血球計(jì)數(shù)板使用問(wèn)題

1、關(guān)于血球計(jì)數(shù)板的使用及問(wèn)題討論培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化是新課標(biāo)教材“必修3：穩(wěn)態(tài)與環(huán)境”中的學(xué)生分組實(shí)驗(yàn)，該實(shí)驗(yàn)通過(guò)探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化，嘗試建構(gòu)種群增長(zhǎng)的數(shù)學(xué)模型并用數(shù)學(xué)模型解釋種群數(shù)量的變化，說(shuō)明制約種群個(gè)體數(shù)量變化的種群外部環(huán)境因素和種群內(nèi)部因素。在該實(shí)驗(yàn)中，需要測(cè)定酵母菌細(xì)胞數(shù)量。測(cè)定細(xì)胞數(shù)目的方法有顯微鏡直接計(jì)數(shù)法、平板菌落計(jì)數(shù)法、光電比濁法等，教材采用的是較為簡(jiǎn)便、快速、直觀的顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。因此，學(xué)會(huì)使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，是該實(shí)驗(yàn)成功與否的關(guān)鍵。雖然不同版本的教材推薦使用的血球計(jì)數(shù)板的規(guī)格不同，人教版建議使用2mm×2mm×0.1m

2、m方格，蘇教版推薦使用1mm×1mm×0.1mm方格，但是血球計(jì)數(shù)板的使用原理和方法是相同的。筆者通過(guò)近年來(lái)對(duì)該實(shí)驗(yàn)的摸索，對(duì)血球計(jì)數(shù)板的使用和命題方面存在的一些問(wèn)題進(jìn)行了分析總結(jié)。一、血球計(jì)數(shù)板的使用原理顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品的懸浮液置于一種特別的具有確定面積和容積的載玻片上（又稱計(jì)菌器），于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)，然后推算出含菌數(shù)的一種方法。血球計(jì)數(shù)板是常用的計(jì)菌器之一。血球計(jì)數(shù)板是一種專門用于計(jì)算較大單細(xì)胞微生物的一種儀器，由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的玻片中有四條下凹的槽，構(gòu)成三個(gè)平臺(tái)。中間的平臺(tái)較寬，其中間又被一短橫槽隔為兩半，每半邊上面刻有一個(gè)方格網(wǎng)。

3、方格網(wǎng)上刻有9個(gè)大方格，其中只有中間的一個(gè)大方格為計(jì)數(shù)室。這一大方格的長(zhǎng)和寬各為1mm，深度為0.1mm，其容積為0.1mm3，即1mm×1mm×0.1mm方格的計(jì)數(shù)板；大方格的長(zhǎng)和寬各2mm，深度為0.1mm，其容積為0.4mm3，即2mm×2mm×0.1mm方格的計(jì)數(shù)板。在血球計(jì)數(shù)板上，刻有一些符號(hào)和數(shù)字(見(jiàn)圖一)，其含義是：XB-K-25為計(jì)數(shù)板的型號(hào)和規(guī)格，表示此計(jì)數(shù)板分25個(gè)中格；0.1mm為蓋上蓋玻片后計(jì)數(shù)室的高；1/400mm2表示計(jì)數(shù)室面積是1mm2，分400個(gè)小格，每小格面積是1/400 mm2。計(jì)數(shù)室通常也有兩種規(guī)格：一種是16

4、15;25型，即大方格內(nèi)分為16中格，每一中格又分為25小格；另一種是25×16型，即大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分為16小格。但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個(gè)共同的特點(diǎn)，即每一大方格都是由16×25=25×16=400個(gè)小方格組成。116×25型的計(jì)數(shù)板 將計(jì)數(shù)室放大，可見(jiàn)它含16中格，一般取四角：1、4、13、16四個(gè)中方格（100個(gè)小方格）計(jì)數(shù)（見(jiàn)圖二）。將每一中格放大，可見(jiàn)25個(gè)小格。計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取其平均值。計(jì)數(shù)完畢后，依下列公式計(jì)算：酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)1mL=100個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/ 100 ×400×10000&#

5、215;稀釋倍數(shù)225×16型的計(jì)數(shù)板 中央大方格以雙線等分成25個(gè)中方格，每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格，供細(xì)胞計(jì)數(shù)用（見(jiàn)圖三）。一般計(jì)數(shù)四個(gè)角和中央的五個(gè)中方格（80個(gè)小方格）的細(xì)胞數(shù)。計(jì)數(shù)重復(fù)3次，取其平均值。計(jì)數(shù)完畢后，依下列公式計(jì)算：酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)1mL 80個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/ 80 ×400×10000×稀釋倍數(shù)二、血球計(jì)數(shù)板的使用方法步驟使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)時(shí)，按照如下的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行：1鏡檢計(jì)數(shù)室。在加樣前，先對(duì)計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)；2加樣品。將清潔干燥的血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室上加蓋專用的蓋玻片，用吸管吸取稀

