢測(cè)波長(zhǎng)為480 nm, 以純DOX的PBS溶液做標(biāo)準(zhǔn)曲線.() FA-PEG/StNP與細(xì)胞共培養(yǎng). 選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞, 用0.25%胰蛋白酶消 化, 以30000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于放置了干凈滅菌蓋玻片的細(xì)胞培養(yǎng)皿(Costar, Ø35 mm)內(nèi), 加入1.5 mL完全培養(yǎng)基, 在5% CO2 培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)24 h. 在培養(yǎng)皿中加入0.2 mg修飾了熒光物質(zhì)FITC的FA-PEG/StNP, 共培養(yǎng)4 h, 用D-h

11、anks洗滌細(xì)胞2次, 取出皿中的蓋玻片, 用95%的乙醇溶液固定蓋玻片上的細(xì)胞. 用熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞對(duì)熒光納米顆粒的吞噬情況. 在另一些培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)皿中先加入10 µg純化的葉酸, 共培養(yǎng)4 h, 去除培養(yǎng)液, 用D-hanks洗滌細(xì)胞2次, 再加入修飾了熒光物質(zhì)FITC的FA-PEG/StNP共培養(yǎng), 處理方式同上. 以培養(yǎng)皿中加入修飾了FITC的StNP作為對(duì)照.() 載藥顆粒對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用. 選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的肝癌細(xì)胞, 用0.25%胰蛋白酶消化, 以2000鏡和Zeta-Sizer電位儀檢測(cè)顆粒的形態(tài)、大小和分布.個(gè)細(xì)胞/孔的濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Costar)

12、內(nèi),() FA-PEG/StNP裝載抗癌藥物多柔比星(DOX).在5% CO2 培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)24 h. DOX、載DOX稱取10 mg FA-PEG/StNP溶于5 mL去離子水中, 在的StNP和載DOX的FA-PEG/StNP都溶于PBS (pH溶液中再加入一定量除去鹽酸的DOX, 使得溶液中7.4)中, 以一定的細(xì)胞濃度梯度加入到接有細(xì)胞的96DOX的濃度分別為0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5, 2.0 孔培養(yǎng)板中, 在5% CO 37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 用mg/mL, 室溫下振蕩共孵育一定時(shí)間, 離心洗滌, 沉MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率, 得出3種藥劑對(duì)肝

13、癌細(xì)淀真空干燥, 得到粉末狀載藥納米顆粒. 稱取1 mg胞作用24 h的半致死量濃度. 載藥納米顆粒懸浮于雙蒸水中, 用淀粉酶消化掉淀取載有相同量藥物DOX的載藥StNP和載藥粉, 反應(yīng)條件為37下振搖2 h, 用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)消化液中DOX的量, 檢測(cè)波長(zhǎng)為480 nm, 淀粉和淀粉酶在該波長(zhǎng)處無(wú)吸收. 以純DOX 的水溶FA-PEG/StNP, 加入到接有細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中, 在5% CO2 37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 用MTT法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的致死率.圖1 FA-PEG-NH2的合成原理圖論 文第51卷 第10期 2006年5月2 結(jié)果與討論2.1 FA-PEG-NH2的紅外光

14、譜檢測(cè)從圖1可知, 若葉酸與PEG-(NH2)2連接成功, 就會(huì)在PEG-(NH2)2上引入苯環(huán). 由圖2可見(jiàn), 相比PEG- (NH2)2的紅外光譜圖, FA-PEG-NH2的紅外圖上出現(xiàn)苯環(huán)的特征峰(1606 cm1), 說(shuō)明成功制備了FA-PEG- NH2.酸, 檢測(cè)波長(zhǎng)為363 nm, 得到葉酸的修飾量為0.8 µg/mg. 由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知, 本研究方法能成功地在淀粉納米顆粒表面修飾上葉酸.2.4 FA-PEG/StNP裝載抗癌藥物DOXFA-PEG/StNP的水溶液濃度為2 mg/mL, DOX在反應(yīng)液中的濃度分別為0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 1.0, 1.5,

