茯苓的搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵和發(fā)酵罐補(bǔ)料液體發(fā)酵

1、茯苓的搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵和發(fā)酵罐補(bǔ)料液體發(fā)酵                         【摘要】  本文在茯苓搖瓶液體發(fā)酵條件研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討了茯苓的搖瓶補(bǔ)料培養(yǎng)液體發(fā)酵和發(fā)酵罐補(bǔ)料液體發(fā)酵的發(fā)酵工藝。新發(fā)酵工藝縮短了茯苓液體發(fā)酵的時間，并提高了茯苓菌體產(chǎn)量。 【關(guān)鍵詞】  茯苓；液體發(fā)酵；發(fā)酵條件；補(bǔ)料；發(fā)酵罐Erlenmeye

2、r Flask Additional Medium Liquid Fermentation and Additional Medium Liquid Fermentation in Fermentor of Poria Cocos    Abstract:Under the studies on conditions of liquid fermentation of Poria cocos,the techniques of Erlenmeyer flask additional medium liquid fermentation and additional

3、 medium liquid fermentation in fermentor were studied in this paper.The time of Poria cocos liquid fermentation was decreased,the dry weight of mycelium was increased also through new technique of fermentation.    Key words:Poria cocos;liquid fermentation;fermentation conditions;addit

4、ional medium;fermentor    茯苓來源于多孔菌科真菌茯苓Poria cocos (Schw.) wolf的菌核，屬藥食兩用的大宗藥材,具有利水滲濕、健脾安神的功效。傳統(tǒng)的茯苓栽培法存在生產(chǎn)周期長、產(chǎn)量不高及松材消耗量大等缺點(diǎn)，且不利于對我國自然資源和生物多樣性的保護(hù)。用液體發(fā)酵培養(yǎng)及分離提取等新技術(shù)來生產(chǎn)茯苓，可連續(xù)地、大規(guī)模地進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，大大縮短生產(chǎn)時間，并可節(jié)省大量的木材。茯苓的液體發(fā)酵正越來越成為大家關(guān)注的研究熱點(diǎn)1，2。本文在茯苓搖瓶液體發(fā)酵條件研究的基礎(chǔ)上3，探討了茯苓的搖瓶補(bǔ)料液體發(fā)酵，并進(jìn)一步在發(fā)酵罐中研究了茯苓補(bǔ)料液體發(fā)酵

5、，為茯苓相關(guān)保健食品和藥品的開發(fā)打下良好的基礎(chǔ)。    1  材料和主要儀器    1.1  菌種    四川農(nóng)科所提供的茯苓（Poria cocos）斜面菌種，4低溫保存，6個月轉(zhuǎn)管一次。由斜面菌種制作甘油菌-30冷凍保藏4。    1.2  主要儀器與試劑    全溫振蕩器（哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司）；NBS BIOFLO 發(fā)酵罐；離心機(jī) BECKMAN J2-HS；電子天平 Sartorius BP121

6、S。    YEAST EXTRACT OXOID LTD.；TRYPTONE OXOID LTD.；葡萄糖、K2HPO4 和 MgSO4.7H2O均采用國產(chǎn)分析純。    1.3  培養(yǎng)基    2  方法    2.1  茯苓搖瓶液體發(fā)酵菌種的制備    在250ml三角瓶中裝入50ml液體種子培養(yǎng)基，按0.5的比例接種冷凍甘油菌，25搖瓶振蕩培養(yǎng)2d作為液體菌種備用。    2.2

7、  茯苓搖瓶補(bǔ)料液體發(fā)酵    在2L三角瓶裝入360ml液體搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基，以7的比例接種液體菌種，培養(yǎng)溫度為26，培養(yǎng)基初始pH值為5.5，搖瓶轉(zhuǎn)速為150r/min的培養(yǎng)條件下進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)時間為7d。在葡萄糖總濃度為4的條件下，在茯苓液體發(fā)酵的不同培養(yǎng)時間，分別以1%葡萄糖濃度（20ml補(bǔ)料培養(yǎng)基）分兩次補(bǔ)糖或以2%葡萄糖濃度（40ml補(bǔ)料培養(yǎng)基）一次補(bǔ)糖。    2.3  茯苓發(fā)酵罐液體發(fā)酵菌種的制備    在1L三角瓶中裝入350mL液體種子培養(yǎng)基，按0.5的比例接