6、釋后的酵母菌懸液，滴于蓋玻片邊緣，讓培養(yǎng)液自行緩緩滲入，一次性充滿計(jì)數(shù)室，防止產(chǎn)生氣泡，充入細(xì)胞懸液的量以不超過(guò)計(jì)數(shù)室臺(tái)面與蓋玻片之間的矩形邊緣為宜。多余培養(yǎng)液可用濾紙吸去；3計(jì)數(shù)。稍待片刻（約5min），待酵母菌細(xì)胞全部沉降到計(jì)數(shù)室底部后，將計(jì)數(shù)板放在載物臺(tái)的中央，先在低倍鏡下找到計(jì)數(shù)室所在位置后，再轉(zhuǎn)換高倍鏡觀察、計(jì)數(shù)并記錄。三、血球計(jì)數(shù)板的使用注意事項(xiàng)培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化實(shí)驗(yàn)是一個(gè)歷時(shí)較長(zhǎng)（7天左右）的實(shí)驗(yàn)，事前一定要做好周密的計(jì)劃，定程序、定時(shí)間、定人員。每天采用抽樣檢測(cè)法使用血球計(jì)數(shù)板對(duì)酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，在計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)從以下幾方面注意。1每天同一時(shí)間，各組取出本組的試管，用血球

7、計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌個(gè)數(shù)，并作記錄，連續(xù)觀察7天。2從試管中吸出培養(yǎng)液進(jìn)行計(jì)數(shù)之前，要將試管輕輕震蕩幾下，這樣使酵母菌分布均勻，防止酵母凝聚沉淀，提高計(jì)數(shù)的代表性和準(zhǔn)確性，求得的培養(yǎng)液中的酵母菌數(shù)量誤差小。3如果一個(gè)小方格內(nèi)酵母菌過(guò)多，難以數(shù)清，應(yīng)當(dāng)對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋以便于酵母菌的計(jì)數(shù)。具體方法是：搖勻試管，取1mL酵母菌培養(yǎng)液，加入成倍的無(wú)菌水稀釋，稀釋n倍后，再用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，所得數(shù)值乘以稀釋倍數(shù)。以每小方格內(nèi)含有45個(gè)酵母細(xì)胞為宜。特別是在培養(yǎng)后期的樣液需要稀釋后計(jì)數(shù)。4活酵母有芽殖現(xiàn)象，若芽體達(dá)到母細(xì)胞大小的一半時(shí)，即可作為兩個(gè)菌體計(jì)數(shù)，若芽體小于母細(xì)胞一半時(shí)為1個(gè)酵母細(xì)胞。5對(duì)于壓在方格

8、界線上的酵母菌應(yīng)當(dāng)計(jì)數(shù)同側(cè)相鄰兩邊上的菌體數(shù)，一般可采取“數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線不數(shù)右線”的原則處理，另兩邊不計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時(shí)，如果使用16格×25格規(guī)格的計(jì)數(shù)室，要按對(duì)角線位，取左上、右上、左下、右下4個(gè)中格(即100個(gè)小格)的酵母菌數(shù)；如果規(guī)格為25格×16格的計(jì)數(shù)板，除了取其4個(gè)對(duì)角方位外，還需再數(shù)中央的一個(gè)中格(即80個(gè)小方格)的酵母菌數(shù)。6計(jì)數(shù)一個(gè)樣品要從兩個(gè)計(jì)數(shù)室中計(jì)得的平均數(shù)值來(lái)計(jì)算，對(duì)每個(gè)樣品可計(jì)數(shù)三次，再取其平均值。計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)不時(shí)調(diào)節(jié)焦距，才能觀察到不同深度的菌體。按公式計(jì)算每1ml（或10mL）菌液中所含的酵母菌個(gè)數(shù)。7血球計(jì)數(shù)板的清潔血球計(jì)數(shù)板使用后，用自來(lái)

