動物檢疫專業(yè)方法標(biāo)準驗證程序試行

1、動物檢疫專業(yè)方法標(biāo)準驗證程序(試行)1 適用范圍本程序規(guī)定了動物檢疫方法標(biāo)準制修訂過程中的驗證要求及程序。本程序適用于出入境動物檢疫方法標(biāo)準制修訂過程中的驗證活動。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標(biāo)準的引用而成為本標(biāo)準的條款。 凡是注日期的引用文件， 其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容) 或修訂版均不適用于本標(biāo)準， 然而，鼓勵根據(jù)本標(biāo)準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。 凡是不注日期的引用文件， 其最新版本適用于本標(biāo)準。OIE 陸生動物診斷實驗和疫苗手冊O(shè)IE Quality Standard and Guideline for Veterinary Laborator

2、y: Infectious Diseases ( 2008 版)GB/T 27401-2008 實驗室質(zhì)量控制規(guī)范動物檢疫CNAS CL01： 2006檢測和校準實驗室能力認可準則3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件：方法標(biāo)準(standard) ：為實現(xiàn)特定檢測目的，對所采取的途徑、步驟和手段的規(guī)定要求所做的統(tǒng)一認定。它以科學(xué)、技術(shù)和實踐經(jīng)驗的綜合成果為基礎(chǔ)， 經(jīng)有關(guān)方面協(xié)商一致，由主管機構(gòu)批準，以特定形式發(fā)布，作為共同遵守的準則和依據(jù)。驗證( Verification )：通過提供客觀證據(jù)對規(guī)定要求已得到滿足的認定。確認 (Validation) ：通過提供客觀證據(jù)對特定的預(yù)期用途或應(yīng)

3、用要求已得到滿足的認定。樣品(Sample):取自某一整體的一個或多個部分，旨在提供該整體的相關(guān)信息，通常作為判斷該整體的基礎(chǔ)。臨界值( Cut-off value )：區(qū)分陰性和陽性結(jié)果的試驗數(shù)值，是連續(xù)的檢測結(jié)果中間的一個值。重復(fù)性(Repeatability )：是指在相同的檢測條件下，對同一樣品的同一目標(biāo)分析值進行連續(xù)多次測量，所得結(jié)果之間的一致性。敏感性(Sensitivity )：是目標(biāo)分析物的最小可檢出量，即方法的最低檢出限。特異性(Specificity )：是方法不與其它分析物發(fā)生交叉反應(yīng)的程度。線性范圍( Linear range )：檢測結(jié)果或檢測結(jié)果的轉(zhuǎn)換值和目標(biāo)檢測物

4、的濃度呈線性關(guān)系的數(shù)值范圍。在線性范圍內(nèi)，檢測結(jié)果準確度高,重復(fù)性好,結(jié)論可信度高。再現(xiàn)性( Reproducibility )：就是當(dāng)一個方法被不同實驗室應(yīng)用于同一樣品的不同重復(fù)的檢測時，能夠給出相同結(jié)果的能力。4 方法標(biāo)準制修訂人員的驗證活動4.1 方法標(biāo)準制修訂人員應(yīng)使用適當(dāng)?shù)臋z測方法和相關(guān)程序?qū)λ袛M用于動物檢疫的方法標(biāo)準進行驗證。 驗證時應(yīng)考慮所有影響方法標(biāo)準和檢測結(jié)果的因素。 這些因素包括方法的適用性；樣品的來源、數(shù)量及采集方式、儲存條件、樣品稀釋濃度的選擇；試劑的選擇；標(biāo)準品（包括參考動物的數(shù)量和感染狀態(tài)）的選擇；試驗對照的設(shè)立等。4.2 如果所制修訂的方法標(biāo)準等同采用了知名的技

5、術(shù)組織或刊物認可或發(fā)布的方法， 或者是國際標(biāo)準方法，在被證實適用于規(guī)定的檢測/ 診斷目的之前，都應(yīng)進行驗證。驗證活動至少應(yīng)針對分析敏感性、 分析特異性、準確性和精確性做出評價； 如果條件許可，可對診斷敏感性、診斷特異性的適用性做出說明。4.3 如果所制修訂的方法標(biāo)準采用的是非標(biāo)準方法、實驗室設(shè)計（制定）的方法、超出其預(yù)定范圍使用的標(biāo)準方法、擴充和修改過的標(biāo)準方法，在被證實適用于預(yù)期的檢測/診斷目的之前，應(yīng)進行確認。確認應(yīng)盡可能全面，以滿足預(yù)定用途或應(yīng)用領(lǐng)域的需要。確認活動至少應(yīng)針對分析敏感性、分析特異性、 準確性和精確性做出評價；如果條件許可，可對診斷敏感性、 診斷特異性的適用性做出說明。 方

