大鼠胚胎卵巢移植的形態(tài)與功能研究

1、    大鼠胚胎卵巢移植的形態(tài)與功能研究        【摘要】目的明確胚胎卵巢移植后的生存，生長(zhǎng)及功能恢復(fù)情況。方法將大鼠胚胎卵巢移植入去勢(shì)成年雌鼠頸部皮下及腎被膜下，分別于移植后5、10、2535、35d以上取移植卵巢進(jìn)行組織學(xué)和組織化學(xué)研究，并測(cè)定血清雌、孕激素水平。結(jié)果移植后第5d移植物內(nèi)有大量血細(xì)胞；第10d移植物內(nèi)有大量原始卵泡及初級(jí)卵泡；第25d及以后移植物內(nèi)可見不同階段的發(fā)育卵泡，并可見間質(zhì)腺及黃體。受體在移植后第23d左右陰道涂片出現(xiàn)動(dòng)情周期。組織化學(xué)顯示移

2、植物3-羥甾脫氫酶及油紅O呈不同程度陽性反應(yīng)，與正常卵巢陽性部位一致。血清學(xué)研究顯示移植卵巢具有與正常卵巢接近的分泌雌、孕激素的能力。結(jié)論胚胎卵巢移植后能在異位存活并可發(fā)育成具有內(nèi)分泌功能的腺體?！娟P(guān)鍵詞】大鼠；胚胎卵巢；移植 A study on the morphology and function of fetal ovary allotransplant in ratsCAO Jinyan,SHI Xiaolin,ZHU Dingshou(Reproductive Medical Center,Capital University of Medical Sciences，Beijing

3、 100054,China)【Abstract】ObjectivesTo study the survival,growth and function restoration of fetal ovary allotransplant.MethodsMurine fetal ovaries were grafted subcutaneously and under renal capsule to spayed adult female rats.On day 5,10,25-35,beyond 35 after transplantation,the grafts were removed

4、and underwent histological and histochemical examination.Serum estrodiol and progesterone levels were determined.ResultsIt can be divided three periods according the HE staining: On the day 5 of transplantation,there were many blood cells in the graft.On day 10,there were a lot of primordial and pri

5、mary follicles in ovarian cortex of the graft.On day 25 and later,there were follicles in different developing stages,corpora luteas and interstitial glands in the graft.The positive reaction of 3-HSDH and oil red O and the results of serum estrodiol and progesterone showed that transplanted fetal o

6、vary restored secreting function.ConclusionsFetal ovary allotransplant can be survival,develop and restore the function of secreting sex hormone.【Key words】Rat;Fetal ovary;Transplantation卵巢組織的移植始于十九世紀(jì)末，有些人認(rèn)為較高的內(nèi)源性促性腺激素濃度利于移植物的生長(zhǎng)1-2,另外也有人認(rèn)為不利于移植物生長(zhǎng)3。盡管科學(xué)不斷進(jìn)步，但移植中的許多重大問題仍未得到明確解決，例如移植物的選擇，移植部位的選擇，受體狀態(tài)的

7、選擇，移植的免疫排斥問題等等。材料與方法一、材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為Wistar大鼠，由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供。1.移植物：為孕18或19 d的大鼠胚胎卵巢。2.實(shí)驗(yàn)組：成年雌鼠共100只。按移植部位分成： 頸部移植，50只； 腎被膜下移植，50只。3.正常對(duì)照組：正常成年雌性大鼠10只。4.去勢(shì)對(duì)照組：正常成年雌性大鼠10只切除雙側(cè)卵巢，不移植胚胎卵巢。二、方法1.手術(shù)方法：(1) 胚胎卵巢的收集：取孕1819 d胚鼠卵巢，大部分放入生理鹽水中，室溫放置至移植時(shí)。少量放入中性的福爾馬林液固定，進(jìn)行組織學(xué)觀察。(2) 去勢(shì)手術(shù)：去勢(shì)組及實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物用20 g/L戊巴比妥鈉按45 mg/kg麻醉后，取中

