Hsp163蛋白純化分析中文

1、暑期實驗生化部分一 實驗目的1了解基本的分離提純蛋白質的原理方法和技術。2提取分子和微生物實驗中自制重組細菌產(chǎn)生的蛋白質HSP16.3。3測定HSP16.3的分子活性，了解其分子伴侶活性及寡聚結構。4提純和檢測Tag酶蛋白。二 背景介紹1HSP16.3HSP16.3是來自結核桿菌M.tuberculosis的小分子量熱休克蛋白(430bp)。HSP16.3在正常條件下僅有少量表達，當M.tuberculosis從對數(shù)期到穩(wěn)定期的轉變中顯著表達，并成為細胞內的主要蛋白。另外，HSP16.3還是M.tuberculosis很強的抗原性蛋白，是T，B細胞發(fā)生免疫反應的重要靶點。體外實驗表明，HSP1

2、6.3具有分子伴侶的活性，HSP16.3在39.5時可以抑制檸檬酸合成酶的熱聚集，且其活性不依賴于ATP，但不能保護檸檬酸合成酶的活性，說明HSP16.3是與部分去折疊的檸檬酸合成酶發(fā)生作用，體內蛋白的再折疊可能還需要其它蛋白參與。通過凝膠層析還可分離出HSP16.3與檸檬酸合成酶形成的復合物，并在隨后的SDS-PAGE中得到證實。HSP16.3可能是通過暴露疏水表面來行使其分子伴侶活性的。實驗表明：HSP16.3在較溫和溫度和低濃度變性劑誘導下，如極低濃度的鹽酸胍（0.05 M），尿素（0.3 M）或30的溫度處理時，會暴露疏水表面使得其分子伴侶活力迅速上升。HSP16.3是144個氨基酸組

3、成的，分子量為16277Da ，其序列分析結果表明它屬于a-crystalline相關的小分子量熱休克蛋白（sHSP）家族的一員，具有a-crystalline蛋白家族典型的C末端保守序列：D/N-G-V-L-T-T/V-X-V/A。小分子量熱休克蛋白（small heat shock protein, sHSP）家族的蛋白具有多種不同的生物學功能，但都具有分子伴侶的活性，能與變性的蛋白質底物作用并不依賴于ATP參與。這一類蛋白的結構研究表明它們往往通過形成特定的寡聚結構來發(fā)揮功能，如M.Janneschii HSP16.5形成二十四聚體，小麥HSP16.9形成十二聚體。HSP16.3是迄今為

4、止發(fā)現(xiàn)的幾種原核生物的sHSP之一，目前，對sHSP功能，作用機制了解還很少。2Tag酶三 實驗原理1、超聲波處理法破碎細菌借助超聲波的震動力破碎細胞壁和細胞器。處理的效果與樣品濃度和使用頻率有關。破碎微生物細菌和酵母菌時時間要稍長，使用時應注意降溫防止過熱。2、 Ni-NTA親和層析（Ni-NTA Affinity Chromatography） （1）金屬螯合親和層析 金屬螯合親和層析介質上偶聯(lián)的配基亞氨基二乙酸鈉（IDA），在偏堿的環(huán)境中容易于二價金屬離子如Zn2，Cu2，Ni2發(fā)生可逆螯合吸附，二價金屬離子又與流動相中的半胱氨酸、組氨酸、咪唑等物質發(fā)生可逆性的螯合吸附。金屬離子在螯合介

5、質與分離分子間起著橋梁的作用，金屬離子一端與螯合介質連接，另一端與被分離組分結合。這兩種結合方式都是可逆的，可以根據(jù)需要從不同結合部分解析下來。例如，以EDTA為洗脫劑可以從金屬離子與螯合介質的結合部位洗脫下來，以咪唑為洗脫劑可以從金屬離子與被分離分子的結合部位洗脫下來，利用這一特性可以分離不同用途的蛋白質。 （2）NiIDA和NiNTA IDA只有三個金屬螯合位點，與金屬離子結合并不緊密，由此導致最后純化產(chǎn)物不純等問題。而NiNTA中，NTA是一個四配位基的螯合劑，可以與鎳離子六個配位基中的四個螯合，鎳離子剩下的兩個配位基則與目標蛋白六個組氨酸殘基（6x His tag）結合，在較高強度的洗