9、水沖洗，切勿用硬物洗刷，洗后自行晾干或用吹風(fēng)機(jī)吹干，或用95%的乙醇、無(wú)水乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑脫水使其干燥。通過(guò)鏡檢觀察每小格內(nèi)是否殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)清洗直到干凈為止。四、關(guān)于血球計(jì)數(shù)板的命題由于實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化是新教材新增加的實(shí)驗(yàn)，在各地各類命題中都關(guān)注了這一實(shí)驗(yàn)，并對(duì)血球計(jì)數(shù)板的使用進(jìn)行了命題設(shè)計(jì)。從近年來(lái)的各類試題來(lái)看，試題考查的角度不同，大多數(shù)是關(guān)于細(xì)胞數(shù)量的計(jì)算，也有關(guān)于使用原理和方法的考查，但有的試題明顯與血球計(jì)數(shù)板的實(shí)際使用不相符合。例1 在用血球計(jì)數(shù)板（2mm×2mm方格）對(duì)某一稀釋50倍樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在一個(gè)方格內(nèi)（蓋

10、玻片下的培養(yǎng)液厚度為0.1mm）酵母菌平均數(shù)為16，據(jù)此估算10mL培養(yǎng)液中有酵母菌 個(gè)。（參考答案： 2×107）例2 在“探究培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化”實(shí)驗(yàn)中，某同學(xué)用顯微鏡觀察計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)血球計(jì)數(shù)板的小方格(2 mm×2 mm)內(nèi)酵母菌數(shù)量的平均值為13個(gè)。假設(shè)蓋玻片下的培養(yǎng)液厚度為0.1 mm，那么10mL培養(yǎng)液中酵母菌的個(gè)數(shù)約為A5.2×104 B3.25×105 C5.2×103 D.3.25×104（參考答案：B）解析一：例1例2兩題，均將整個(gè)計(jì)數(shù)室2mm×2mm方格作為實(shí)驗(yàn)計(jì)數(shù)的空間，并按照公式：a/4

11、×105（×稀釋倍數(shù)）來(lái)計(jì)算10mL培養(yǎng)液中的酵母菌的數(shù)量（a為所計(jì)數(shù)酵母菌的平均數(shù)）。與血球計(jì)數(shù)板的實(shí)際操作不相符，特別是例2中將2mm×2mm的計(jì)數(shù)室當(dāng)成一個(gè)小方格了，存在有科學(xué)性錯(cuò)誤。例3 通常用血球計(jì)數(shù)板對(duì)培養(yǎng)液中酵母菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，若計(jì)數(shù)室為1mm×1mm×0.1mm方格，由400個(gè)小方格組成，如果一個(gè)小方格內(nèi)酵母菌過(guò)多，難以計(jì)數(shù)，應(yīng)先 后再計(jì)數(shù)。若多次重復(fù)計(jì)數(shù)后，算得每個(gè)小方格中平均有5個(gè)酵母菌，則10mL該培養(yǎng)液中酵母菌總數(shù)有 個(gè)。（參考答案：稀釋；2×108）解析二：例3設(shè)計(jì)了血球計(jì)數(shù)板的規(guī)格，還考查了血球計(jì)數(shù)板的使用方法

12、，較例1例2更科學(xué)合理。根據(jù)公式：5×400×10000×102×108 。例4 檢測(cè)員將1 mL水樣稀釋10倍后，用抽樣檢測(cè)的方法檢測(cè)每毫升藍(lán)藻的數(shù)量；將蓋玻片放在計(jì)數(shù)室上，用吸管吸取少許培養(yǎng)液使其自行滲入計(jì)數(shù)室，并用濾紙吸去多余液體。已知每個(gè)計(jì)數(shù)室由25×16400個(gè)小格組成，容納液體的總體積為01 mm3。現(xiàn)觀察到圖中該計(jì)數(shù)室所示a、b、c、d、e 5個(gè)中格80個(gè)小格內(nèi)共有藍(lán)藻n個(gè)，則上述水樣中約有藍(lán)藻 個(gè)mL。（參考答案：5n×105 ）解析三：從例4來(lái)看，是按照血球計(jì)數(shù)板的原理進(jìn)行設(shè)計(jì)試題的，還添加了相應(yīng)的圖示，題意一目了然

13、。按照前面所述的公式，不難得出正確答案：酵母細(xì)胞個(gè)數(shù)1mL80個(gè)小方格細(xì)胞總數(shù)/ 80 ×400×10000×稀釋倍數(shù)n/ 80×400×10000×105n×105 。例5（2008江蘇高考31）（4）在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，直接從靜置的培養(yǎng)瓶中取培養(yǎng)原液計(jì)數(shù)的做法是錯(cuò)誤的，正確的方法是 和 。（5）實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用試管刷蘸洗滌劑擦洗血球計(jì)數(shù)板的做法是錯(cuò)誤的，正確的方法是 。（參考答案（4）搖勻培養(yǎng)液后再取樣 培養(yǎng)后期的樣液稀釋后再計(jì)數(shù)（5）浸泡和沖洗）解析四：例5為2008年江蘇省高考試題第31題的第（4）、（5）兩小問(wèn)。試題的

