管碟法測定抗生素效價(jià)

1、管碟法測定抗生素的效價(jià)目錄概述1基本原理2菌液制備3基本操作及注意事項(xiàng)4操作要點(diǎn)5檢定的影響因素61概述抗生素微生物檢定法是國際上通用的、經(jīng)典的抗生素效價(jià)測定方法。隨著HPLC等化學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，一些抗生素效價(jià)的測定已被化學(xué)方法所替代，但由于以下原因，抗生素微生物檢定法，目前在各國藥典中仍占有重要地位。1.微生物檢定法可直觀、特異的反應(yīng)出抗生素藥品的抗菌活性，顯示臨床的特點(diǎn)。2.多組分抗生素由于不同組分生物活性的差異，化學(xué)測定結(jié)果難以準(zhǔn)確表征組分、組成、含量和活性的關(guān)系。3.許多抗生素品種由于各種原因目前沒有適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)分析方法表征其活性。4.同時(shí)微生物法所需的儀器設(shè)備簡單，成本低。在中國藥典

2、2010年版二部附錄抗生素微生物檢定法及2015版藥典中，詳細(xì)描述了管碟法和濁度法測定抗生素效價(jià)的方法，根據(jù)公司生產(chǎn)及檢測情況，主要是硫酸慶大霉素和硫酸慶大霉素顆粒，采用抗生素管碟法測效價(jià)來計(jì)算含量，因此，此章主要介紹管碟法?？咕钚钥咕钚允侵缚咕幬镆种苹驓⑺啦≡⑸锏哪芰?。抗生素的抗菌活性通常用效價(jià)來表示。在臨床應(yīng)用中，抗生素的抗菌活性可準(zhǔn)確地反應(yīng)抗生素的醫(yī)療價(jià)值。 如：硫酸鏈霉素 798單位/毫克 青霉素G鈉 1670單位/毫克2010版藥典二部附錄及2015版藥典，在適宜條件下，根據(jù)量反應(yīng)平行線原理，利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)的擴(kuò)散作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品與供試品兩者對接種的試驗(yàn)菌產(chǎn)生抑菌圈

3、的大小，測定供試品的效價(jià)。2基本原理 兩種互動作用：一種是抗生素溶液向培養(yǎng)基內(nèi)呈球面狀擴(kuò)散作用；另一種是試驗(yàn)菌的生長作用。 當(dāng)培養(yǎng)到一定時(shí)間，瓊脂培養(yǎng)基的兩種互動作用達(dá)到動態(tài)平衡時(shí)，瓊脂培養(yǎng)基中便形成透明的抑菌圈。即：在抑菌圈中因抗生素濃度高于抑菌濃度，試驗(yàn)菌生長受到抑制，此處瓊脂培養(yǎng)基成透明狀；在抑菌圈邊緣抗生素濃度恰好等于抗生素最低抑菌濃度。抑菌圈的形成量反應(yīng)平行線原理：當(dāng)抗生素濃度的對數(shù)劑量和反應(yīng)呈直線關(guān)系，且供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的作用性質(zhì)相同時(shí)，供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的兩條量-反應(yīng)關(guān)系曲線相互平行。（中國藥典二部附錄XIV生物檢定統(tǒng)計(jì)法）根據(jù)中國藥典2010年版二部附錄要求，硫酸慶大霉素和硫酸慶大霉

4、素顆粒測效價(jià)，選取短小芽孢桿菌作為試驗(yàn)菌。取短小芽孢桿菌CMCC(B)63202的營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于盛有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在3537培養(yǎng)7日，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上。用滅菌水將芽孢洗下，在65加熱30分鐘，備用。3菌液制備流程圖凍干菌粉 營養(yǎng)肉湯半固體瓊脂斜面制菌懸液穿刺管（保藏及傳代用）備注：每經(jīng)過一次培養(yǎng)箱培養(yǎng)，菌的代數(shù)就增加一代。參考：藥品微生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)主編：蘇德模 馬緒榮 2007年出版（復(fù)活）1.復(fù)活 從菌種保藏機(jī)構(gòu)購回的標(biāo)準(zhǔn)菌株，是冷凍干燥粉，需經(jīng)過復(fù)活。（凍干菌種為第0代）無菌操作，將冷凍干燥菌種安瓿用75%乙醇消毒后，用砂輪在安瓿頸部刻線，