6、脫條件下，仍保持良好的結合力。半胱氨酸和色氨酸也能與固定金屬離子產(chǎn)生結合作用，但這種結合力要遠小于組氨酸殘基與金屬離子的結合力。圖1 不同的配基與鎳離子的螯合 （左）Ni氨三乙酸配合物，NTA與鎳離子中四個配位基結合，結合更緊密； （右）Ni亞氨二乙酸配合物，IDA與鎳離子的三個配位基結合。3、紫外吸收法測蛋白質含量蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，使蛋白質具有吸收紫外光的性質。吸收高峰在280nm處，其吸光度（即光密度值）與蛋白質含量成正比。此外，蛋白質溶液在238nm的光吸收值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質溶液的光吸收值與蛋白質濃度的正比關系，可以進行

7、蛋白質含量的測定。4. 透析（Dialysis）經(jīng)由半透膜的兩端及透析液中的分子，經(jīng)濃度的差異而互柤產(chǎn)生自由擴散(Diffusion)的現(xiàn)象叫作透析作用。 通常將半透膜制成袋狀，將生物大分子溶液置入袋內，將此透析袋浸入水或緩沖液中，樣品溶液中的大分子量的生物大分子被截留在袋內，而鹽和小分子物質不斷擴散透析到袋外，直到袋內外兩邊的濃度達到平衡為止。透析技術可用于除鹽、除生物小分子雜質和濃縮樣品。透析的動力是擴散壓，擴散壓由跨膜兩邊的濃度梯度形成的。透析的速度正比于膜的厚度，正比于欲透析的小分子溶質在膜內外兩邊的濃度梯度，還正比于膜的面積和溫度，通常是4透析，升高溫度可加快透析速度。5、SDSpa

8、geSDS聚丙烯酰胺凝膠電泳是最常用的定性分析蛋白質的電泳方法，特別是用于蛋白質純度檢測和測定蛋白質分子量。SDS即十二烷基磺酸鈉（CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+），是一種陰離子表面活性劑即去污劑，它可以斷開分子內和分子間的氫鍵，破壞蛋白質分子的二級和三級結構，強還原劑b-巰基乙醇可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵，破壞蛋白質的四級結構。電泳樣品加入樣品處理液后，要在沸水浴中煮35 min，使SDS與蛋白質充分結合，以使蛋白質完全變性和解聚，并形成棒狀結構。SDS與蛋白質結合后使蛋白質SDS復合物上帶有大量的負電荷，平均每兩個氨基酸殘基結合一個SDS分子，這時各種蛋白質分子本身

9、的電荷完全被SDS掩蓋。這樣就消除了各種蛋白質本身電荷上的差異。樣品處理液中通常還加入溴酚藍染料，用于控制電泳過程。另外樣品處理液中也可加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳還可以用于未知蛋白分子量的測定，在同一凝膠上對一系列已知分子量的標準蛋白及未知蛋白進行電泳，測定各個的標準蛋白的電泳距離（或遷移率），并對各自分子量的對數(shù)（log Mr）作圖，即得到標準曲線。測定未知蛋白質的電泳距離（或遷移率），通過標準曲線就可以求出未知蛋白的分子量。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)常應用于提純過程中純度的檢測，純化的蛋白質通常在SDS電泳上應只有一條

10、帶，但如果蛋白質是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應于各個亞基的幾條帶。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克量級的蛋白質，而且通過電泳還可以同時得到關于分子量的情況，這些信息對于了解未知蛋白及設計提純過程都是非常重要的。6 天然聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native Gel） 天然聚丙烯酰胺電泳，是指未加SDS，也未經(jīng)強還原劑如DDT和巰基乙醇處理的天然聚丙烯酰胺凝膠電泳。目的是為了使生物大分子在電泳過程中保持其天然的形狀和電荷。利用蛋白質分子中帶有凈電荷的數(shù)目差異，以及分子質量、形狀不同，在電場中泳動的速度和方向有區(qū)別，從而達到分離的目的。在電泳分離后仍能保持

