蘋果醋清除DPPH自由基活性成分的研究

1、蘋果醋清除DPP H自由基活性成分的研究張霧紅 ，張永茂，黃玉龍，韓舜愈（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加下研究所，甘肅蘭州 730070) 摘要:以蘋果、酵母菌和醋酸菌為試驗(yàn)材料，采用小同的發(fā)酵下藝，對(duì)4種蘋果醋樣品進(jìn)行抗氧化活性成分分析和DPPH自由基清除率的測(cè)定,研究其主要活性成分含量與DPPH自由基清除率之間的相關(guān)性。結(jié)果表明:蘋果醋具有較高的抗氧化活性成分和較強(qiáng)的抗氧化能力，其中固態(tài)發(fā)酵蘋果醋中總酚、總黃酮含量分別達(dá)到2.14，2. 19 mg/mL;當(dāng)加入質(zhì)量濃度200 µg/mL蘋果醋時(shí)，DPPH自由基清除率達(dá)

2、92.37%，總酚、總黃酮含量和DPPH自由基清除率之間有較高的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0. 875 8,0.872 3。 關(guān)鍵詞:蘋果醋: DPPH自由基:活性成分DPPH free radicals scavenging activity by apple cider vinegarZHANG Ji-hong, ZHANG Yong-mao, HUANG Yu-long, HAN Shun-yu(1.College of Food Science and Engineering, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China;2.A

3、gricultural Product Storage and Processing Institute, Gansu Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730070,China) Abstract: Antioxidant activity component and DPPH free radicals scavenging active were studied by four kinds of apple cider vinegar samples of the different fermentation process. The r

4、esults showed that apple cider vinegar had a higher antioxidant activity; the contents of total phenol, flavones were 2. 14mg/mL,2.19mg/mL in solid-state fermentation apple cider vinegar, respectively.DPPH free radicals scavenging reached 92.37%when the concentration of apple cider vinegar was 200&#

5、181;g/mL. There were significant relationships between the contents of total phenol, total flavones and DPPH free radicals scavenging. The correlation coefficients were 0.8758 and 0.8723.Key words: apple cider vinegar; DPPH free radicals; active ingredient 蘋果醋(apple cider vinegar)是以蘋果為主要原料，經(jīng)二次發(fā)酵(酒精發(fā)

6、酵、醋酸發(fā)酵)制成的具有酯香和果香味的醋，含有豐富的營養(yǎng)成分，具有獨(dú)特的藥理作用.己有研究表明，蘋果醋具有抗菌、抗疲勞、調(diào)節(jié)血糖、調(diào)節(jié)血壓、促進(jìn)食欲、促進(jìn)鈣吸收、預(yù)防骨質(zhì)疏松、動(dòng)脈硬化等作用1-2。日前關(guān)于食醋的抗氧化性研究有所報(bào)道，日木學(xué)者對(duì)日木黑醋研究表明，體外試驗(yàn)乙酸乙酯萃取物具有較高的抗氧化活性3，徐清萍等研究報(bào)道，鎮(zhèn)江香醋中的抗氧化活性成分有酚類、黃酮、氨基酸、有機(jī)酸、蛋白黑素，總酚含量、總黃酮含量、DPPH自由基潔除活性可作為不同種食醋的鑒別指標(biāo)之一4-5。近年來，隨著人們對(duì)蘋果醋關(guān)注度的提高，關(guān)于其發(fā)酵工藝和風(fēng)味物質(zhì)的研究較多，而關(guān)于蘋果醋中的抗氧化性能研究尚末見報(bào)道。蘋果醋中含

7、有天然抗氧化劑酚類、黃酮類、VC、氨基酸等物質(zhì)6。為探求它們的含量與其抗氧化性之間的相關(guān)性，本試驗(yàn)以不同工藝制作的蘋果醋為樣品測(cè)定了蘋果醋中總酚、總黃酮含量及對(duì)DPPH自由基的清除作用，初步了解了蘋果醋中的抗氧化物質(zhì)及抗氧化性能，以期為蘋果醋產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)研究提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料與儀器試驗(yàn)用蘋果為甘肅天水紅富士； 酵母菌(CICC菌株編號(hào)1383、1751)、醋酸菌(CICC菌株編號(hào)20064、20056)購于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；1,1-二苯基-2-三硝基苯冊(cè)(DPPH)購自日木W(wǎng)ako工業(yè)株式會(huì)社；福林酚試劑購自北京拜爾迪公司；蘆丁(標(biāo)品)、抗壞血酸、2,6

8、-二氯酚靛酚鈉鹽等試劑均為國產(chǎn)分析純。 Cary100型紫外可見分光光度計(jì)購自美國瓦里安公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋購自上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BS224S型電子分析天購自德國賽多利斯公司;HA-3158型榨汁機(jī)。1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 蘋果醋樣品的制備 分別以天水紅富士鮮榨果汁、濃縮果汁及汁、渣混合物為原料，調(diào)整糖度為12.2°進(jìn)行不同菌種的酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵。酒精發(fā)酵溫度27，接種量8%，醋酸發(fā)酵溫度32，接種量10%，發(fā)酵15d,得4種蘋果醋樣品，樣品色澤淡黃無差異，取上清液，濾紙過濾后備用。樣品見表1(總酸含量以蘋果酸計(jì))。表1 蘋果醋樣品Tab.1 The sa