5、用無菌紗布掰開，或灼熱安瓿頂部，立即作滅菌濕紗布蓋住頂部，安瓿頂部便驟然裂開，小心移去玻璃碎片，用一無菌毛細(xì)管吸取0.5-1ml適宜的液體培養(yǎng)基，直插安瓿底部，擠出營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，在底部振搖使菌粉溶解，再將安瓿內(nèi)菌液吸出，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。35-37度培養(yǎng)18-24小時(shí)。（此為第一代）制保藏用菌株將營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物，用接種針沾取菌苔（菌液），沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺。穿刺到保藏管中，同樣溫度35-37度，培養(yǎng)18-24h，然后，放置2-8度冰箱保存，作為保藏及傳代用的菌株。試驗(yàn)用菌種穿刺管1支，按無菌操作要求，接種于盛有30ml普通瓊脂培養(yǎng)基的大三角瓶中，旋轉(zhuǎn)三角瓶使全部瓊脂培養(yǎng)基

6、表面被菌液浸潤，多余的菌液用吸管吸出棄入消毒液中。將已接種的三角瓶置3537的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)710天，用革蘭氏染色法涂片鏡檢，應(yīng)有芽孢85%以上，用滅菌水20ml洗下芽孢，制成懸液，在65水浴中加熱30分鐘，即得。置5冰箱中保存。制工作用菌懸液革蘭染色法 具體操作步驟： 涂片 干燥（自然干燥、培養(yǎng)箱內(nèi)） 固定（火焰） 染色（包含初染、媒染、脫色、復(fù)染四步）涂片染色染色初染：初染：草酸銨結(jié)晶紫染1分鐘，自來水沖洗。媒染：媒染：加碘液覆蓋涂面染1分鐘，自來水沖洗。脫色：脫色：加95%酒精數(shù)滴，并輕輕搖動進(jìn)行脫色，30秒后自來水沖洗。復(fù)染：復(fù)染：加沙黃（復(fù)紅）復(fù)染液30秒后，自來水沖洗。自然干燥或用吸

7、水紙吸去水分，鏡檢。染色的結(jié)果：染色的結(jié)果：革蘭陽性菌呈紫色，革蘭陰性菌呈紅色。圖片染色步驟涂片涂片鹽水鹽水 95% 95%乙醇乙醇自然干燥自然干燥媒染媒染1min1min脫色脫色 30s30s固定固定初染初染1min1min復(fù)染復(fù)染30s干燥干燥鏡檢鏡檢接種環(huán)接種環(huán)草酸草酸銨結(jié)銨結(jié)晶紫晶紫碘液碘液復(fù)紅復(fù)紅革蘭染色原理 由于細(xì)菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和組成不同，將細(xì)菌分為革蘭陽性菌和革蘭陰性菌。 G菌：細(xì)胞壁厚，肽聚糖網(wǎng)狀分子形成一種透性孔障，當(dāng)乙醇脫色時(shí)，肽聚糖脫水而孔障縮小，透性降低,故保留結(jié)晶紫-碘復(fù)合物不易被洗脫而保留在細(xì)胞膜上，菌體呈紫色為革蘭陽性菌。 G菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)松散，乙醇脫色不能

8、使其結(jié)構(gòu)收縮，其脂含量高,乙醇將脂溶解，細(xì)胞壁透性加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細(xì)胞壁，沙黃復(fù)染后菌體呈紅色為革蘭陰性菌。革蘭染色注意事項(xiàng)1.革蘭染色成敗的關(guān)鍵是脫色時(shí)間，如脫色過度，革蘭陽性菌也可被脫色而被誤認(rèn)為革蘭陰性菌；如脫色時(shí)間過短，革蘭陰性菌也會被誤認(rèn)為是革蘭陽性菌。因此必須嚴(yán)格把握脫色時(shí)間。 2.選用培養(yǎng)1824小時(shí)菌齡的細(xì)菌為宜，若細(xì)菌太老，由于菌體死亡或自溶常使革蘭陽性菌轉(zhuǎn)呈陰性菌。革蘭染色結(jié)果革蘭染色結(jié)果革蘭染色結(jié)果革蘭染色結(jié)果管碟法的操作步驟預(yù)試驗(yàn) 試驗(yàn)準(zhǔn)備 雙碟的制備 供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 菌層的制備 放置小鋼管 滴加抗生素溶 液 雙碟的培養(yǎng) 抑菌圈的測量 結(jié)果的可 靠性