11、蛋白質和酶等生物大分子的生物活性。 與其他方法相比，Native Gel電泳分辨率較低，使用合適濃度和孔徑的凝膠、有足夠長度的凝膠、小體積加樣等方法，可提高分辨率。四、材料、儀器與步驟1. 細胞收集和破碎 材料：經(jīng)誘導表達目的蛋白（HSP16.3）的大腸桿菌 設備：大型低溫離心機，高速低溫離心機，細胞超聲破碎儀，4/-20冰箱 試劑：Buffer A（25mmol/L TrisHCl,，0.15mol/L NaCl，pH 8.0） 實驗步驟：（1） 將150ml菌液(經(jīng)誘導表達目的蛋白的大腸桿菌)轉入大離心瓶中（2tubes/組），離心收菌，5000rpm，10min, 4oC（留沉淀）；（2

12、） 配制Buffer A緩沖液：配制時先分別加入4.31gTris.HCl和1.51gNaCl，用去離子水定容至500ml，HCl調pH值至8.0，配制成終濃度為25mmol/L TrisHCl,，0.15mol/L NaCl，pH 8.0的溶液。（3） 倒掉上清，將離心管中的菌體沉淀懸于40 ml Buffer A緩沖液（pET系統(tǒng)用Buffer A，25mmol/L TrisHCl, 150mmol/L NaCl，pH 8.0），再移至小燒杯中；（4） 超聲破碎細菌(冰浴) ：工作功率 400KW, 工作5秒, 停止5秒, 每次50個循環(huán), 共3次，每次間歇12min；超聲注意事項：* 盛

13、裝菌液的小燒杯要放在冰盒底部，防止超聲過程中冰融后燒杯移位；* 探頭要距離燒杯底部有一定距離，大約5mm，但又不能離底部過遠；* 探頭一定要插入液體內方能開機，嚴緊空載開機；工作時鉆頭要在液面中間，保證超聲效果；* 超聲過程中冰會融化，應及時添加冰。* 所用超聲機適合破碎30ml以上的溶液；* 基本參數(shù)都已設定，不要隨便修改已設定好的參數(shù)，開機后只需調整功率輸出旋鈕，把輸出功率調整到200W左右；一般情況下工作功率設定在200W左右即可，但由于本作超聲機鉆頭較細，加大功率至300W；* 在使用中出現(xiàn)的問題應及時通知老師；* 超聲破碎后，要用去離子水再超聲五次，擦干探頭，防止殘留菌液結垢。（4）

14、 將破菌產(chǎn)物離心，12000rpm，30min, 4oC；（5） 留上清，沉淀溶于30ul的buffer A中，4冰箱保存，分別對上清和沉淀留樣，通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳, 鑒定表達情況和蛋白可溶情況。2. NiNTA親和層析蛋白 材料：高速離心得到的蛋白上清，Ni-NTA介質設備：制冰機，4/-20冰箱，親和層析柱，電磁攪拌器，紫外分光光度計 試劑： Buffer A(25mmol/L TrisHCl,，0.15mol/L NaCl，pH 8.0) 1mol/L咪唑溶液50mmol/L NiSO4洗脫液1（20mM咪唑）： 在20ml的buffer A中加入400l 1mol/L咪唑，

15、配成終濃度為25mmol/L Tris.HCl，150mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH8.0的溶液； 洗脫液2（200mM咪唑）： 在16ml的buffer A中加入4ml 1mol/L咪唑， 配成終濃度為25mmol/L Tris.HCl，150mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH8.0的溶液。實驗步驟： （1） 處理介質：向柱中加入1ml NTA介質后，按下列順序清洗和處理層析柱： 去離子水（3柱體積，約20ml） Buffer A（10ml）平衡介質。（2） 加入蛋白樣品： 加入40ml超聲破菌后的蛋白上清樣品（保留穿過液），手動加液，最后保留30l穿過液