6、法標(biāo)準的確認活動可參照有關(guān)專門的技術(shù)標(biāo)準進行。4.4 應(yīng)記錄驗證活動所用的方法及獲得的結(jié)果。應(yīng)保證方法標(biāo)準驗證人員經(jīng)過良好培訓(xùn)，有能力承擔(dān)驗證工作。方法標(biāo)準驗證所用的樣品、檢測試劑、程序或說明都應(yīng)完全受控。4.5 選擇樣品時，應(yīng)注意的因素：1）選擇的樣品應(yīng)該能夠代表群體中已感染和未感染的動物。2）選擇的樣品中目標(biāo)分析物的濃度應(yīng)該能夠代表目標(biāo)動物群的感染狀態(tài)。3）樣品來源的參考動物群應(yīng)該包括存在于自然狀態(tài)下的動物群的變異，這些變異包括但不限于品種、年齡、性別、品系、營養(yǎng)狀況、是否懷孕、感染階段、免疫狀態(tài)（包括接種歷史）、歷史的、流行病學(xué)的和 / 或臨床的數(shù)據(jù)（包括畜群的疾病史）。4）應(yīng)該使用金標(biāo)

7、準方法對動物的感染狀態(tài)進行判定。如果金標(biāo)準方法不可獲得時，也可以使用其它方法對動物的感染狀態(tài)進行判定， 但是應(yīng)該采取措施對這些方法引入的偏差進行控制。5）樣品來源的動物彼此之間應(yīng)該是獨立的。樣品不應(yīng)該只來源于試驗動物。6）樣品數(shù)受需要達到的置信水平的影響，理論上需要達到的置信水平應(yīng)該在75%-99%之間。4.6 選擇試劑時，應(yīng)注意的因素：1）如果可以獲得，盡量使用國際參考試劑/標(biāo)準物質(zhì)對擬建立的方法標(biāo)準進行優(yōu)化。2）使用試劑應(yīng)特性清楚，說明完整、準確。3）應(yīng)該對被選定的試劑進行適當(dāng)?shù)臏蕚洹⑾♂?、儲存，以備每一次試驗使用，以保證試驗的連續(xù)性。4.7 方法標(biāo)準的敏感性的驗證。4.7.1 如果一個方

8、法規(guī)定的目的是用于動物抗體活性的普查，方法就需要有很高的敏感性，以達到盡可能地檢測出感染的動物， 如果方法不能具有這種很高的敏感性， 那么它就不適合作為一個篩選方法。4.7.2 評估敏感性所使用的樣品可以通過對已知目標(biāo)分析物含量的標(biāo)準樣品進行有限稀釋而得到。4.7.3 如果由于缺乏標(biāo)準品或已知濃度的樣品而不能獲得客觀的絕對度量，可以通過對已知陽性的樣品進行有限稀釋而獲得。4.7.4 如果不能獲得已知濃度的標(biāo)準或樣品，還可以使用加入已知量的目標(biāo)分析物的樣品。但是這種樣品可能和從臨床病例中得到的樣品有本質(zhì)的不同， 在對結(jié)果進行分析時要考慮到這一點。4.7.5 敏感性的計算公式為：敏感性=樣品檢測結(jié)

9、果中真陽性的數(shù)目樣品檢測結(jié)果中真陽性的數(shù)目+樣品檢測結(jié)果中假陰性的數(shù)目注：其中“樣品檢測結(jié)果中真陽性的數(shù)目”為使用擬建立的方法與金標(biāo)準方法檢測結(jié)果 均為陽性的檢測結(jié)果數(shù)目；“樣品檢測結(jié)果中假陰性的數(shù)目”為使用金標(biāo)準方法檢測為陽性， 使用擬建立的方法檢測為陰性的檢測結(jié)果的數(shù)目。4.7.6 應(yīng)該在可能的情況下，應(yīng)盡量增加用于敏感性評估的樣品數(shù)目，并且應(yīng)該盡可能使用 標(biāo)準樣品，以提高評估的置信度。4.8 方法標(biāo)準特異性的驗證4.8.1 應(yīng)根據(jù)方法標(biāo)準的要求確定診斷方法的合適的特異性。如果方法標(biāo)準是用于確診試驗，方法標(biāo)準應(yīng)具有足夠的特異性，以將檢測中產(chǎn)生的交叉反應(yīng)降到最低。4.8.2 在可能的情況下，