15、 2.0 mg/mL, 納米顆粒與DOX共孵育6 h, 離心洗滌, 真空干燥. 載藥顆粒溶于雙蒸水中, 用-淀粉酶消化掉淀粉, 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)消化液中DOX的量, 結(jié)果如圖4所示. 從圖4發(fā)現(xiàn)當(dāng)DOX的濃度高于1.0 mg/mL時(shí), 納米顆粒裝載DOX的量達(dá)到飽和, 裝載量約為28 µg/mg.2.5 載藥FA-PEG/StNP中DOX的釋放載藥FA-PEG/StNP溶于PBS(pH 7.4)中, 并以PBS(pH 7.4)為透析液, 37下100 r/min振蕩, 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè), 所得結(jié)果見(jiàn)圖5. 由圖5可見(jiàn), 復(fù)合物在前1 h的藥物釋放量為29%, 原因是在透析

16、早期由于吸附在顆粒表面的DOX較易釋放, 所以在曲線上表現(xiàn)出一個(gè)突釋過(guò)程. 透析10 h后, DOX釋放量達(dá)到50%. 48 h后DOX釋放75%, 此時(shí)復(fù)合物中還載有25%的藥物. 以DOX溶液為對(duì)照, DOX在透析h很快就釋放完了. 結(jié)果表明FA-PEG/StNP對(duì)DOX具有很好的緩釋作用.2.6 FA-PEG/StNP對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向作用修飾了熒光物質(zhì)FITC 的FA-PEG/StNP與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)4 h后, 用熒光顯微鏡觀察并攝像, 結(jié)果圖2 FA-PEG-NH2的紅外光譜檢測(cè)圖1, PEG-(NH2)2; 2, FA-PEG-NH22.2 StNP和FA-PEG/StNP的表征用原

17、子力顯微鏡和Zeta-Sizer分析儀檢測(cè)StNP和FA-PEG/StNP. StNP的顆粒分散性好, 形狀規(guī)則, 顆粒的平均直徑約為50 nm, Zeta電位為12 mV(未給出圖). FA-PEG/StNP的顆粒直徑主要分布于70 200 nm之間, 平均顆粒直徑約為130 nm(圖3所示). 2.3 FA-PEG/StNP中葉酸的量紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)FA-PEG/StNP中的葉 見(jiàn)圖6. 從圖6可見(jiàn), 肝癌細(xì)胞攝取的熒光顆粒數(shù)量圖3 FA-PEG/StNP的顆粒分布圖(a) AFM檢測(cè)圖, (b) Zeta-Sizer檢測(cè)圖. 用于檢測(cè)的復(fù)合物濃度為1 mg/mL1153第51卷 第

18、10期 2006年5月論 文結(jié)果表明: 通過(guò)葉酸受體介導(dǎo)可以顯著提高肝癌細(xì)胞對(duì)FA-PEG/StNP的吞噬能力, 培養(yǎng)基中加入游離葉酸后, 由于游離葉酸優(yōu)先結(jié)合了腫瘤細(xì)胞表面的部分葉酸受體, 從而降低了腫瘤細(xì)胞對(duì)熒光顆粒的吞噬能力.用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)細(xì)胞破碎液的熒光強(qiáng)度實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了FA-PEG/StNP對(duì)肝癌細(xì)胞的靶向作用. 取上述相同量共培養(yǎng)的細(xì)胞用TritonX100-PBS緩沖溶液破碎, 檢測(cè)結(jié)果如圖7所示. 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與FA-PEG/StNP共培養(yǎng)的細(xì)胞液熒光強(qiáng)度約為對(duì)照液熒光強(qiáng)度的20倍. MTT實(shí)驗(yàn)表明1, 2, 3實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞量和細(xì)胞活性大體相當(dāng).載體納米顆粒對(duì)肝癌細(xì)胞藥物D

19、OX的半致死濃度影響. 以5000個(gè)/10 µL的濃度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi), 在5% CO2 培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)24 h. 加入不同量的DOX, StNP/DOX和載藥FA-PEG/StNP的PBS(pH 7.4)溶液, 在5% CO2 培養(yǎng)箱中37培養(yǎng)24 h, 用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率, 結(jié)果見(jiàn)表1. 從表可知, DOX, 載藥StNP和載藥FA-PEG/StNP的半致死濃度分別為5×105, 8.4×104和2.6×104 mol/L(以純DOX在培養(yǎng)基中的終濃度計(jì)), 其中載藥StNP的半致死濃度約為DOX的17倍, 表明結(jié)合淀粉納米顆粒圖4