16、樣品用作SDSPAGE檢測。 （3） 洗脫雜蛋白： 用10ml buffer A洗脫介質。 將柱用buffer A裝滿后放入4冰箱過夜。（4） 洗脫目標蛋白：用20ml洗脫液1（20mM咪唑）洗脫介質，保留30l穿過液樣品用作SDSPAGE檢測；用20ml洗脫液4（200mM咪唑）洗脫介質，手動收集，每管1ml。以buffer A為參比，測量上述三次洗脫收集的洗脫液的OD280。（5） NTANi2瓊脂糖再生： 10ml 1M咪唑 20ml去離子水 10ml 50mM NiSO4 10ml 20 乙醇 加入20乙醇，封口，4保存。 3. 透析 材料：固體NaH2PO4，透析袋，OD280峰值處

17、的洗脫液樣品（本組由于沒有得到目標蛋白，用的是9-2組的。）實驗步驟：（1） 配制透析緩沖液：用NaH2PO4和Na2HPO4配置1L，pH7.0的透析液（兩組共用透析液）。 （2） 準備透析袋：將透析袋剪切成適當長度（1020厘米），在蒸餾水中煮10分鐘，冷卻后儲放在水中。（老師準備好） （3） 透析：透析袋涼至室溫，中間打結或系皮筋，用滴管向透析袋中加入OD280值最高一管樣品約1ml，兩端封口，放入透析液中過夜。注意事項： l 透析袋中加入蛋白樣品的量最好為一半體積，因為透析時袋外液體受滲透壓進入袋內，使透析袋膨脹；l 為避免透析袋漲破，不宜加入過多樣品，實際上加了約0.5ml。 4.

18、Cross Linking 材料：經(jīng)透析的樣品 設備：微量恒溫器 試劑：Special sample buffer（含4戊二醛，終濃度1），0.1M TrisHCl，pH 7.0 實驗步驟： 取30l透析樣品，加入15l special sample buffer,在室溫放置20min，再加5l 0.1M TrisHCl停止交聯(lián)(stop)，pH7。5. SDSPAGE 材料：前面實驗所留的樣，包括破菌上清樣品，破菌沉淀樣品，掛柱穿過樣品，透析交聯(lián)樣品，不同濃度咪唑洗脫液洗脫蛋白回收樣品。 蛋白電泳marker 設備：蛋白電泳儀等電泳設備，Pipette，微量恒溫器（用于樣品處理），電磁攪拌器

19、 試劑：A液（Lower buffer）： 18.17g Tris 0.4g SDS, pH 8.8 (HCl) 加H2O到100ml (1.5M Tris-HCl buffer) B液（Upper buffer）： 6.06g Tris 0.4g SDS, pH 6.8 (HCl) 加H2O到100ml (0.5M Tris-HCl buffer) C液（30% 丙稀酰胺）： 30g 丙稀酰胺（acrylamide） 0.8g N,N-亞甲雙丙烯酰胺(Bisacrylamide) 加水到100ml D液（10%過硫酸銨）(fresh)：0.1g ammonium persulfate，加H2

20、O到 1ml。 樣品處理液1sample buffer：50mM Tris-HCl(pH 6.8) 100mM DTT(or 5% Mercaptoethanol) 2% SDS 0.1% 溴酚藍(Bromophenol blue) 10% 甘油(Glycerol) Tris-甘氨酸電泳緩沖液：0.025mol/L Tris 0.25mol/L 甘氨酸（pH為8.3） 0.1% SDS 染色液：0.25g考馬斯亮藍R-250溶于50ml甲醇中, 加入8ml乙酸和42ml H2O定容至100ml。 脫色液：30% 乙醇，10% 乙酸, 加H2O定容至1000ml。 實驗步驟：（1） SDS聚丙烯