10、盡量增加用于特異性評估的樣品數(shù)目，并且應(yīng)盡可能使用標(biāo)準樣品， 以提高評估的置信度。4.8.3 方法標(biāo)準的特異性評估須使用一組樣品，樣品應(yīng)包括含有目標(biāo)分析物的樣品和含有目 標(biāo)分析物的相似物的樣品。4.8.4 可使用加入目標(biāo)分析物或目標(biāo)分析物的相似物的樣品對特異性進行分析。但是這種樣 品可能和從臨床病例中得到的樣品有本質(zhì)的不同，在對結(jié)果進行分析時要考慮到這一點。4.8.5 特異性的計算公式為：診斷特異性=樣品檢測結(jié)果中真陰性的數(shù)目樣品檢測結(jié)果中真陰性的數(shù)目""+樣品檢測結(jié)果中假陽性的數(shù)目注：其中“樣品檢測結(jié)果中真陰性的數(shù)目”為使用擬建立的方法與金標(biāo)準方法檢測結(jié)果 均為陰性的檢測

11、結(jié)果的數(shù)目；“樣品檢測結(jié)果中假陽性的數(shù)目”為使用金標(biāo)準方法檢測為陰 性，使用擬建立的方法檢測為陽性的檢測結(jié)果的數(shù)目。注：如果敏感性和特異性都不能達到規(guī)定的要求，需要對試劑進行校準或替代，或?qū)Ψ?法進行優(yōu)化，或者放棄這種方法。4.9 重復(fù)性的驗證4.9.1 重復(fù)性所選擇的樣品應(yīng)該是在方法的線性范圍內(nèi)具有代表性的樣品。應(yīng)該包含1個陽性對照，1個陰性對照，5個已知樣品（其中2個為陽性樣品，3個為陰性樣。設(shè)定相同的 程序、相同的操作人員、在相同的條件下使用相同的儀器、相同的地點在3個不同的日期進行，以保證所有的檢測是獨立的。4.9.2 重復(fù)性的變異不能超過 30%。如果超過30%,就需要進行更多的初步

12、研究，以證明該 方法是足夠穩(wěn)定的；如果不能證明方法具有足夠的重復(fù)性， 應(yīng)該考慮放棄對這一方法的驗證。4.10 線性范圍在可能的情況下， 應(yīng)該對方法的線性范圍進行確定。 如果可能， 有效的檢測結(jié)果應(yīng)該是落在線性范圍之內(nèi)的。4.11 臨界值（ cut-off 值）4.11.1 Cut-off 值的選擇應(yīng)該適應(yīng)方法的要求的目的。在同一個檢測系統(tǒng)中，用于篩選的試驗需要具有高敏感性， 而用于確診的試驗則需要具有高特異性， 因而這兩種目的的試驗就應(yīng)該有不同的 Cut-off 值，以適應(yīng)不同的用途。4.11.2 Cut-off 值的建立有3 種方式：根據(jù)感染的和未感染的參考動物的檢測結(jié)果的頻率分布來確定；

13、只根據(jù)未感染動物檢測結(jié)果的頻率分布來確定； 基于從目標(biāo)動物群中隨機抽取的 血清的檢測結(jié)果。4.11.3 用于篩選的試驗需要具有高敏感性，而用于確診的試驗則需要具有高特異性。4.11.4 如果已感染和未感染動物的檢測結(jié)果的分布出現(xiàn)了一定的交叉，就可能需要兩個Cut-off 值，一個用于定義高敏感性，一個用于定義高特異性。而那些落在這兩個百分比之間的結(jié)果就被定義為可疑的或不確定的結(jié)果，需要用確診方法進行檢測或重新檢測。4.12 方法標(biāo)準間的比較和協(xié)調(diào)4.12.1 方法標(biāo)準間比較的目的是為了證明新方法是現(xiàn)有技術(shù)的提高。4.12.2 方法標(biāo)準間比較包括對方法的工作特性 （如敏感性和特異性） 或?qū)Ψ椒ǖ?/p>