20、 不同藥物濃度下淀粉納米顆粒裝載DOX的量誤差棒由標(biāo)準(zhǔn)誤差S得到, 其中n = 4. *, P < 0.01, 有顯著性差異;#, P > 0.05, 表明后三組之間無(wú)顯著性差異圖5 載藥顆粒中DOX的釋放曲線和DOX的釋放曲線實(shí)心點(diǎn)線為載藥FA-PEG/StNP復(fù)合物的釋放曲線, 空心點(diǎn)線為DOX溶液的釋放曲線. 誤差棒由標(biāo)準(zhǔn)誤差S得到, 其中n = 3載體降低了抗癌藥物DOX的細(xì)胞毒性, 載藥圖7 肝癌細(xì)胞攝取熒光顆粒的定量檢測(cè)CK, 對(duì)照; 1, FITC修飾的FA-PEG/StNP作用于肝癌細(xì)胞; 2, FITC修飾的FA-PEG/StNP作用于正常細(xì)胞; 3, FITC修

21、飾的FA-PEG/StNP+圖6 肝癌細(xì)胞對(duì)熒光顆粒的攝取游離葉酸作用于肝癌細(xì)胞誤差棒由標(biāo)準(zhǔn)誤差S得到, 其中n = 3.*, P < 0.01, 表明三個(gè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照之間具有顯著性差異(a) FITC修飾的FA-PEG/StNP作用于肝癌細(xì)胞; (c) FITC修飾的FA-PEG/StNP作用于正常細(xì)胞; (e) FITC修飾的FA-PEG/StNP+游離葉酸作用于肝癌細(xì)胞. (b), (d), (f)為(a), (c), (e)對(duì)應(yīng)的明視圖表1 DOX和不同載藥顆粒對(duì)肝癌細(xì)胞BEL7404的DOX半致死濃度的影響DOX或載藥顆粒 DOX 載藥StNP 載藥FA-PEG/StNP半致死

22、濃度LC50(以DOX終濃度計(jì))5×105 mol/L 8.4×104 mol/L 2.6×104 mol/L多(圖6(a)和(b), 而正常肝細(xì)胞對(duì)熒光顆粒的攝取較少(圖6(c)和(d), 在培養(yǎng)基中加了游離葉酸后, 肝癌細(xì)胞對(duì)熒光顆粒的攝取量又明顯降低(圖6(e)和(f).論 文第51卷 第10期 2006年5月FA-PEG/StNP的半致死濃度較載藥StNP的低, 可能是因?yàn)檩d藥FA-PEG/StNP復(fù)合物表面修飾的葉酸與腫瘤細(xì)胞表面葉酸受體結(jié)合, 介導(dǎo)顆粒進(jìn)入細(xì)胞, 從而更有效地抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng).此外, 我們進(jìn)行了不同載藥顆粒對(duì)肝癌細(xì)胞BEL7404的致死

23、率的影響實(shí)驗(yàn): 在接了肝癌細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入一定量的StNP, FA-PEG/StNP, 載藥StNP, 載藥FA-PEG/StNP和載藥FA-PEG/StNP+游離FA, 培養(yǎng)24 h后, 用MTT法檢測(cè)得到細(xì)胞的致死率, 結(jié)果見(jiàn)圖8. 由圖8可知, StNP與FA-PEG/StNP兩種顆粒的細(xì)胞致死率都很低, 載藥FA-PEG-StNP的致死率最高, 約為載藥StNP的1倍, 而載藥FA-PEG/StNP+FA的致死率則與載藥StNP的相當(dāng). 結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)說(shuō)明這兩種納米顆粒的細(xì)胞毒性低, 而載藥FA-PEG/StNP中的FA能夠作為靶向物質(zhì)有效地介導(dǎo)顆粒進(jìn)入肝癌細(xì)胞.2有研究表

24、明, 顆粒越大, 其載藥量越大, 藥物的釋放則相應(yīng)減慢. 我們還需要對(duì)所制備的顆粒的大小與載藥量和藥物釋放之間的關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的研究. 另外, 淀粉納米顆粒究竟結(jié)合多少葉酸, 才能達(dá)到最佳靶向效果; 靶向載體在體外與在體內(nèi)的靶向效果是否一致, 這些都需要深入探討.致謝 本工作為湖南省重點(diǎn)科技項(xiàng)目(批準(zhǔn)號(hào): 03NKY1001).參 考 文 獻(xiàn)1 Christopher P L, Philip S L. Delivery of macromolecules into liv-ing cells: a method that exploits folate receptor endocytosis

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