9、mples of apple cider vinegar 樣品 原料 發(fā)酵方式 菌 種 總酸含量（g·(100mL)¹）蘋果醋1 鮮榨果汁 液態(tài) 酵母菌1383 酵母菌20064 3.86蘋果醋2 鮮榨果汁 液態(tài) 酵母菌1383 酵母菌20064 3.58 蘋果錯(cuò)3 鮮榨果汁 液態(tài) 酵母菌1751 酵母菌20056 3.64蘋果醋4 果汁、渣 固態(tài) 酵母菌1383 酵母菌20064 4.03總酚測(cè)定 采用Folin-ciocalteu法測(cè)定總酚含量7。精確稱取沒食子酸10mg，用蒸餾水定容至100mL，質(zhì)量濃度為0.1mg/mL，準(zhǔn)確吸取此溶液0.50,0.75,1.00,

10、1.25,1.50,1.75mL分別置于25mL具塞試管中,分別加1.25mL福林-酚試劑，再分別加入3.75mL 20%的Na2CO3溶液,定容至25mL,于30反應(yīng)2h，以不加樣品為空白對(duì)照。在其最大吸收波長765 nm下測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為:y=0.0992x一0.1142， R2 =0.9995。 樣品含量測(cè)定:精確吸取適量濃度的供試樣品溶液3份,每份1mL置于25 mL容量瓶中,按上述試驗(yàn)方法分別測(cè)吸光度值(A)，計(jì)算其含量。總黃酮測(cè)定 精確稱取蘆丁標(biāo)品20mg，用蒸餾水定容至100 mL，質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL，準(zhǔn)確吸取此溶液0.0, 2.0, 4.0, 6.

11、0, 8.0, 10.0,12.0 mL，分別置于50mL容量瓶中，各加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇至20mL,加5% Na2CO3溶液2.0mL，搖勻放置6min；加10%Al(NO3)3溶液2.0mL，搖勻放置6min；加1.0mol/LNaOH溶液4.0Ml,加水至容量瓶刻度，搖勻放置15min,以不加蘆丁對(duì)照品溶液為空白。在掃描確定波長510nm下測(cè)吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為:y=0.0112x0.010 7, R2=0.9999。 樣品含量測(cè)定:精確吸取適量濃度的供試樣品溶液3份，每份1mL置于50 mL容量瓶中,按上述試驗(yàn)方法分別測(cè)吸光度值(A)，計(jì)算其含量。 抗氧化性測(cè)定.1

12、DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線制作準(zhǔn)確稱取50mg DPPH，用無水乙醇溶解并定容于250mL容量瓶中，得0.5 mmol/L DPPH母液mL,取DPPH母液40mL,用無水乙醇定容至100mL,得0.2 mmol/L DPPH溶液,用乙醇稀釋至0.02 ,0.04,0.06,0.08,0.10 mmol/L，在掃描確定波長517nm處分別測(cè)定吸光度。以含量對(duì)吸光度(A)進(jìn)行直線回歸，得回歸方程y=10. 218x+0.0011, R2=0.9999。.2蘋果醋清除DPPH自由基活性的測(cè)定分別取0,50,100,150,200,400,600µg/mL蘋果醋,定容至2mL,再加0.2 mm

13、ol/L DPPH溶液2 mL,搖勻，30 min后用無水乙醇作參比于517 nm處分別測(cè)定吸光度，同時(shí)用溶劑乙醇作參比測(cè)定其吸光度A，按照下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率，清除率越大說明抗氧化能力越強(qiáng)。 DPPH·剩余率(%)= CDPPH./C。 清除率(%)=1DPPH·剩余率式中，CDPPH.為t時(shí)刻體系中DPPH·的濃度；C。為DPPH·的初始濃度，此處為空白溶劑參比值。.3 DPPH自由基的EC50值DPPH自由基在初始濃度50%時(shí)所需抗氧化劑的最小量(EC50)，根據(jù)不同濃度抗氧化劑的剩余率用OriginPro8.0作曲線求出。2結(jié)果與分析

14、2.1蘋果醋的抗氧化活性成分蘋果醋功能性成分主要是有機(jī)酸、酚類、黃酮類等物質(zhì)，有機(jī)酸主要以醋酸為主通過參與機(jī)體代謝發(fā)揮調(diào)節(jié)功能，多酚類物質(zhì)大多具有數(shù)量不等的酚羥基，可以作為氫供體，使自由基還原，從而達(dá)到清除目的，黃酮類物質(zhì)清除自由基的機(jī)理在于阻止自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的階段，與脂質(zhì)過氧反應(yīng)即阻止脂質(zhì)過氧化過程，多酚類、黃酮類物質(zhì)作為天然有效的自由基清除劑（清除羥基自由基、超氧自由基等）都具有抗氧化性。蘋果醋中的多酚、黃酮類物質(zhì)來源于蘋果原料，其含量的高低受釀造過程影響，故不同種類蘋果醋中的總酚、總黃酮含量存在差異（表2）。由表2可以看出不同種類蘋果醋中抗氧化物質(zhì)成分含量差異較大，其中蘋果醋4中的總酚