21、酰胺凝膠的灌制：根據(jù)廠家說明書安裝玻璃板，在高玻璃上做好刻度線，玻璃板矮面朝外。 確定所需凝膠溶液體積，按下表給出的數(shù)值在一小燒杯中按所需丙烯酰胺濃度配制定體積的分離膠溶液。依次混合各成分。一旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應立即快速旋動混合物并進入下步操作。 配制分離膠（15% running gel）：A4.5mlC9mlH2O7.4mlTEMED0.02mlD(fresh)0.07mlTotal18mlTEMED or D was added last.（2） 迅速在兩玻璃板的間隙中灌注丙烯酰胺溶液，至刻度線高度，留出灌注積層膠所需空間(梳子的齒長，再加1cm)。用注射器小心地在丙烯酰

22、胺溶液上覆蓋一層水（水封）。將凝膠垂直放置于室溫下。 （3） 分離膠聚合完全后(1520min)，傾出覆蓋層液體，用紙巾的邊線吸凈殘留液。（4） 按下法制備積層膠：按下表給出的數(shù)據(jù)在另一個小燒杯里制備一定體積及一定濃度的丙烯酰胺溶液，依次混合各成分。旦加入TEMED，馬上開始聚合，故應立即快速旋動混合物并進入下一步操作。在已聚合的分離膠上直接灌注積層膠，立即在積層膠溶液中插入干凈的Teflon梳子。小心避免混入氣泡，再加入積層膠溶液以充滿梳子之間的空隙，將凝膠垂直放置于室溫下。 配制積層膠（3% running gel）：B2.0mlC0.8mlH2O5.2mlTEMED0.01mlD(fre

23、sh)0.04mlTotal8.05mlTEMED or D was added last.（5） 蛋白電泳樣品處理：將10l 1sample buffer 加入10l洗脫蛋白樣品中，在100加熱5分鐘，以使蛋白變性。標準蛋白Marker也在100中加熱5min。 （6） 電泳：積層膠聚合完全后，小心移出梳子，將玻璃板間的膠帶去掉，玻璃板高面朝外，固定于電泳裝置上，上、下槽各加入Tris甘氨酸電泳緩沖液。必須設法排出凝膠底部兩玻璃板之間的氣泡。按預定順序加樣，每樣品加20l，使用專用的上樣槍頭，每加完一個樣品在下槽緩沖液中洗滌加樣注射器。 將電泳裝置與電源相接(正極應接下槽)，調節(jié)電壓為200

24、V。至溴酚藍到達分離膠底部，然后關閉電源。從電泳裝置上卸下玻璃板，放在紙巾上，用小鋼尺把膠刮下來。 （7） 用考馬斯亮藍對SDS聚丙烯酰胺凝膠進行染色：考馬斯亮藍R250是一種三苯甲烷紡織染料?？蓪⒛z放在這一染料的甲醇乙酸濃溶液中浸泡數(shù)小時，然后經(jīng)過長時間的脫色而使過量染料從凝膠上擴散出去。用至少5倍體積的染液浸泡凝膠，放在平緩搖動的平臺上于室溫染色2小時。 （8） 脫色，觀察結果：倒出染色液，將凝膠浸泡于不加染料的甲醇乙酸溶液中，平緩搖動48小時，其間應更換脫色液三四次。 6. Native Gel 材料：不同濃度咪唑洗脫液洗脫蛋白回收樣品，透析樣品，標準蛋白Marker，BSA 設備：蛋

25、白電泳儀等電泳設備，Pipette，冰盒 試劑： A液（Lower buffer）： 18.17g Tris，pH 8.8 (HCl) 加H2O到100ml (1.5M Tris-HCl buffer) B液（Upper buffer）： 6.06g Tris，pH 6.8 (HCl) 加H2O到100ml (0.5M Tris-HCl buffer) C液（30% 丙稀酰胺）： 30g 丙稀酰胺（acrylamide） 0.8g N,N-亞甲雙丙烯酰胺(Bisacrylamide) 加水到100ml D液（10%過硫酸銨）(fresh)：0.1g ammonium persulfate，加H

