激光掃描共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用

1、激光掃描共聚焦顯微鏡的原理和應(yīng)用一、激光掃描共聚焦顯微鏡的原理傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡使用的是場(chǎng)光源，標(biāo)本上每一點(diǎn)的圖像都會(huì)受到鄰近點(diǎn)的衍射或散射光的干擾；激光掃描共焦顯微鏡 (Laser Sea nning Co nfocal Microscope，LSCM采用點(diǎn)光源照射樣本，在焦平面上形成一個(gè)輪廓清楚的小的 光點(diǎn)，該點(diǎn)被照射后發(fā)出的熒光被物鏡搜集，并沿原照射光路回送到由雙色鏡構(gòu)成的分光器。分光器將熒光直接送到探測(cè)器。光源和探測(cè)器前方都各有一個(gè)針孔， 分別稱(chēng)為照明針孔和探測(cè)針孔。照明針孔與探測(cè)針孔相對(duì)于物鏡焦平面是共軛 的,焦平面上的點(diǎn)同時(shí)聚焦于照明針孔和發(fā)射針孔，焦平面以外的點(diǎn)被擋在探測(cè)針孔之外不

2、能成像，這樣得到的共聚焦圖像是標(biāo)本的光學(xué)切面， 防止了非焦平面 上雜散光線(xiàn)的干擾，克服了普通顯微鏡圖像模糊的缺點(diǎn)，因此能得到整個(gè)焦平面 上清晰的共聚焦圖像。原理圖L4W 1激光掃描共聚焦顯微鏡組成特點(diǎn)LSCM由顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)，激光光源，掃描裝置和檢測(cè)系統(tǒng)構(gòu)成，整套儀器由計(jì)算機(jī)控制，各部件之間的操作切換都可在計(jì)算機(jī)操作平臺(tái)界面中方便靈活地進(jìn)行。顯微鏡是LSCM勺主要組件，它關(guān)系到系統(tǒng)的成像質(zhì)量。通常有倒置和正置兩種形式，前者在切片、活細(xì)胞檢測(cè)等生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中使用更廣泛。三、激光掃描共聚焦顯微鏡的應(yīng)用一細(xì)胞的三維重建普通熒光顯微鏡分辨率低，顯示的圖像結(jié)構(gòu)為多層面的圖像疊加，結(jié)構(gòu)不夠 清晰。LSC礎(chǔ)

3、以0.1卩m的步距沿軸向?qū)?xì)胞進(jìn)行分層掃描， 得到一組光學(xué)切片, 經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換后作為二維數(shù)組貯存。這些數(shù)組通過(guò)計(jì)算機(jī)進(jìn)行不同的三維重建算 法，可作單色或雙色圖像處理，組合成細(xì)胞真實(shí)的三維結(jié)構(gòu)。旋轉(zhuǎn)不同角度可觀 察各側(cè)面的外表形態(tài)，也可從不同的斷面觀察細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)，測(cè)量細(xì)胞的長(zhǎng)寬高、 體積和斷層面積等形態(tài)學(xué)參數(shù)。通過(guò)模擬熒光處理算法，可以產(chǎn)生在不同照明角 度形成的陰影效果，突出立體感。通過(guò)角度旋轉(zhuǎn)和細(xì)胞位置變化可產(chǎn)生三維動(dòng)畫(huà) 效果。LSCM勺三維重建廣泛用于各類(lèi)細(xì)胞骨架和形態(tài)學(xué)分析、染色體分析、細(xì) 胞程序化死亡的觀察、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)變化的分析和探測(cè)等方面。二靜態(tài)結(jié)構(gòu)檢測(cè)1. 細(xì)胞原位

4、檢測(cè)核酸用于細(xì)胞核定位及其形態(tài)學(xué)觀察、檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)DNA勺復(fù)制及斷裂情況以及染 色體定位觀察。2. 原位檢測(cè)蛋白質(zhì)、抗體及其他分子原位檢測(cè)蛋白質(zhì)、抗體及其他分子免疫熒光標(biāo)記技術(shù)檢測(cè)熒光蛋白3. 檢測(cè)細(xì)胞凋亡檢測(cè)細(xì)胞凋亡不同時(shí)期細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白4. 細(xì)胞器觀察及測(cè)定探針可以直接跨過(guò)死細(xì)胞或活細(xì)胞膜，選擇性地與特定細(xì)胞器結(jié)合5. 檢測(cè)細(xì)胞融合6. 觀察細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)7.觀察細(xì)胞間縫隙連接通訊8.檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂肪：尼羅紅檢測(cè)動(dòng)物組織中或體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)脂滴含量三動(dòng)態(tài)觀察：活體細(xì)胞或組織功能的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)1. 實(shí)時(shí)定量測(cè)定細(xì)胞內(nèi)鈣的變化鈣離子濃度測(cè)定和比率成像2. 測(cè)定細(xì)胞內(nèi)PH變化同一種探針BCECF分別用不同激發(fā)峰激發(fā)得到的熒光比例，探究PH變化3. 檢測(cè)膜電位的變化JC-1低電位下單體存在，發(fā)綠色熒光；高電位下 J-聚集體，發(fā)紅色熒光，隨 電位增加，紅色熒光也增加4. 檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧物種的產(chǎn)生5. 藥物篩選檢測(cè)藥物等跨膜進(jìn)入組織或細(xì)胞過(guò)程及定位；對(duì)藥物、病毒、細(xì)菌等熒光標(biāo)記，檢測(cè)是否進(jìn)入、位置含量、動(dòng)態(tài)過(guò)程；6. 檢測(cè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移-FRETGFP和YFP BFP和GFP等研究大分子間的相互作用7囊泡運(yùn)輸研究利用胞吞/胞吐探針FM4-64,結(jié)合激光共聚焦、電鏡、TIRF,檢測(cè)囊泡的運(yùn)動(dòng) 過(guò)程，探討B(tài)FA對(duì)胞吞/胞吐過(guò)程的影響。8.