PCR技術(shù)及習(xí)題

1、PCR技術(shù)及習(xí)題PCR（polymerase chain reaction）：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)1、PCR原理：在解旋酶作用下，打開(kāi)DNA雙鏈，每條DNA單鏈作為母鏈，以4中游離脫氧核苷酸為原料，合成子鏈，在引物作用下，DNA聚合酶從引物3'端開(kāi)始延伸DNA鏈，即DNA的合成方向是從子鏈的5'端自3'端延伸的。實(shí)際上就是在體外模擬細(xì)胞內(nèi)DNA的復(fù)制過(guò)程。DNA的復(fù)制需要引物，其主要原因是DNA聚合酶只能從3端延伸DNA鏈。2、PCR反應(yīng)過(guò)程是：變性復(fù)性延伸類(lèi)似于DNA的天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴(lài)于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火（復(fù)性）-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步

2、驟構(gòu)成：模板DNA的變性：當(dāng)溫度上升到90以上時(shí)，雙鏈DNA解聚為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；模板DNA與引物的退火（復(fù)性）：溫度下降到50左右，兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合；引物的延伸：72左右時(shí)，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新鏈由5'端向3'端延伸。3、結(jié)果：上述三步反應(yīng)完成后，一個(gè)DNA分子就變成了兩個(gè)DNA分子，隨著重復(fù)次數(shù)的增多，DNA分子就以2n的形式增加。PCR的反應(yīng)過(guò)程都是在PCR擴(kuò)增儀中完成的。4、細(xì)胞被DNA復(fù)制與PCR技術(shù)的比較：細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制體外DNA擴(kuò)增（PCR）不同點(diǎn)解旋在解旋酶作用下邊解旋邊復(fù)制80100

3、高溫解旋，雙鏈完全分開(kāi)酶DNA解旋酶、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶引物RNADNA、RNA溫度體內(nèi)溫和條件高溫相同點(diǎn)需提供DNA模板四種脫氧核苷酸為原料子鏈延伸的方向都是從5'端到3'端知識(shí)點(diǎn)撥：1、DNA分子復(fù)制的人工控制解開(kāi)螺旋：在80100時(shí)，DNA雙螺旋打開(kāi)，形成兩條DNA單鏈，稱(chēng)為變性?；謴?fù)螺旋：在5060左右時(shí)，兩條DNA單鏈重新形成雙螺旋結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為復(fù)性。復(fù)制條件：緩沖液，DNA模板、四種脫氧核苷酸、熱穩(wěn)定DNA聚合酶、兩種引物。控制儀器：PCR儀（溫度周期性自動(dòng)調(diào)節(jié)儀）。2、PCR的含義是多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。3、PCR技術(shù)反應(yīng)的條件：穩(wěn)定的緩沖溶液環(huán)境（一般使用Tr

4、is-Cl緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)的為10mmol/L,并將其調(diào)節(jié)到8.38.8之間）；DNA模板；合成引物（2個(gè)）；四種脫氧核甘酸；DNA聚合酶；溫控設(shè)備4、PCR技術(shù)最突出的優(yōu)點(diǎn)是快速、高效、靈活、易于操作。5、TaqDNA聚合酶的特點(diǎn)是：耐高溫。知識(shí)拓展：1、DNA聚合酶不能夠從頭合成DNA，只能從DNA的3'端開(kāi)始延伸DNA鏈，因此DNA復(fù)制需要引物。2、引物: 引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設(shè)計(jì)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴(kuò)增。3、PCR引物設(shè)計(jì)原則：（1

5、）PCR引物通常長(zhǎng)15-25堿基，其中GC約占50%。（2）引物之間不能互配形成雙鏈結(jié)構(gòu)，引物內(nèi)部也不能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。（3）引物的3末端必須與目的片段完全相配。（4）引物的5末端可以不與目的片段互補(bǔ)，可以包含內(nèi)切酶位點(diǎn)或啟動(dòng)子序列，但在下一輪反應(yīng)中，這些序列會(huì)被同樣合成習(xí)題訓(xùn)練1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR技術(shù))是在實(shí)驗(yàn)室中以少量樣品DNA制備大量DNA的生化技術(shù)，反應(yīng)系統(tǒng)中包括微量樣品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4種脫氧核苷酸及ATP等。反應(yīng)中新合成的DNA又可以作為下一輪反應(yīng)的模板，故DNA數(shù)以指數(shù)方式擴(kuò)增，其簡(jiǎn)要過(guò)程如右圖所示。微量DNA樣品DNA互補(bǔ)鏈分離開(kāi)為單鏈以單鏈為模板合成子代D

6、NA循環(huán)重復(fù)（1）某個(gè)DNA樣品有1000個(gè)脫氧核苷酸，已知它的一條單鏈上堿基A:G:T:C=1:2:3:4，則經(jīng)過(guò)PCR儀五次循環(huán)后，將產(chǎn)生 個(gè)DNA分子，其中需要提供胸腺嘧啶脫氧核苷酸的數(shù)量至少是 個(gè)。（2）分別以不同生物的DNA樣品為模板合成的各個(gè)新DNA之間存在差異，這些差異是 。（3）請(qǐng)指出PCR技術(shù)與轉(zhuǎn)錄過(guò)程的三個(gè)不同之處： 。 。 。2通過(guò)DNA重組技術(shù)使原有基因得以改造的動(dòng)物稱(chēng)為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。運(yùn)用這一技術(shù)使羊奶中含有人體蛋白質(zhì)，下圖表示了這一技術(shù)的基本過(guò)程，在該工程中所用的基因“剪刀”能識(shí)別的序列和切點(diǎn)是一GGATCC一，請(qǐng)回答：（1）從羊染色體中“剪下”羊蛋白質(zhì)基因的酶是 。人體蛋白質(zhì)基因“插入”后連接在羊體細(xì)胞染色體中時(shí)需要的酶是 。（2）請(qǐng)畫(huà)出質(zhì)粒被切割形成黏性末端的過(guò)程圖。（3）人體蛋白質(zhì)基因之所以能“插入”到羊的染色體內(nèi)，原因是 ，“插入”時(shí)常用的工具是 。3下面甲圖中DNA決定某一多肽鏈中的酪氨酸和丙氨酸過(guò)程示意圖，乙圖示樣品 DNA經(jīng)PCR技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增，可以獲取大量DNA克隆分子。分析回答：（1）甲圖中含有 種核苷酸；丙氨酸的遺傳密碼子是 。該圖表示了DNA中遺傳信息的 過(guò)程。（2）有一種貧血癥是血紅蛋白分子的一條多肽鏈上，一個(gè)酪氨酸被一個(gè)苯丙氨酸所替代造成的。