8、下腹切口，找到卵巢，切除兩側(cè)卵巢、輸卵管和部分子宮。(3) 移植手術(shù)：實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物去勢(shì)后立即移植入胚胎卵巢。頸部移植手術(shù)：上述方法麻醉后，頸部右側(cè)切口，鈍性分離皮下組織，以頸靜脈為底用縫線將附近結(jié)締組織縫成小兜，將胚胎卵巢放入兜內(nèi)，并將兜口縫合，使胚胎卵巢位置相對(duì)固定。腎被膜下移植手術(shù)：麻醉后，取左上腹部切口，鈍性分離皮下組織，找到左腎并輕輕拉起，在上極處用眼科鑷夾一小孔，用自制的頭鈍園玻璃吸管將12對(duì)胚胎卵巢送入腎被膜并移至下極部位，以免移植物丟失。2.取材方法：(1) 實(shí)驗(yàn)組：分別于移植后第5 d(5只)，10 d(5只)，2535 d(20只)，35 d以上(20只)取移植物及周圍結(jié)締組織

9、置于中性福爾馬林液中固定，用于組織學(xué)檢查。25 d以上移植物液氮冷凍，用于組織化學(xué)染色。移植不同時(shí)期斷頸取血，用于血清學(xué)檢查。(2) 正常對(duì)照組：正常雌性大鼠卵巢分別置于中性福爾馬林液和液氮中用于組織學(xué)檢查或組織化學(xué)染色。取動(dòng)情周期正常的雌性大鼠，斷頸后取血，用于血清學(xué)檢查。(3) 去勢(shì)對(duì)照組：正常雌性大鼠去勢(shì)20 d以上，斷頸取血，用于血清學(xué)檢查。3.實(shí)驗(yàn)方法：(1) 組織學(xué)方法：中性福爾馬林固定的組織，經(jīng)石蠟包埋，切片厚5 m。取連續(xù)切片，5張為一組，每組間隔30 m50 m，常規(guī)組織學(xué)HE染色。(2) 陰道細(xì)胞涂片檢查：對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組大鼠每日清晨8時(shí)進(jìn)行陰道脫落細(xì)胞檢查，了解動(dòng)情周期。(

10、3) 組織化學(xué)方法：液氮冷凍標(biāo)本經(jīng)恒冷箱切片機(jī)切片，厚8 m。進(jìn)行3-羥甾脫氫酶(3-HSDH)和油紅O染色。(4)血清學(xué)檢測(cè)：全血經(jīng)2 500 r/min離心15 min，取血清入-20冰箱冷凍保存，溶化后用放射免疫測(cè)定技術(shù)測(cè)定血清雌激素(E)和孕激素(P)水平。結(jié)果一、 組織學(xué)觀察1.正常對(duì)照組：鏡下卵巢被膜很薄，皮質(zhì)內(nèi)可見不同發(fā)育階段的卵泡、黃體和間質(zhì)腺。孕19 d胚胎卵巢呈半月狀，乳白色，長(zhǎng)徑不足1 mm。鏡下可見卵巢外包被12層上皮細(xì)胞，外層為皮質(zhì)，占主要部分，含有大量的處于分裂狀態(tài)的卵原細(xì)胞，其周圍可見梭形細(xì)胞將卵原細(xì)胞成群分隔；未見典型的原始卵泡形成。2.實(shí)驗(yàn)組：(1) 頸部移植

11、后5 d可見移植物部位及周圍結(jié)締組織充血。鏡下移植物被結(jié)締組織包裹，呈半月狀，中心部壞死出血，可見核固縮，未見卵泡結(jié)構(gòu)。移植后10 d觀察：移植部位周圍血管豐富，可見血管長(zhǎng)入移植物。鏡下可見存活卵巢被較厚的結(jié)締組織包裹，有血管和少量淋巴細(xì)胞。卵巢主要為皮質(zhì)組成，皮質(zhì)內(nèi)有大量形態(tài)正常的原始卵泡及初級(jí)卵泡。移植后2535 d觀察：移植物明顯增大接近正常，表面血管豐富，凹凸不平。鏡下可見移植卵巢包裹較厚的結(jié)締組織膜，移植物內(nèi)可見較多淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，但卵泡周圍相對(duì)量較少，卵泡內(nèi)未見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)；卵巢內(nèi)血管豐富，可見不同發(fā)育階段形態(tài)正常的卵泡，有的可見間質(zhì)腺及黃體。移植后35 d以上觀察：移植物正常大小，