8、種冷凍甘油菌，25搖瓶振蕩培養(yǎng)2d作為液體菌種備用。                                 2.4  茯苓發(fā)酵罐補(bǔ)料液體發(fā)酵    在火焰保護(hù)下，將350ml發(fā)酵罐種子液接種到發(fā)酵罐內(nèi)。將發(fā)酵溫度設(shè)定為26，pH值設(shè)定為5.

9、5，攪拌轉(zhuǎn)速和通氣量根據(jù)溶氧水平的高低而調(diào)整。在葡萄糖總濃度為4的條件下，在茯苓液體發(fā)酵第48、60、72和84h時，由蠕動泵分四次將0.33%的葡萄糖濃度（100ml補(bǔ)料培養(yǎng)基）或0.67的葡萄糖濃度（200ml補(bǔ)料培養(yǎng)基）的補(bǔ)料培養(yǎng)基滴加入發(fā)酵罐培養(yǎng)液體內(nèi)。同時，分別考察了不同補(bǔ)料條件下茯苓發(fā)酵罐液體發(fā)酵的最佳發(fā)酵終點(diǎn)。    2.5  菌絲稱重    發(fā)酵液6 000r/min離心15min，收集沉積的菌絲球60烘干至恒重，用精密天平稱重。    3  結(jié)果與討論 &#

10、160;  3.1  茯苓搖瓶補(bǔ)料液體發(fā)酵    以初始葡萄糖濃度為4，不補(bǔ)糖發(fā)酵為對照。以初始葡萄糖濃度為2，研究在不同時間補(bǔ)糖和以不同方式補(bǔ)糖對茯苓發(fā)酵水平的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知（見表1），在發(fā)酵培養(yǎng)第60h和第72h，分別以1%的葡萄糖濃度補(bǔ)糖效果最佳。表1  不同時間和不同補(bǔ)料方式對茯苓的搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵的影響    3.2  茯苓搖瓶補(bǔ)料發(fā)酵討論    碳源濃度對茯苓液體發(fā)酵的影響較大。初始糖濃度對發(fā)酵有一定的影響，糖濃度過高，將抑制茯苓的生長，但糖濃度過低，

11、由于碳源供應(yīng)不足，也將使茯苓生長受到抑制。茯苓進(jìn)入對數(shù)生長期后，適當(dāng)補(bǔ)糖可提高茯苓發(fā)酵產(chǎn)量。    在不同的培養(yǎng)時間補(bǔ)糖對茯苓生長有一定的影響，補(bǔ)料時間太早，碳源未很好地消耗而不利于茯苓的生長；而補(bǔ)料時間太晚，則又未能及時滿足茯苓生長對碳源的需求。另外，在補(bǔ)糖總量相同的情況下，不同的補(bǔ)糖方式對茯苓生長也有一定的影響，相對于一次以2%的葡萄糖濃度補(bǔ)糖而言，分二次以1%的葡萄糖濃度補(bǔ)糖效果更佳。這也提示發(fā)酵培養(yǎng)基營養(yǎng)成份的相對穩(wěn)定有利于茯苓的生長，最優(yōu)的補(bǔ)糖方式應(yīng)根據(jù)茯苓發(fā)酵過程中碳源消耗速率進(jìn)行連續(xù)的滴加補(bǔ)料。    3.3 

