水母毒素的分離提取及溶血活性研究

1、水母毒素的分離提取及溶血活性研究    【摘要】  目的 研究水母毒素的提取及其溶血活性的影響因素。方法通過緩沖溶液浸取、超聲波細胞破碎等操作從水母觸手的刺絲囊中提取毒素，采用分光光度法對水母毒素的溶血活性進行測定，并研究了溫度、濃度和二價金屬離子等因素對毒素溶血活性的影響。結果水母毒素的溶血活性對溫度敏感，隨著濃度的提高而增大，并且依賴于Ca2+，Mg2+等二價金屬離子的存在。 結論水母毒素具有較強的溶血活性，但不穩(wěn)定。 【關鍵詞】  水母毒素；提??；溶血活性Abstract:ObjectiveTo study the extrac

2、tion and the affecting factors to haemolytic activity of jellyfish venom.MethodsJellyfish venom was extracted from the oral arms with tentacles through such operations as soaking in buffer solution and disrupting cell in supersonic wave. Activity of the venom to chicken red blood cells was detected

3、by spectrophotometric method. The effects of factors such as temperature, concentration, divalent metal cations on the haemolytic activity were studied. ResultsThe haemolytic activity was temperature-sensitive, and improved with the concentration increase. The presence of Ca2+,Mg2+ wass necessary fo

4、r haemolytic activity.ConclusionThe haemolytic activity of jellyfish venom is relatively strong, but it is unstable.Key words:Jellyfish venom;  Extraction;  Haemolytic activity    生物毒素是生物活性最高、毒性最大的一類化學物質，對探索生命運動過程和發(fā)展新藥均有重要價值。論文論文參考網(wǎng)藥物是指對失調的機體呈現(xiàn)有益作用的化學物質。藥物的藥理活性和毒副作用主要取決于藥物分子

5、的化學結構。化學結構與藥物效應之間的關系（即構效關系）是藥物研究的重要依據(jù)。海洋生物毒素所特有的化學結構使其極有可能成為特異的高活性、高藥效的先導化合物，以具有確定藥理效用的海洋毒素為先導化合物，對先導化合物進行結構或性能的改造，尋求新的療效更好的藥物是當前新藥研究的重要方向之一1,2。    水母屬于腔腸動物門，是一個重要的海洋浮游生物類群，它種類多、數(shù)量大，分布廣泛，我省黃海領域就具有豐富的水母資源，主要的水母品種有海蟄、海月水母和多管水母等。對于具有食用價值的海蟄已經(jīng)于2004年實現(xiàn)了全人工育苗養(yǎng)殖，如江蘇連云港市已經(jīng)在贛榆、宿城、燕尾港等地建立了養(yǎng)殖基地。

6、水母在食用及藥用上都具有研究、開發(fā)的價值，自古以來水母用于傳統(tǒng)中藥，有清熱解毒、軟堅散結、降壓、抑菌、抗衰老的功效，可用于治療高血壓病、氣管炎、哮喘、胃潰瘍、中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，并可作為神經(jīng)組織的活性物質和組織胺釋放劑。水母的觸手上分布著腔腸動物所特有的刺絲囊，其中含有大量的毒素成分。毒素蛋白是水母的主要活性成分之一，它是結構新穎獨特的肽類毒素，具有多種生物活性，如溶血性、酶活性、神經(jīng)毒性、皮膚壞死、肌肉毒性、肝臟毒性以及心臟毒性等3,4。    溶血毒素(Hemolysin)是指多由病原微生物所產(chǎn)生的，能導致機體紅細胞及其他有核細胞裂解的毒素類物質，它存在于環(huán)節(jié)

7、動物、節(jié)肢動物、軟體動物、棘皮動物等動物的血清或體液中，可以單獨作為調理因子或通過蛋白水解酶發(fā)揮作用，其活性大小通過溶解（水解）脊椎動物的血細胞表示，最終的溶解效應被稱作溶血活性。目前溶血毒素研究以微生物為主，無脊椎動物溶血毒素研究報道非常少，有關水母毒素溶血性能的研究報道很少5。本實驗通過緩沖溶液浸取、超聲波細胞破碎等技術從水母觸手的刺絲囊中提取水母毒素，采用分光光度法對其溶血活性進行測定，并研究溫度、pH 值、金屬離子等理化因子對其溶血活性的影響。1  材料與方法1.1  水母的采集水母于2006?07采集于江蘇燕尾港附近海域的人工養(yǎng)殖場，扇形帶刺絲囊的觸手沿水母口腕人

8、工切除分放在食品級聚乙烯塑料袋中，扎好封口后，立即于-20冷凍保存?zhèn)溆谩?.2  水母毒素的提取及濃度測定取一定重量的冷凍的水母觸手，在冷凍狀態(tài)下放入浸取劑（0.01 mol/L，pH 6.0的磷酸緩沖液）中，在保持溫度低于4的條件下浸泡3 h，勻漿10 min后，超聲波破碎，超聲波功率200 W、總工作時間2 min、工作/間隙時間15/30S。破碎后的物料于4、13 000 r/min的條件下高速冷凍離心15 min，所得到的上清液即為水母毒素粗品。以牛血清白蛋白(BSA)作標準，在塑料器皿中用Bradford法(1976)測定水母毒素粗品中蛋白質的濃度C(mg/ ml)。1.3