15、、總黃酮含量較高，蘋果醋2中的總酚黃酮含量較少。說明蘋果醋釀造過程中原料的處理方式，發(fā)酵狀態(tài)及菌種選擇都對(duì)產(chǎn)品中天然抗氧化活性成分總酚、總黃酮含量有較大影響。2.2蘋果醋與DPPH自由基清除活性的關(guān)系DPPH自由基是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基,在可見光區(qū)最大吸收峰為517nm，其乙醇溶液呈深紫色，當(dāng)與蘋果醋中天然自由基清除劑接觸時(shí)，由于與其單電子配對(duì)使其吸收逐漸消失，其褪色程度與接受的電子數(shù)成定量關(guān)系。因而可用分光光度法進(jìn)行定量分析，檢測(cè)自由基清除情況，從而評(píng)價(jià)蘋果醋的抗氧化能力。蘋果醋抗氧化能力用DPPH自由基清除率來表示，清除率越大，抗氧化能力越強(qiáng)。由圖1可以看出，不同種類的蘋果醋都具有較強(qiáng)的抗

16、氧化能力，但對(duì)DPPH自由基的清除作用有明顯差異。隨著蘋果醋加入量的增加，對(duì)DPPH自由基的清除率也增大，說明在一定范圍內(nèi)蘋果醋清除自由基的能力與其質(zhì)量濃度呈明顯的量效關(guān)系,當(dāng)加入質(zhì)量濃度為25µg/mL的蘋果醋時(shí)，各個(gè)樣品清除率差異不大，當(dāng)加入質(zhì)量濃度為200µg/mL的蘋果醋時(shí)，清除率差異明顯加大，蘋果醋4對(duì)DPPH自由基清除率相對(duì)較大，蘋果醋2對(duì)DPPH自由基清除率相對(duì)較小。2.3蘋果醋清除DPPH自由基的EC50值比較將反應(yīng)平衡時(shí)所對(duì)應(yīng)的蘋果醋與DPPH自由基濃度比值作曲線，可得DPPH自由基在初始濃度50%時(shí)所需抗氧化劑的最小量（EC50）。以1/ EC50表示蘋

17、果醋清除自由基能力（antiradical power, APR）,APR值越大則抗氧化能力越強(qiáng)(表3)。由表3可以看出，不同種類蘋果醋抗氧化能力有明顯差異，其抗氧化能力大小順序?yàn)樘O果醋4蘋果醋3蘋果醋1蘋果醋2，說明發(fā)酵過程對(duì)蘋果醋的抗氧化能力影響較大，其中發(fā)酵狀態(tài)對(duì)蘋果醋抗氧化能力的影響大于原料差異和菌種差異。2.4 不同種類蘋果醋抗氧化活性成分含量與DPPH自由基清除活性的關(guān)系以上種蘋果醋在相同濃度下測(cè)其總酚含量、黃酮含量與DPPH自由基清除率的相關(guān)性（圖2、圖3）。由圖2和圖3可以看出，不同蘋果醋樣品對(duì)DPPH自由基清除率與樣品中含有的總酚、總黃酮濃度呈正相關(guān)性，樣品中總酚、總黃酮含量

18、越高，對(duì)DPPH自由基清除活性越強(qiáng)不同蘋果醋樣品對(duì)DPPH自由基清除率與蘋果醋中總酚、總黃酮含量相關(guān)性曲線線性回歸方程分別為：17.424x13.603，16.985x13.104，相關(guān)系數(shù)分別為0.8785、0.8723，說明蘋果醋的抗氧化能力與總酚含量和總黃酮含量有較高的相關(guān)性，總酚含量和總黃酮含量可以作為蘋果醋的抗氧化活性評(píng)價(jià)指標(biāo)。3結(jié)論通過對(duì)不同蘋果醋中總酚、總黃酮含量和DPPH自由基清除率的測(cè)定表明，蘋果醋中含有較高的抗氧化活性成分多酚、黃酮類化合物，對(duì)DPPH自由基有較高的清除作用，其抗氧化能力與總酚、總黃酮含量之間存在較高的相關(guān)性，總酚、總黃酮含量可作為蘋果醋抗氧化能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)。不同種類蘋果醋的抗氧化能力有明顯差異，抗氧化能力大小順序?yàn)椋禾O果醋4蘋果醋3蘋果醋1蘋果醋2，說明原料、菌種、發(fā)酵狀態(tài)對(duì)其影響較大，其中固態(tài)發(fā)酵對(duì)蘋果醋抗氧化能力的影響大于液態(tài)發(fā)酵，原料差異對(duì)蘋果醋抗氧化能力的影響大于菌種差異，由此可見，通過原料和釀造工藝的控制可調(diào)整蘋果醋的抗氧化能力，多酚、黃酮類化合物含量及它們對(duì)DPPH自由基清除活性可作為蘋果醋的質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)