26、2O到 1ml。 樣品處理液sample buffer：0.1M Tris-HCl(pH 6.8) 0.2% 溴酚藍(Bromophenol blue)，2mg 20% 甘油(Glycerol) Tris-甘氨酸電泳緩沖液：0.025mol/L Tris 0.25mol/L 甘氨酸（pH為8.3）BSA牛血清白蛋白： 1mg BSA溶于1ml去離子水中。*注： native gel的試劑里不含任何的SDS或者DDT等還原性強的試劑。 實驗步驟：基本和SDSPAGE操作一樣，但是有下列幾點不同： （1） 分離膠配制濃度為7.5，而不是15，濃縮膠配方一樣。配制分離膠（7.5% running g

27、el）：A4.5mlC4.5mlH2O8.9mlTEMED0.02mlD(fresh)0.07mlTotal18mlTEMED or D was added last.（2） 蛋白樣品處理：取15l蛋白樣品加入5l的3sample buffer，混勻，不用加熱，直接上樣。 7. 測活 材料：目標蛋白濃度最高的一管樣品設備：紫外分光光度計，pipette，微量恒溫器 試劑：緩沖液（0.05M Na2HPO4，0.1M NaCl，pH7.0），1M DTT，2.5mg/ml 胰島素（insulin）實驗步驟：1. 按照下表設計，依次加入各種試劑（最后加insulin），每一個體系終體積為1 ml。

28、測活參比液：0.05M Na2HPO4760ul0.1M NaCl (pH 7.0)1M DTT80ulInsulin(2.5mg/ml)200ul2. 以緩沖液（0.05mol/L Na2HPO4，0.1M NaCl，pH7.0）為空白, 測反應物在360nm處的濁度，以檢測胰島素的聚集。每組測14min，每10s記一個數(shù)據(jù)。3. 按照下表加入試劑進行測活。測活樣品液：0.05M Na2HPO4740ul0.1M NaCl (pH 7.0)Protein sample20ul1M DTT80ulInsulin(2.5mg/ml)200ul4. 以緩沖液（0.05mol/L Na2HPO4，0

29、.1M NaCl，pH7.0）為空白, 測反應物在360nm處的濁度，以檢測胰島素的聚集。每組測14min，每10s記一個數(shù)據(jù)。五結果與討論1目的蛋白的洗脫曲線用Buffer A+200mM咪唑(25mmol/L TrisHCl, 0.15mol/L NaCl，200mmol/L 咪唑，pH 8.0)洗脫目標蛋白收集組分，測OD280數(shù)據(jù)，見表1。由此數(shù)據(jù)作圖，見圖2。表一、200mM咪唑洗脫的各管的OD280值管數(shù)OD28010.36520.66930.64340.53350.47360.38670.37680.326圖2、200mM咪唑洗脫的各管的OD280 用緩沖液B(25mmol/L

30、TrisHCl, 0.15mol/L NaCl，200mmol/L 咪唑，pH 8.0)為空白對照，各管收集組分在紫外分光光度計上測定吸光度OD280，以OD280為縱座標，收集組分按順序為橫座標作圖，可以從圖中直接得出第2管蛋白洗脫量最多即蛋白濃度最高。從OD280的數(shù)據(jù)可以看出，各管的OD280都在0.7以內，并不太高。鑒于我們是直接取用的發(fā)酵罐的菌液，而且之前的實驗結果顯示我們的細菌濃度較高，所以我們測OD280前共對樣品稀釋了16倍。綜合考慮稀釋倍數(shù)，我們的數(shù)據(jù)結果就和別組同學的數(shù)據(jù)結果差不多了。在洗脫的過程中我們遇到最大的問題就是洗脫的速度特別的慢，從一開始用水洗柱子的時候速度就比別組慢，后來助教說是因為我們的柱子裝的太緊。有時候慢到20多秒一滴，我們就不得不在助教的幫助下把柱子弄松。我們猜測柱子的問題不僅僅是影響了實驗進度，對洗脫效果也會有一定影響，比如洗脫的各管的OD280峰就不突出，不過對后面的實驗還不至于產(chǎn)生大的影響。2SDSPAGE凝膠電泳結果第一塊膠孔號12345678樣品MarkerCross-link(ours)Cross-link conrolboiledCross-link(別組的)Cro