12、 茯苓發(fā)酵罐補(bǔ)料液體發(fā)酵    在茯苓的搖瓶液體發(fā)酵放大培養(yǎng)及搖瓶補(bǔ)料液體發(fā)酵研究的基礎(chǔ)上，探討了茯苓在發(fā)酵罐中的液體發(fā)酵放大培養(yǎng)工藝。其中重點(diǎn)考察了在不同的時間和以不同葡萄糖濃度的補(bǔ)料液連續(xù)滴加補(bǔ)料對茯苓液體發(fā)酵的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知（見表2），在發(fā)酵罐中連續(xù)滴加補(bǔ)料發(fā)酵較搖瓶液體發(fā)酵放大培養(yǎng)，菌體產(chǎn)量都有不同程度的增加。在發(fā)酵培養(yǎng)第48、60、72和84h時，分別以0.33%、0.67%、0.67%和0.33%的葡萄糖濃度補(bǔ)料效果最佳，菌體產(chǎn)量較搖瓶液體發(fā)酵放大培養(yǎng)提高11.27。表2  不同時間和不同補(bǔ)料方式對茯苓發(fā)酵罐液體發(fā)酵的影響 同時，也考察

13、了不同時間和不同葡萄糖濃度補(bǔ)料對發(fā)酵終點(diǎn)的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知（見表3），不同時間和不同補(bǔ)料方式對茯苓發(fā)酵罐液體發(fā)酵終點(diǎn)有一定影響，但對茯苓發(fā)酵罐液體發(fā)酵終點(diǎn)影響并不大。    綜合考慮不同時間和不同補(bǔ)料方式對茯苓發(fā)酵罐液體發(fā)酵菌體產(chǎn)量和發(fā)酵時間的影響，可見在發(fā)酵培養(yǎng)第48、60、72和84 h時，分別以0.33%、0.67%、0.67%和0.33%的葡萄糖濃度補(bǔ)料為最佳發(fā)酵工藝。    3.4  茯苓的發(fā)酵罐液體發(fā)酵討論    發(fā)酵罐的培養(yǎng)溫度和pH值能通過溫度探頭和pH探頭實(shí)現(xiàn)動態(tài)監(jiān)控，并能

14、使溫度和pH值維持在。最佳值，有利于茯苓的生長。在搖瓶液體培養(yǎng)中，搖床的轉(zhuǎn)速保持不變，因而溶氧水平的高低無法控制；而在發(fā)酵罐液體發(fā)酵中，氧氣的傳遞效率遠(yuǎn)高于搖瓶發(fā)酵，且溶氧水平能通過調(diào)節(jié)攪拌的轉(zhuǎn)速和通氣量達(dá)到很好的動態(tài)控制，因此，發(fā)酵罐液體發(fā)酵的溶氧水平比搖瓶培養(yǎng)更適合茯苓生長。茯苓能在發(fā)酵罐內(nèi)處于最適溫度、酸堿度、氧氣和碳氮比等條件下生長，呼吸作用所產(chǎn)生的代謝廢氣又能及時排放，因此新陳代謝旺盛，菌絲分裂迅速，在短期內(nèi)能獲得大量的菌絲體。另外，發(fā)酵罐的補(bǔ)料可通過調(diào)節(jié)蠕動泵的轉(zhuǎn)速而緩慢滴加補(bǔ)料液，優(yōu)于放大培養(yǎng)的一次性補(bǔ)料方式。表3  不同時間和不同補(bǔ)料方式對 茯苓發(fā)酵罐液體發(fā)酵終點(diǎn)的影響    總之，發(fā)酵罐的液體發(fā)酵是一種較先進(jìn)的茯苓生產(chǎn)技術(shù)，較搖瓶補(bǔ)料液體發(fā)酵大大縮短了發(fā)酵時間，使發(fā)酵時間從168h縮短為120h；另外，發(fā)酵罐的補(bǔ)料液體發(fā)酵還提高了茯苓的生物量，使菌絲干重從10.74g/L增長到11.95g/L，菌體產(chǎn)量提高率達(dá)11.27。    致謝：成都地奧制藥公司的劉忠榮博士、吳洽慶博士為本論文的完成提供了所需的實(shí)驗(yàn)條件和寶貴的建議。對此，作者表示感謝!【參考文獻(xiàn)】  1王謙,冀宏,丁萬