14、設(shè)計(jì)從血球計(jì)數(shù)板的實(shí)驗(yàn)方法入手，需要對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的正誤進(jìn)行判斷，比起以前關(guān)于數(shù)量的計(jì)算的試題，更增強(qiáng)了操作性。實(shí)際上，對(duì)血球計(jì)數(shù)板的使用，不少學(xué)校并沒(méi)有真正做，而是教師講解，學(xué)生死記硬背，造成學(xué)生只知其一，不知其二，這也是導(dǎo)致學(xué)生答題失分的主要原因。綜上所述，通過(guò)對(duì)血球計(jì)數(shù)板的使用和復(fù)習(xí)答題，我真切體會(huì)到，要認(rèn)真對(duì)待新課程中的每一個(gè)實(shí)驗(yàn)。課程標(biāo)準(zhǔn)倡導(dǎo)探究性學(xué)習(xí)，力圖促進(jìn)學(xué)生學(xué)習(xí)方式的變革，引導(dǎo)學(xué)生主動(dòng)參與探究過(guò)程、勤于動(dòng)手和動(dòng)腦，著重培養(yǎng)創(chuàng)新精神和實(shí)踐能力。要發(fā)展學(xué)生的科學(xué)探究能力，對(duì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的操作就顯得尤其必要。所以我們要轉(zhuǎn)變觀念，讓學(xué)生真正做實(shí)驗(yàn)，而不是背實(shí)驗(yàn)。讓學(xué)生在做中領(lǐng)悟?qū)嶒?yàn)的原理，

15、在做中體驗(yàn)實(shí)驗(yàn)的方法，在做中感受實(shí)驗(yàn)的得失，在做中發(fā)展探究的能力，這樣才能真正提高學(xué)生的科學(xué)素養(yǎng)。血球計(jì)數(shù)板使用問(wèn)題血球計(jì)數(shù)板是由一塊比普通載玻片厚的特制玻片制成的.玻片中有四條下凹的槽,構(gòu)成三個(gè)平臺(tái).中間的平臺(tái)較寬,其中間又被一短橫槽隔為兩半,每半邊上面,刻有一個(gè)方格網(wǎng)。方格網(wǎng)上刻有9個(gè)大方格,其中只有中間的一個(gè)大方格為計(jì)數(shù)室,供微生物計(jì)數(shù)用.這一大方格的長(zhǎng)和寬各為1mm,深度為0.1mm,其體積為0.1mm3。計(jì)數(shù)室通常有兩種規(guī)格.一種是大方格內(nèi)分為16中格,每一中格又分為25小格；另一種是大方格內(nèi)分為25中格,每一中格又分為16小格.但是不管計(jì)數(shù)室是哪一種構(gòu)造；它們都有一個(gè)共同的特點(diǎn),即

16、每一大方格都是由16×25=25×16=400個(gè)小方格組成。一、血球計(jì)數(shù)板的使用（以計(jì)數(shù)酵母菌為例）(1)用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)酵母菌懸液的酵母菌個(gè)數(shù)。(2)樣品稀釋的目的是便于酵母菌懸液的計(jì)數(shù),以每小方格內(nèi)含有4-5個(gè)酵母細(xì)胞為宜,一般稀釋10倍即可。(3)將血球計(jì)數(shù)板用擦鏡紙擦凈,在中央的計(jì)數(shù)室上加蓋專用的厚玻片。(4)將稀釋后的酵母菌懸液,用吸管吸取一滴置于蓋玻片的邊緣,使菌液緩緩滲入,多余的菌液用吸水紙吸取,稍待片刻,使酵母菌全部沉降到血球計(jì)數(shù)室內(nèi)。(5)計(jì)數(shù)時(shí),如果使用16格×25格規(guī)格的計(jì)數(shù)室,要按對(duì)角線位,取左上,右上,左下,右下4個(gè)中格(即100個(gè)小格)的酵母菌數(shù)。如果規(guī)格為25格×16格的計(jì)數(shù)板,除了取其4個(gè)對(duì)角方位外,還需再數(shù)中央的一個(gè)中格(即80個(gè)小方格)的酵母菌數(shù)。(6)當(dāng)遇到位于大格線上的酵母菌,一般只計(jì)數(shù)大方格的上方和右方線上的酵母細(xì)胞(或只計(jì)數(shù)下方和左方線上的酵母細(xì)胞)。(7)對(duì)每個(gè)樣品計(jì)數(shù)三次,取其平均值,按下列公式計(jì)算每1ml菌液中所含的酵母菌個(gè)數(shù)。二、計(jì)算公式 (1)16格×25格的