14、操作特性 （如 成本、所需環(huán)境、時間周期、檢測量等）進行比較。4.12.3 如果可以獲得OIE 標(biāo)準或其它國際標(biāo)準，應(yīng)該使用這些標(biāo)準進行方法的比較研究，將新方法追溯到國際標(biāo)準方法和 / 或國際標(biāo)準，實現(xiàn)與國際標(biāo)準方法的協(xié)調(diào)。4.12.4 如果可以獲得目標(biāo)分析物檢測的標(biāo)準方法時， 應(yīng)該使擬建立的方法標(biāo)準與標(biāo)準方法取得協(xié)調(diào)。4.12.5 應(yīng)使用相同的血清對照和/或標(biāo)準。如果國際標(biāo)準可以獲得，應(yīng)將其應(yīng)用到方法標(biāo)注的比較活動中。4.12.6 與其它方法協(xié)同使用的新方法需要對與檢測數(shù)據(jù)和結(jié)果判斷有關(guān)的問題進行解釋說 明。4.13 再現(xiàn)性的驗證4.13.1 如果所建立的方法標(biāo)準要向很多個實驗室推廣，須對其

15、再現(xiàn)性進行評估。4.13.2 對再現(xiàn)性的評估最少需在檢驗檢疫動物檢疫專業(yè)標(biāo)委會的三個實驗室 （或 3 名實驗員）進行，應(yīng)對相同的樣品組使用相同的方法進行檢測。4.13.3 用于再現(xiàn)性評估的樣品至少包含1個陽性對照，1個陰性對照，3個已知的陽性樣品,2個已知的陰性樣品。理想狀態(tài)下，這些樣品應(yīng)該是來自于目標(biāo)動物群的獨立樣品，代表群 體中的目標(biāo)檢測物的活性范圍。如果這樣的樣品不可獲得，那么對已知陽性樣品進行系列稀釋以達到需要的活性范圍也是可以接受的。4.13.4 驗證再現(xiàn)性所用的樣品，應(yīng)逐個進行分裝、 編碼、分發(fā)、運輸?shù)絽⒓訉嶒炇一蚍职l(fā)給實驗員，在相同的條件下儲存。4.13.5 對參加實驗室（或?qū)嶒?/p>

16、員）的檢測數(shù)據(jù)進行收集、評估。這些數(shù)據(jù)包括：實驗室（或 實驗員）間平均值、標(biāo)準偏差、每個樣品和對照的變化范圍。4.13.6 對每個實驗室（或?qū)嶒瀱T）的準確性和精確性進行評估。4.13.7 進行再現(xiàn)性評估時，建議每個實驗室（或每個實驗員）將每個樣品做兩個或三個重復(fù)， 以進一步評估方法在實驗室內(nèi)部的重復(fù)性。4.13.8 將兩個實驗室（或?qū)嶒瀱T）的平均值進行比較，如果:產(chǎn)一戶工2&j用一則認為兩個實驗室檢測結(jié)果的平均值在統(tǒng)計學(xué)上沒有顯著差異。 其中：!?2% =重復(fù)性標(biāo)準偏差R =再現(xiàn)性標(biāo)準偏差4.14 方法的應(yīng)用只有那些表現(xiàn)出能夠適應(yīng)檢測目的的方法才可以被應(yīng)用到實際檢測工作中。在應(yīng)用過程中

17、得到行業(yè)、國家、地區(qū)或國際認可的方法才能夠上升為標(biāo)準。4.15 方法有效性的控制4.15.1 內(nèi)部質(zhì)量控制對擬驗證的方法標(biāo)準應(yīng)制定內(nèi)部質(zhì)量控制計劃以監(jiān)控和維持方法的有效性。內(nèi)部質(zhì)量控制的方法可包括空白試驗、標(biāo)準曲線核查、儀器設(shè)備的定期檢定、平行樣檢測、加入標(biāo)準樣品、內(nèi)部比對試驗、盲樣檢測、編制質(zhì)量控制圖等。4.15.2 外部質(zhì)量控制對擬驗證的方法標(biāo)準應(yīng)制定外部質(zhì)量控制計劃以監(jiān)控和維持方法的有效性。外部質(zhì)量控制方式包括實驗室間比對和能力驗證。4.16 方法/標(biāo)準的文件化4.16.1 應(yīng)對擬驗證的方法標(biāo)準制定文件化的程序， 程序應(yīng)包括但不限于以下內(nèi)容： 方法名稱，應(yīng)用范圍， 參考文獻， 原理， 方法特性， 所需設(shè)施， 所需試劑， 樣品采集、 處理和儲存需要，安全需要，操作步驟，質(zhì)量控制步驟。4.16.2 應(yīng)對方法標(biāo)準中影響檢測結(jié)果的關(guān)鍵控制點進行說明。4.16.3 文件化的方法標(biāo)準應(yīng)受控。4.16.4 在開始驗證和正式實施之前對最低質(zhì)量要求（可接受的標(biāo)準）進行描述，或者在建立方法之前進行描述