12、紅色或淡紅色，表面可見突起。鏡下移植卵巢外包裹較厚的結(jié)締組織膜，移植物內(nèi)可見淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，卵巢內(nèi)血管豐富，可見不同發(fā)育階段的卵泡、黃體及間質(zhì)腺。(2) 腎被膜下移植后5 d觀察：移植物位于腎被膜下。鏡下未見殘存卵泡結(jié)構(gòu)，極少受體可見移植物附近的腎被膜外有腫大的淋巴結(jié)。移植后10 d觀察：移植卵巢位于腎被膜下，稍有增大，白色呈球形，表面可見血管。鏡下可見移植物被結(jié)締組織包裹，卵巢表面為一層立方上皮，卵巢以皮質(zhì)為主，可見大量的原始卵泡及初級(jí)卵泡。移植后2535 d觀察：移植物明顯增大，表面凹凸不平，血管豐富。鏡下可見移植卵巢一側(cè)緊貼腎臟組織，余下部分為結(jié)締組織包裹，卵巢內(nèi)可見許多的不同發(fā)育階段的卵

13、泡，血管豐富，未見明顯的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，有些可見間質(zhì)腺及黃體。移植后35 d以上觀察：移植物卵巢正常大小，表面凹凸不平。鏡下卵巢內(nèi)可見大量不同發(fā)育階段卵泡，并可見間質(zhì)腺和黃體及一些正在退化閉鎖狀態(tài)的卵泡。二、陰道細(xì)胞涂片檢查1.正常對(duì)照組：平均周期為45 d。2.去勢(shì)對(duì)照組：無周期性變化。3.實(shí)驗(yàn)組：（1） 頸部移植平均周期為4.75 d；（2） 腎被膜下移植平均周期為6.40 d。三、 組織化學(xué)檢查1.3-HSDH：（1）正常對(duì)照組：發(fā)育卵泡的卵泡膜內(nèi)層細(xì)胞3-HSDH呈陽性反應(yīng)，間質(zhì)腺3-HSDH呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，黃體呈陽性反應(yīng)。（2）實(shí)驗(yàn)組：實(shí)驗(yàn)組中兩個(gè)移植部位的移植物中發(fā)育卵泡的卵泡膜內(nèi)層及

14、黃體呈陽性反應(yīng)，間質(zhì)腺呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，與正常對(duì)照組一致。2.油紅O：（1） 正常對(duì)照組：卵巢發(fā)育卵泡，間質(zhì)腺和黃體油紅O染色呈陽性至強(qiáng)陽性反應(yīng)。（2） 實(shí)驗(yàn)組：發(fā)育卵泡呈陽性反應(yīng)，間質(zhì)腺及黃體亦呈陽性反應(yīng)。四、血清學(xué)檢查(1) 正常對(duì)照組血清E、P分別為(14.35±5.97)ng/L和(17.96±4.91)g/L； (2) 去勢(shì)對(duì)照組血清E、P分別為(2.05±1.21)ng/L和(2.37±0.93)g/L； (3) 實(shí)驗(yàn)組移植35 d后血清E、P的平均值分別為(16.35±6.08)ng/L和(13.0±3.66)g/L。實(shí)驗(yàn)組

15、與正常對(duì)照組比較差異無顯著性(P0.05)，但顯著高于去勢(shì)對(duì)照組(P0.01)。實(shí)驗(yàn)組兩個(gè)移植部位移植35 d以上的E、P差異無顯著性。但移植510 d及2535 d血清E、P的平均值明顯低于正常對(duì)照組。討論根據(jù)移植物移植后發(fā)生的變化，可將其分為3個(gè)階段。第一階段：在移植第5 d，胚胎卵巢移植物內(nèi)可見大量出血，并可見核碎裂，未見明顯的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。第二階段：移植第10 d，移植物已開始恢復(fù)，可見大量的原始卵泡及初級(jí)卵泡，間質(zhì)成分較少。第三階段：移植25 d以后，移植物內(nèi)大量不同發(fā)育階段卵泡、黃體及間質(zhì)腺。根據(jù)HE及陰道涂片結(jié)果可見腎被膜下移植物存活率高于頸部移植物。HE觀察腎被膜下移植淋巴細(xì)胞