9、檢驗(yàn)及效價(jià)測定4基本操作及注意事項(xiàng)預(yù)試驗(yàn)：確定最佳的試驗(yàn)條件：調(diào)整試驗(yàn)菌的濃度、使用量、抗生素濃度、培養(yǎng)基等，使抑菌圈的大小符合規(guī)定，即二劑量法高劑量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致的抑菌圈直徑在1822mm,三劑量法中間劑量濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液所致的抑菌圈直徑在1518mm. 高低劑量之比為2:1.試驗(yàn)結(jié)果中抑菌圈直徑不應(yīng)該過大或者過小，在試驗(yàn)之前，可以先做一個關(guān)于用不同濃度菌液配制的瓊脂培養(yǎng)基菌層預(yù)試驗(yàn)，選擇抑菌圈直徑在1822mm的菌液濃度為試驗(yàn)用濃度（菌液濃度約為106個/mL）。批量試驗(yàn)中后期，菌液保存的時(shí)間過久，菌株就會逐漸衰亡，生長周期不一致，影響其對抗生素的敏感度，導(dǎo)致抑菌圈變大、模糊或者出現(xiàn)雙圈

10、。如若菌株不純，也會造成這樣的結(jié)果。因此，菌液在使用一段時(shí)間后，可以重新配制純化或者減小原來菌液在使用中的稀釋倍數(shù)。試驗(yàn)準(zhǔn)備：雙碟、鋼管、毛細(xì)滴管、吸管的清洗及滅菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培養(yǎng)基、緩沖液的準(zhǔn)備、半無菌間的紫外消毒等. 抗生素試驗(yàn)中，玻璃雙碟、小鋼管往往會連續(xù)使用。由于清洗方面的原因，它們還是容易殘留上次試驗(yàn)中的抗生素（慶大霉素、爭光霉素、鏈霉素等）或者被清洗用的殺菌劑（如新潔而滅、洗潔精、去污粉等）污染，以至于在下次試驗(yàn)中造成抑菌圈不正常的現(xiàn)象。因此，在清洗時(shí)要尤為注意多用流水沖洗。雙碟的制備：每只雙碟加底層培養(yǎng)基約20ml,待培養(yǎng)基凝固后,將雙碟放入3537培養(yǎng)箱中,待用.

11、無菌室工作臺面可能因?yàn)槭褂脮r(shí)間已久，變得凹凸不平或者傾斜，會影響培養(yǎng)基菌層的厚度均勻性。菌層越薄，形成的抑菌圈越大，會給試驗(yàn)造成很大的誤差。我們可以在桌面上放置一塊足夠大的玻璃平板，保證雙碟放置區(qū)域的平整。在雙碟底部預(yù)先標(biāo)記樣品的高低濃度區(qū)域，在加注培養(yǎng)基底層的時(shí)候，有順序地按照一致方向排列。接下來加注培養(yǎng)基菌層的時(shí)候，仍然按照原來的位置與方向排列。這樣，即使桌面不夠水平，還是能夠保證培養(yǎng)基菌層是在水平的培養(yǎng)基底層上鋪開，達(dá)到消除誤差的目的。試驗(yàn)中加注的培養(yǎng)基如果溫度太低，就容易在內(nèi)部結(jié)塊，或者加注到雙碟之后不能及時(shí)鋪開，使得培養(yǎng)基表面為非水平面，會給試驗(yàn)帶來誤差。加注6080的培養(yǎng)基底層之后

12、，不應(yīng)立即給雙碟加蓋。因?yàn)闇囟冗^高的培養(yǎng)基會形成大量的水蒸氣，在雙碟蓋上凝集并滴落在已經(jīng)凝固定的培養(yǎng)基底層上，會給培養(yǎng)基菌層的加注帶來影響。供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備：估計(jì)供試品的效價(jià),根據(jù)試驗(yàn)要求設(shè)計(jì)供試品、標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋步驟,平行制備供試品、標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)劑量的溶液.依公司產(chǎn)品，硫酸慶大霉素和硫酸慶大霉素顆粒，采用的是二劑量法，試驗(yàn)中，制成高、低濃度的溶液。 依中國藥典2010版及2015版二部附錄要求，菌層的制備：注意菌層培養(yǎng)基溫度；根據(jù)預(yù)試驗(yàn)確定加入菌層培養(yǎng)基的菌液量,注意制備菌層的速度和平整度. 制備瓊脂培養(yǎng)基菌層時(shí)，培養(yǎng)基溫度過高或者受熱時(shí)間太長都會導(dǎo)致試驗(yàn)菌死亡。當(dāng)菌種為非芽孢桿菌的時(shí)

