CRISPR系統(tǒng)在植物研究中的應(yīng)用

1、植物保物研究方法論文題 目：現(xiàn)代技術(shù)在植物病理學(xué)中的應(yīng)用學(xué)院(系)：植物保護學(xué)院專業(yè)年級：植物病理學(xué)學(xué)生姓名：杜友偉學(xué) 號：2016050129CRISPR/cas基因編輯系統(tǒng)在植物病理學(xué)中的應(yīng)用摘要：基因組定點編輯是利用人工核酸酶，對復(fù)雜生物基因組特定位點快速而精確地進行遺傳改造的一項新技術(shù)。尤其是最近從細菌和古細菌的獲得性免疫防御反應(yīng)中改造而來的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，因其簡單、廉價、高效以及通用的特性，目前已經(jīng)廣泛地應(yīng)用于植物、動物、微生物等各種生物體和細胞的基因功能和應(yīng)用研究中。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的原理在于其攜帶的Cas9核酸酶RNA導(dǎo)向的 dsDNA結(jié)合蛋白，能夠在靶位點

2、對雙鏈DNA 進行定點切割，隨后引發(fā)的非同源末端連接或者同源重組修復(fù)，導(dǎo)致了靶位點DNA的缺失、插入、替換甚至染色體大片段重排。關(guān)鍵詞：基因, CRISPR, 植物病理 Abstract：The clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR associated proteins(Cas9)system is a recently developed groundbreaking technology which enables the production of highly speci

3、fic genome modification with high efficiency and specificity. The CRISPR/Cas9 system is derived from the adaptive immunity system in bacteria and archaeas, it uses Cas9, a RNA-guided nuclease, to create double-strand breaks in the genomic loci of interest. The repair of breaks through either non-hom

4、ologous end joining or homonlogous recombination leads to insertions, deletions, replacements or larger chromosomal rearrangements at the desired sites of genome. The CRISPR/Cas9 system is facile, highly efficient and widely used in diverse cells and organisms, including the species that have tradit

5、ionally been a challenge in their genetic manipulations. Key words: Gene, CRISPR, Plant disease1. CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)1.1 CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)的發(fā)展 CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因組編輯技術(shù)，即一種由RNA介導(dǎo)的切割特異DNA片段的基因編輯系統(tǒng)引起了科學(xué)家們的注意。它依靠RNA引導(dǎo)序列與靶標DNA序列互補識別目標位點，僅需變化約20個核苷酸的序列就能靶向不同基因1-3。CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)源自于對細菌的免疫系統(tǒng)的研究，最早是日本科學(xué)家Nakata等4在

6、研究大腸桿菌時發(fā)現(xiàn)的一種特定的重復(fù)序列，但當時他們還不清楚其具體功能。后來人們發(fā)現(xiàn)這種重復(fù)序列廣泛存在于細菌和古細菌中，隨后科學(xué)家正式將其定義為CRISPR。2005年，多個研究團隊發(fā)現(xiàn)CRISPR間隔序列與噬菌體或質(zhì)粒等外源DNA序列高度同源5-7。2007年，Barrangou等8發(fā)現(xiàn)改變CRISPR中的重復(fù)序列能調(diào)節(jié)嗜熱鏈球菌(Streptococcus Thermophilus)對噬菌體的抗性，證實CRISPR/Cas系統(tǒng)使細菌通過獲取噬菌體DNA片段形成“記憶”，從而使細菌獲得再次遭到同一噬菌體入侵時對其免疫的能力。1.2 CRISPR/Cas系統(tǒng)基本結(jié)構(gòu)特征CRISPR/Cas系統(tǒng)

7、主要由CRISPR序列元件與CAS基因家族蛋白組成。CRISPR序列元件是一類獨特的DNA重復(fù)序列家族，由一些高度保守的重復(fù)序列和間隔序列相間排列組成。而 CAS基因家族蛋白是CRISPR序列附近一些高度保守的相關(guān)基因編碼的蛋白酶，具有核酸酶和切口酶活性，能對DNA序列進行特異剪切和修復(fù)9。隨著基因組學(xué)的迅速發(fā)展，CRISPR基本結(jié)構(gòu)也逐漸為人知曉。人們發(fā)現(xiàn)已測序的細菌基因組中約有40%包含CRISPR位點10。不同物種間CRISPR位點數(shù)目與重復(fù)序列的數(shù)目也有所不同11，但均包括4種序列（重復(fù)序列、間隔序列、Cas基因編碼序列、前導(dǎo)序列）。CRISPR中的重復(fù)序列是一組長度約2550個堿基對

8、組成的短小回文序列，能形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，重復(fù)次數(shù)最高可達數(shù)百次。間隔序列約為 2672個堿基對，它的位置在2個重復(fù)序列之間12。CRISPR位點一般在細胞染色體上，也有的在質(zhì)粒中10。在CRISPR位點附近還存在一系列CRISPR相關(guān)基因，Cas基因編碼一類高度保守的核酸相關(guān)的蛋白13。此外，在Cas基因和CRISPR位點第一個重復(fù)片段之間存在著CRISPR前導(dǎo)序列，該序列負責(zé)啟動CRISPR 轉(zhuǎn)錄。圖1 CRISPR基本結(jié)構(gòu)Fig.1 The basic structure of CRISPR1.3 CRISPR/Cas系統(tǒng)工作機理CRISPR系統(tǒng)是細菌為了對抗噬菌體和其他病毒的侵染而進化出的一

9、套免疫系統(tǒng)。CRISPR系統(tǒng)作用大致如下：噬菌體或其他病毒入侵后，宿主CRISPR系統(tǒng)識別外源DNA中特定的前間隔序列和前間隔序列鄰近基序。宿主將重復(fù)片段和這一段新的間隔序列整合進入CRISPR系統(tǒng)，插入在前導(dǎo)序列和原先第一個重復(fù)序列之間8, 14，形成“記憶”。加工前間隔序列的具體機制尚不明確。當同一噬菌體或病毒再次侵染時，CRISPR序列在前導(dