簡析使用血球計(jì)數(shù)板對酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)的若干問題

1、簡析使用血球計(jì)數(shù)板對酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)的假設(shè)干問題喬靜如何正確使用血球計(jì)數(shù)板對酵母菌種群數(shù)量進(jìn)行計(jì)數(shù)，是近年來的高考題或模擬題中屢次出現(xiàn)相關(guān)的試題，而且不僅從如何計(jì)算酵母的數(shù)量的角度來考查學(xué)生，還從操作 方法或操作過程中出現(xiàn)的一些問題以及處理方法來考查學(xué)生。而教師在遇到這些問題往往讓學(xué)生記答案，學(xué)生對這些問題仍是感到疑惑。筆者在近年來的教學(xué)實(shí)踐中，將教師 和學(xué)生在做該實(shí)驗(yàn)和相關(guān)命題遇到的一些問題，進(jìn)行了分析探討。1血球計(jì)數(shù)板的構(gòu)造和計(jì)數(shù)原理雖然不同版本的教材推薦使用的血球計(jì)數(shù)板的規(guī)格不同，人教版建議使用 2mmx2mmx0.1mm 方格，蘇教版推薦使用 ImmxImmxO.Imm 方格，但是血球計(jì)

2、數(shù)板 的使用原理和方法是相同的。以下以ImmxImmxO.Imm 方格的計(jì)數(shù)板為例分析結(jié)構(gòu)和 計(jì)數(shù)原理。小方格叩力恪M416x25每個血球計(jì)數(shù)板上有兩個計(jì)數(shù)室圖 1。血球計(jì)數(shù)板上的符號和數(shù)字圖 1的含義是：XB-K-25為計(jì)數(shù)板的型號和規(guī)格，表示此計(jì)數(shù)板中計(jì)數(shù)室分25個中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的高；1/400mrn表示計(jì)數(shù)室面積是1mm 計(jì)數(shù)室邊長1mri，分 400個小格，每小格面積是1/400mm 圖2, 9個大方格中只有中間的有小方格的中央 大方格才是計(jì)數(shù)室。不要認(rèn)為 9個大方格都是計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室通常也有兩種規(guī)格：一種是 16x25型，即大方格內(nèi)分為16中格，每一中格 又分為

3、25小格圖2；另一種是25x16型，即大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分 為16小格。但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同的特點(diǎn)，即每一大方格 都是由16x25=25x16=400個小方格組成。計(jì)數(shù)時(shí)，假設(shè)計(jì)數(shù)室是由16個中方格組成，數(shù)左上、左下、右上、右下的4個中方格即100個小方格的菌數(shù)。如果是由25個中方格組成的計(jì)數(shù)室，除數(shù)上述 4個中 方格外，還需數(shù)中央1個中方格即80個小格方的菌數(shù)圖3。計(jì)數(shù)時(shí)對壓在中格 四條線上的細(xì)胞只計(jì)數(shù)相鄰兩邊及其夾角上的細(xì)胞一般選左邊和上邊的線。以1minxlmmxO.1 mn方格的計(jì)數(shù)板為例，如果是25個中格的計(jì)數(shù)室，計(jì)數(shù)的5個 中格菌數(shù)共N個，那么

4、1mL培養(yǎng)液中菌數(shù)=N/5x25x10000x稀釋倍數(shù)。如果是16個中格 的計(jì)數(shù)室，計(jì)數(shù)的4個中格菌數(shù)共N個，那么1mL培養(yǎng)液中菌數(shù)=N/4x16x10000x稀釋倍 數(shù)。2血球計(jì)數(shù)板操作方法的考前須知教師在介紹血球計(jì)數(shù)板的操作方法時(shí)，往往是比擬簡略的。學(xué)生在操作中因?yàn)閷Σ?作要求不理解而造成操作不當(dāng)，或者對操作中出現(xiàn)的異常問題的處理不知如何處理。而 通過分析近幾年的有關(guān)血球計(jì)數(shù)板的相關(guān)試題，更注重操作方面的考查，而教師在這方 面對學(xué)生分析闡述得少。1在取樣計(jì)數(shù)前，為什么要將酵母菌培養(yǎng)液進(jìn)行振蕩搖勻？因?yàn)檫@樣使酵母菌分布均勻，防止酵母凝聚沉淀，提高計(jì)數(shù)的代表性和準(zhǔn)確性，減 小培養(yǎng)液中的酵母菌數(shù)

5、量誤差。2為什么要先在計(jì)數(shù)室上蓋上蓋玻片，再滴加菌液？通常滴加菌液時(shí)，采用的是“滲入法：先將蓋片蓋住計(jì)數(shù)室，蓋片的兩端應(yīng)搭放 在計(jì)數(shù)室兩側(cè)的支持柱上。從計(jì)數(shù)板中間平臺兩側(cè)的溝槽內(nèi)沿蓋玻片的下邊緣滴入一小 滴不宜過多，一般將滴管口沿蓋片邊緣與計(jì)數(shù)平臺之間的空隙輕輕靠一靠即可，讓 菌懸液滲入并充滿計(jì)數(shù)室，勿使氣泡產(chǎn)生，并用吸水紙吸去多余菌液。技巧：用吸水紙 吸去多余的培養(yǎng)液時(shí)要迅速，保證計(jì)數(shù)室被培養(yǎng)液充滿，以減少誤差。但也可采用“壓滴法：先將適量菌液滴加在計(jì)數(shù)平臺上，再將蓋片從一側(cè)壓到計(jì)數(shù)扳上，使蓋片搭放在兩那么支持柱上，將菌液滴壓平。不管用哪種方法，都必須把握3個原那么：參加待測菌液后，計(jì)數(shù)室內(nèi)

6、不能產(chǎn)生氣泡；不能將菌懸液沾到蓋玻片外表，以 免污染顯微鏡的高倍鏡頭；不能將菌液沾到計(jì)數(shù)平臺兩側(cè)的支持柱外表。比擬而言，滲 入法更容易操作。3如果先滴加菌液，再加蓋玻片，容易出現(xiàn)什么誤差？怎么處理？如果先滴加菌液，再加蓋玻片壓滴法，容易使菌液沾到計(jì)數(shù)平臺兩側(cè)的支持柱 外表，在支持柱外表形成一層水膜而使蓋片不能完全落在支持柱上。蓋玻片由于液滴的 外表張力作用而未能嚴(yán)密的蓋到計(jì)數(shù)板外表上，使計(jì)數(shù)室內(nèi)的體積增大，計(jì)數(shù)結(jié)果將偏 高。應(yīng)將血球計(jì)數(shù)板和蓋玻片洗凈、烘干重做。4如果計(jì)數(shù)室中出現(xiàn)氣泡，會出現(xiàn)什么誤差？怎么處理？如果計(jì)數(shù)室中出現(xiàn)氣泡，會使蓋玻片下有局部空間沒有充滿菌液，是待計(jì)數(shù)的菌液 體積減少，

7、導(dǎo)致結(jié)果偏小。應(yīng)將血球計(jì)數(shù)板和蓋玻片洗凈、烘干重做。也就要重新制片。為什么不采用在蓋玻片一側(cè)滴加菌液，另一側(cè)用吸水紙吸引的“引流法？這是因 為通過引流法，將蓋玻片下方的液體可以進(jìn)行置換，可能會去除局部氣泡，但很難除盡 氣泡。引出的菌液會帶走局部細(xì)胞，造成誤差。菌液也容易沾到蓋玻片外表，污染顯微 鏡的高倍鏡頭而看不到目標(biāo)。5血球計(jì)數(shù)板應(yīng)該如何正確清洗？血球計(jì)數(shù)板使用結(jié)束后，應(yīng)采用清水浸泡和沖洗的方式清洗，并進(jìn)行烘干或自然晾 干或用吹風(fēng)機(jī)吹干。不能使用試管刷等硬物進(jìn)行擦洗。鏡檢每個小格中是否存有污物、 殘菌，如不清潔，需重新清洗直至潔凈。這是因?yàn)檠蛴?jì)數(shù)板的方格線非常精細(xì)、脆弱，當(dāng)用試管刷擦洗時(shí)會