13、候，現(xiàn)象尤為明顯，甚至?xí)霈F(xiàn)無菌生長。因此，培養(yǎng)基應(yīng)放在50水浴中保溫。當(dāng)加入試驗(yàn)菌種混勻后，應(yīng)盡快加注到底層培養(yǎng)基上。在試驗(yàn)的時(shí)候，如果從大瓶內(nèi)用刻度吸管吸取帶菌培養(yǎng)基吸管中培養(yǎng)基量少極易冷卻，加在底層培養(yǎng)基上就不易均勻鋪開，導(dǎo)致菌層厚度不均，影響到抑菌圈的直徑。因此可以事先把配制好的培養(yǎng)基分裝在具塞試管內(nèi)，每管5mL，濕熱滅菌后放在50水浴鍋內(nèi)保溫(水浴溫度：細(xì)菌為4850，芽孢可至60)。試驗(yàn)中，再分別加入菌液混勻，配制成帶菌瓊脂。震蕩混勻后繼續(xù)保溫5min使培養(yǎng)基溫度回升，然后直接倒在底層培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)動雙碟使培養(yǎng)基均勻鋪開。放置小鋼管放置小鋼管時(shí)，注意管與管之間不能太靠近，否則會引起相

14、鄰的兩個抑菌圈之間的抗生素?cái)U(kuò)散區(qū)中的濃度增大，相互影響形成卵圓形或橢圓形抑菌圈。管與雙碟邊緣同樣也不能太靠近，因?yàn)橐好娼欁饔茫吘壍沫傊囵B(yǎng)基菌層為非平面，會影響抑菌圈的形狀。小鋼管放置時(shí)，要小心地從同一高度垂直放在菌層培養(yǎng)基上，不得下陷，不得傾斜，不能用懸空往下掉的方法。放置之后，不能隨意移動，要靜置5min，使之在瓊脂內(nèi)稍下沉降穩(wěn)定后，再開始滴加抗生素溶液。滴加抗生素溶液：注意標(biāo)準(zhǔn)品、供試品高、低劑量溶液滴加順序,保證滴加速度和加量的均勻一致.滴加抗生素要按照SHTHSLTL（二劑量法）或者SHTHSMTMSLTL（三劑量法）的順序滴加。滴加之前，滴管至少要用被滴液體沖洗3次。在滴加抗生

15、素到小鋼管的時(shí)候，由于毛細(xì)管內(nèi)抗生素溶液往往會有氣泡或者毛細(xì)管開口端有液體殘留，繼續(xù)滴加容易造成氣泡膨脹破裂，使溶液濺落在瓊脂培養(yǎng)基表面造成破圈。因此一旦毛細(xì)管中出現(xiàn)氣泡或者殘留，就重新吸取抗生素溶液進(jìn)行滴加，毛細(xì)管口應(yīng)避免太細(xì)，滴加的時(shí)候離開小鋼管口距離不要太高。TH樣品的高濃度SH標(biāo)品的高濃度SL標(biāo)品的低濃度TL樣品的低濃度滴加中若有濺出，可用濾紙片輕輕吸去，不致造成破圈。在滴加中還有可能出現(xiàn)抗生素溶液滴入小鋼管后，沒有與瓊脂培養(yǎng)基菌層接觸，有一段空氣被壓在溶液與培養(yǎng)基之間，這樣是不會產(chǎn)生抑菌圈的。此時(shí)可以小心的用滴管吸出小鋼管內(nèi)的抗生素溶液，棄去。換滴管重新滴加?？股厝芤旱渭雍?，液面應(yīng)

16、該與小鋼管管口齊平，液面反光呈黑色。（抗生素液體加入量不能按滴計(jì)算，即使同一滴管，每滴的量也有差異。）如果抗生素溶液滴加過滿，可以用無菌濾紙片小心吸去多余部分。雙碟的培養(yǎng)：根據(jù)培養(yǎng)溫度的要求在培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)箱中水平碟放的雙碟數(shù)以不超過三層為宜。滴加了抗生素溶液后的雙碟忌震動，要輕拿輕放。在搬運(yùn)到培養(yǎng)箱的過程中，可以預(yù)先在培養(yǎng)箱中墊上報(bào)紙鋪平，再把雙碟連同墊于桌上的玻璃板小心運(yùn)至培養(yǎng)箱，緩慢推入箱內(nèi)。雙碟在37下培養(yǎng)約16h。時(shí)間太短會造成抑菌圈模糊，太長則會使菌株對抗生素的敏感性下降，在抑菌圈邊緣的菌繼續(xù)生長，使得抑菌圈變小。在培養(yǎng)過程中，如果溫度不均勻（過于接近熱源），會造成同一雙碟