9、  雞紅細胞懸液的制備采集新鮮雞血50 ml，2 000 r/ min離心5 min，取上層液體，以pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（含136.9 mmol/L NaCl，2.68 mmol/L KCl，10.14 mmol/L Na2HPO4，1.76 mmol/L KH2PO4）離心洗滌3次，用磷酸鹽緩沖溶液配成體積分數(shù)為1%的雞紅細胞懸液，4冰箱保存?zhèn)溆谩?. 4  水母毒素溶血活性的測定方法取2 ml體積分數(shù)為1%的雞紅細胞懸液與一定量的水母毒素混合均勻，37保溫30 min，間歇振蕩。在對照管中加入2 ml體積分數(shù)為1%的雞紅細胞懸液和0. 5 ml磷酸鹽緩沖溶液，與

10、實驗管同時保溫，取出后立即冰浴以終止反應，經(jīng)2 000 r/min 離心5 min后獲得上清液。以對照管上清液作空白，于540 nm處測吸光度(A)，A值每增加0.001定義為1個溶血活性單位（u）。所測定必須重復3次，記錄3次結果的平均值。1.5  理化因素對水母毒素溶血活性的影響在8支實驗管中取一定量的水母毒素與2 ml體積分數(shù)為1%的雞紅細胞懸液混合均勻，使水母毒素的最終濃度分別為：0.02,0.05,0.1，0.2，0.5，0.8，1.0，1.2 g/ml。將上述水母毒素實驗管分別在4，25，37，45，60，100下恒溫處理20 min后，按“1.4”的方法檢測其對雞紅細胞

11、的溶血活性。論文參考網(wǎng)為研究二價金屬離子對水母毒素溶血活性的影響，并排除其他離子的干擾，將水母毒素在4的緩沖溶液中透析4 h，透析緩沖溶液的組成為：0.01 mol/L，pH 6.0的磷酸緩沖液100 ml中加入1 g十二烷基硫酸鈉和1 ml b-巰基乙醇。    取2 ml體積分數(shù)為1%的雞紅細胞懸液與0.5 ml透析過的水母毒素混合均勻放入9支實驗管（19#），19#實驗管中分別加入0. 1 ml的不同濃度的CaCl2、MgCl2、ZnCl2溶液，使二價金屬離子的最終濃度分別為5，10，15 mmol/ L，10#實驗管中加入2 ml雞紅細胞懸液和透析過的水母

12、毒素、11#實驗管中加入2 ml雞紅細胞懸液和未透析的水母毒素，對照管中加入0. 1 ml磷酸鹽緩沖溶液作為空白對照，實驗管和對照管同時在37處理30 min，檢測溶血活性。所有實驗管的水母毒素蛋白的最終含量都為0.5 g/ml。2  結果2.1  溫度、濃度對水母毒素溶血活性的影響結果見表1。由實驗結果可以看出，在實驗濃度范圍內，隨著水母毒素濃度的提高，溶血活性增大。當濃度低于0.1 g/ml，幾乎沒有活性；當濃度高于0.8 g/ml，活性增大不顯著。表1  不同濃度的水母毒素經(jīng)不同溫度預處理后的溶血活性濃度（略）    隨著預處理

13、溫度的提高，水母毒素的溶血活性降低，預處理溫度高于45時，溶血活性顯著大幅度下降。預處理溫度達到100時，毒素蛋白變性，溶血活性完全喪失。這反映水母毒素的溶血活性對熱是非常不穩(wěn)定的。2.2  二價金屬離子對溶血活性的影響金屬離子對溶血活性的影響實驗結果見表2。結果顯示，水母毒素透析后，溶血活性顯著降低；添加CaCl2，MgCl2，ZnCl2后，溶血活性增大，并且隨著二價金屬離子濃度的提高，活性增強。說明水母毒素的溶血活性依賴于二價金屬離子的存在，與類似的文獻報道一致5。表2  不同濃度金屬離子作用下的水母毒素溶血活性（略）3  結論  

14、0; 水母毒素的溶血活性對溫度敏感，當預處理溫度高于25時，活性明顯下降，100時完全失去活性。    水母毒素的溶血活性隨著濃度的提高而增大，但當濃度高于0.8g/ml，活性增大不顯著。    水母毒素的溶血活性依賴于Ca2+、Mg2+等二價金屬離子的存在，且在一定范圍內隨著二價金屬離子濃度的提高，活性增強。【參考文獻】  1胡延春，賈艷，張乃生. 生物毒素的應用研究J.生物技術通訊，2004，(1)：84.2李光友，劉發(fā)義. 海洋生物活性物質的研究與開發(fā)技術M.青島：青島海洋大學出版社，2000.3張奕強，許實波. 水母的化學和藥理學研究概況J.中國海洋藥物，1999，(1)：43.4L. Gusmani, M. Avian, B. Galil, P. Patriarca and G. Rottini. Biologically Active Polypeptides in the Venom of the Jellyfish Rhopilema nomadicaJ.Toxin,1997, 35(5): 637.5John J. C