16、浸潤(rùn)程度均低于頸部移植，說明腎被膜下移植引起的免疫排斥反應(yīng)低于頸部移植。根據(jù)陰道涂片腎被膜下移植出現(xiàn)動(dòng)情周期的比例高于頸部移植，但存活的移植卵巢中，最終發(fā)育生長(zhǎng)的情況兩者間無顯著差異。本研究選擇孕18、19 d卵巢進(jìn)行移植是因?yàn)榕咛ヂ殉部乖缘停灰滓饳C(jī)體的免疫排斥4。本實(shí)驗(yàn)觀察到不論是腎被膜下移植還是頸部皮下移植，在移植卵巢的結(jié)締組織內(nèi)均可見淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn)，說明胚胎組織雖是免疫原性低的組織，但仍能引起機(jī)體對(duì)它的免疫反應(yīng)。值得討論的是，我們?cè)谝浦矊?shí)驗(yàn)的全過程中均未使用免疫抑制劑，但移植卵巢能生長(zhǎng)發(fā)育至正常狀態(tài)。機(jī)體對(duì)胚胎移植物不排斥的機(jī)理還有待進(jìn)一步探討。3-HSDH 是甾體激素合成的標(biāo)志酶

17、，細(xì)胞內(nèi)3-HSDH反應(yīng)陽性說明此細(xì)胞具有分泌甾體激素的功能。卵巢間質(zhì)腺、黃體及卵泡膜內(nèi)層細(xì)胞是具有分泌甾體激素的細(xì)胞，這些細(xì)胞3-HSDH呈陽性反應(yīng)說明移植物具有分泌甾體激素的功能。油紅O主要顯示中性脂類，包括甘油三酯、膽固醇、膽固醇酯、類固醇和某些糖脂。類固醇是合成甾體激素的物質(zhì)基礎(chǔ)。兩組移植卵巢油紅O染色陽性進(jìn)一步說明移植卵巢具有從血液或其它組織中攝取類固醇物質(zhì)的功能。E、P是卵巢分泌的兩種重要激素，它們與GTH協(xié)同維持雌性個(gè)體動(dòng)情周期。我們通過放射免疫法測(cè)定了正常對(duì)照組、去勢(shì)對(duì)照組、頸部移植和腎被膜移植組移植后的E、P變化，以此判斷移植卵巢性激素分泌情況。結(jié)果證明實(shí)驗(yàn)組移植35 d后E

18、、P與正常對(duì)照組的水平接近，顯著高于去勢(shì)對(duì)照組。說明胚胎卵巢移植物能夠存活，并發(fā)育為具有與正常卵巢接近的分泌E、P的能力。該結(jié)果與陰道涂片及組織學(xué)結(jié)果是一致的。卵泡的生長(zhǎng)發(fā)育有著明顯的階段性，發(fā)育初期卵泡是在卵巢自身雌激素作用下，只有當(dāng)卵泡發(fā)育到一定階段，即在卵泡細(xì)胞上出現(xiàn)了促性腺激素受體，卵泡在促性腺激素的作用下才能進(jìn)一步發(fā)育成竇狀卵泡。因此本研究結(jié)果證明胚胎卵巢不僅能在異體異位發(fā)育生長(zhǎng)，而且還能接受上級(jí)器官-垂體激素的調(diào)控。綜上所述，我們的研究證明了以下論點(diǎn)： (1) 胚胎組織移植入異體內(nèi)可引起機(jī)體的免疫反應(yīng)，但機(jī)體對(duì)移植物并不排斥； (2) 胚胎卵巢組織被移入異體內(nèi)可以生長(zhǎng)發(fā)育至成熟，并有內(nèi)分泌功能。根據(jù)我們的研究結(jié)果提示使用胚胎卵巢移植方法糾正因性激素不足給機(jī)體造成的不良反應(yīng)在大鼠實(shí)驗(yàn)中證實(shí)是行之有效的措施。基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（39670096）作者單位：曹金燕(首都醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心北京，100054)史小林(首都醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)研究中心北京，1000