17、上細(xì)菌生長速率不等，使抑菌圈變小或者不圓。所以把雙碟放入培養(yǎng)箱時(shí)，要與箱壁保持一定的距離，雙碟疊放也不能超過3個。培養(yǎng)中，箱門不得隨意開啟，以免影響溫度。應(yīng)經(jīng)常注意溫度，防止意外過冷過熱。抑菌圈的測量：抑菌圈測量儀的使用,每組試驗(yàn)雙碟應(yīng)在相同的測量參數(shù)下進(jìn)行測量.硫酸慶大霉素顆粒劑，采取每組12只，同時(shí)做一份平行樣品，共做2組，試驗(yàn)后，剔除部分不合格品。采用抑菌圈自動測量分析儀ZY-300IV型，自動掃描出抑菌圈，測出直徑并計(jì)算出產(chǎn)品效價(jià)。（中國藥典2010版附錄XIV生物檢定統(tǒng)計(jì)法）結(jié)果的可靠性檢驗(yàn)及效價(jià)測定：抑菌圈測量儀提供計(jì)算結(jié)果.如低于估計(jì)效價(jià)的90%或高于估計(jì)效價(jià)的110%時(shí)，應(yīng)調(diào)整

18、其估計(jì)效價(jià)，重新試驗(yàn)。除另有規(guī)定外，本法的可信限率不得大于5%。1.試驗(yàn)菌需新鮮培養(yǎng)，傳代最好不超過5次,以防止菌種老化變異.芽孢桿菌培養(yǎng)物用滅菌水洗下后,應(yīng)在65加熱30分鐘,使菌體的菌齡一致,用革蘭氏染色,應(yīng)有芽孢85%以上.2.加入菌懸液的體積,一般不少于0.3ml,并且不大于上層培養(yǎng)基體積的2%.如果加入菌懸液的體積過小,則在同次實(shí)驗(yàn)中,不同次加入菌懸液的體積相差較大,造成實(shí)驗(yàn)誤差；如果加入菌懸液的體積過大,則會使上層培養(yǎng)基變稀,并且因菌懸液的溫度較低,加至培養(yǎng)基5操作要點(diǎn)中可能造成培養(yǎng)基結(jié)塊,影響測定結(jié)果.對于加入菌懸液體積的控制,可通過調(diào)節(jié)菌懸液的濃度來實(shí)現(xiàn).3.放置孵箱培養(yǎng)時(shí)排放

19、應(yīng)不得超過三層,避免因培養(yǎng)溫度不均勻而導(dǎo)致各雙碟中抑菌圈大小不一. 4.在制備菌層培養(yǎng)基時(shí),將菌液加入菌層培養(yǎng)基后,立即充分搖勻,但應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡. 5.標(biāo)準(zhǔn)品與供試品溶液濃度的比值應(yīng)控制在2%以內(nèi)，以保證兩者的濃度偏差在一定的范圍內(nèi)。6.培養(yǎng)基的PH值對試驗(yàn)結(jié)果影響很大，使用時(shí)培養(yǎng)基的PH值應(yīng)調(diào)節(jié)到適合該品種試驗(yàn)的最佳范圍。對氨基糖苷類堿性抗生素而言，在偏堿性條件下抗菌活性比較強(qiáng)，通常滅菌后的PH值范圍為7.8-8.0。如抑菌圈清晰，當(dāng)圈偏小時(shí)，可考慮把培養(yǎng)基的PH值調(diào)高至8.0.1.試驗(yàn)菌種：當(dāng)試驗(yàn)菌種中含有對抗生素敏感度不同的兩種或兩種以上的菌株時(shí)，由于各菌株的最低抑菌濃度不同，在形成抑