8、造成線條磨損。也 不能用普通的餐巾紙等進(jìn)行拭擦，可能磨損線條，也會在計(jì)數(shù)室中留下紙纖維等污物。 要用專用的拭鏡紙輕輕擦拭。另外在使用血球計(jì)數(shù)板前需要在顯微鏡下檢查，不干凈要 清洗烘干再使用。6使用顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，要注意哪些問題？ 血球計(jì)數(shù)板加樣后，需靜置片刻再使用顯微鏡計(jì)數(shù)。這是因?yàn)橛?jì)數(shù)室中的菌懸液 有一定的高度0.1mm。需要讓細(xì)胞沉降到計(jì)數(shù)室底部的網(wǎng)格線中，防止細(xì)胞分布在 不同液層深度，導(dǎo)致計(jì)數(shù)時(shí)被遺漏。 先在低倍鏡下，找到網(wǎng)格，也就是要先找到計(jì)數(shù)室有小網(wǎng)格的局部。將第一 個計(jì)數(shù)中格移到視野中心，再換高倍鏡逐小格觀察并計(jì)數(shù)。觀察時(shí)還應(yīng)安排一個順序， 比方，依次按照左上中格、左下中格、右下

9、中格、右上中格。假設(shè)有第五中格時(shí)，當(dāng)計(jì)數(shù) 到右上中格時(shí)，先向左移動兩個中格，再往下移動兩個中格便是最中間的一個中格。小 格的觀察順序最好是從左到右，從上到下逐格進(jìn)行。計(jì)數(shù)時(shí)壓線的細(xì)胞本著計(jì)上不計(jì)下， 計(jì)左不計(jì)右的原那么，以免重復(fù)計(jì)數(shù)?；罱湍赣醒恐超F(xiàn)象，假設(shè)芽體到達(dá)母細(xì)胞大小的一半時(shí)，即可作為兩個菌體計(jì)數(shù)；假設(shè) 芽體小于母細(xì)胞一半時(shí)為一個酵母細(xì)胞。 因?yàn)樯罱湍讣?xì)胞的折光率和培養(yǎng)液的折光率相近，所以觀察時(shí)要減弱光照的強(qiáng) 度，將視野調(diào)暗些。但不能太暗，否那么也看不清。 每個樣品計(jì)數(shù)應(yīng)重復(fù)3次每次數(shù)值不應(yīng)相差過大，否那么應(yīng)重新操作，取其平 均值。7如果細(xì)胞數(shù)目過多，難以數(shù)清，應(yīng)該采取什么措施？如果一

10、個小方格內(nèi)酵母菌過多，難以數(shù)清，應(yīng)該進(jìn)行稀釋，然后再進(jìn)行計(jì)數(shù)。一般 樣品稀釋度要求每小格內(nèi)約有510個菌體為宜。稀釋時(shí)要注意：將1mL樣液稀釋10倍，不是加10mL無菌水，而是加9mL無菌水, 即加水稀釋后的體積是原來的10倍。這點(diǎn)不仔細(xì)就很容易分析錯。例如將 1mL樣液稀 釋100倍，就應(yīng)該加99mL水。而不是90mL水。8能不能區(qū)分活酵母細(xì)胞和死酵母細(xì)胞，防止計(jì)數(shù)出現(xiàn)較大誤差？探究“酵母菌種群數(shù)量變化，理應(yīng)為培養(yǎng)液中活菌體的數(shù)量變化，人教版教材中 沒有提出活菌和死菌的分開計(jì)數(shù)問題。易理解成用總的菌體數(shù)作計(jì)數(shù)結(jié)果；蘇教版教材 中雖建議用臺酚藍(lán)染液染色，但沒有說明這是對活菌無色和死菌藍(lán)色的區(qū)分，