20、菌圈時(shí)可能出現(xiàn)雙圈及邊緣模糊不清，影響測量抑菌圈的準(zhǔn)確度。因此，應(yīng)定期將試驗(yàn)菌種進(jìn)行平板分離，經(jīng)涂片鏡檢后，挑選典型的單個菌落作為工作用菌種。陳舊的試驗(yàn)菌培養(yǎng)物也會使抑菌圈邊緣模糊，故試驗(yàn)時(shí)應(yīng)用新鮮制備的試驗(yàn)菌液。6檢定的影響因素2.培養(yǎng)基：培養(yǎng)基的質(zhì)量對抑菌圈的大小和清晰度都有影響，故對配制培養(yǎng)基用的幾種主要原材料如胨、牛肉膏、酵母膏及瓊脂等都應(yīng)通過預(yù)試驗(yàn)選擇適宜的品種使用。慶大霉素檢定用的培養(yǎng)基是號。3.雙碟的制備：鋪雙碟底層培養(yǎng)基時(shí)，培養(yǎng)基的溫度不宜過高，一般將融化后的培養(yǎng)基在室溫冷至約70時(shí)加入雙碟中為宜，否則加雙碟蓋后，底層培養(yǎng)基上會出現(xiàn)冷凝水。當(dāng)鋪菌層培養(yǎng)基時(shí)，由于冷凝水的局部冷卻

21、和稀釋作用，可使菌層培養(yǎng)基凝固后表面不平。菌層培養(yǎng)基一定要鋪均勻，這是決定抗生素效價(jià)測定的關(guān)鍵。故要求鋪菌層時(shí)一定要與鋪底層時(shí)雙碟的位置、方向相一致。制備菌層時(shí)，培養(yǎng)基的溫度不要過高，受熱時(shí)間也不宜過長，特別是一些對熱敏感的試驗(yàn)菌更要注意。否則，可使試驗(yàn)菌部分或全部被殺死，導(dǎo)致抑菌圈破裂或甚至無抑菌圈形成。因此，一定要按規(guī)定控制菌層培養(yǎng)基的溫度。在雙碟培養(yǎng)基上放置小鋼管的距離要合適。當(dāng)距離太小而抑菌圈又太大時(shí)，則相鄰兩個抑菌圈之間的抗生素?cái)U(kuò)散區(qū)中抗生素的濃度增大，形成互相影響的卵圓形或橢圓形抑菌圈。在滴加抗生素溶液至小鋼管時(shí)，若毛細(xì)滴管口不圓整或有小缺口，或管內(nèi)有氣泡，均可使抗生素溶液從管口濺

22、出；若加液太滿，溶液會從小鋼管口溢出；小鋼管底部不平，溶液會從底部漏出。以上原因均會造成抑菌圈不圓整或破裂成桃形。防止的辦法是滴管口要圓整，管口不能太細(xì)，管內(nèi)不能有氣泡，加液時(shí)滴管口離校鋼管的距離不能太高，小鋼管兩端面要平。4.雙碟的培養(yǎng)溫度和時(shí)間：培養(yǎng)箱的溫度要均勻，每組雙碟要放在同一層盤內(nèi)，在培養(yǎng)過程中，不要開啟培養(yǎng)箱，以免影響培養(yǎng)箱內(nèi)的溫度。雙碟的培養(yǎng)時(shí)間也與抑菌圈的清晰度有關(guān)。5.抗生素污染：無抑菌圈形成的原因，大多由于抗生素污染所致。因此，在進(jìn)行抗生素效價(jià)測定時(shí)，要嚴(yán)防抗生素污染。防止的辦法是將配置和稀釋抗生素溶液所用的容器與制備培養(yǎng)基所用的容器嚴(yán)格分開，切不可將抗生素溶液撒于地面，以免抗生素附著在微小塵埃上隨風(fēng)飄落在雙碟瓊脂培養(yǎng)基上，而造成抑菌圈破裂或無抑菌圈形成。6.標(biāo)準(zhǔn)品：抗生素微生物檢定發(fā)的實(shí)驗(yàn)采用標(biāo)準(zhǔn)品與供試品對比試驗(yàn)的平行線原理。因此，要求標(biāo)準(zhǔn)品與供試品必須是同質(zhì)的抗生素。如標(biāo)準(zhǔn)品與供試品所含的活性物質(zhì)不同，則標(biāo)準(zhǔn)品和供試品的兩條劑量反應(yīng)線不成平行直線關(guān)系，就不能按平行線原理計(jì)算效價(jià)。各種抗生素都有它同質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品，決不能用這一型抗生素組分制備的標(biāo)準(zhǔn)品，去測定另一型抗生素的供試品。7.抑菌圈質(zhì)量的控制（1）抑菌圈的性狀試驗(yàn)中，常有抑菌圈破裂，不圓，甚至破圈的情況，其原因是多方面的：在滴加抗生素溶液時(shí)，藥液濺出、毛細(xì)滴管碰到鋼管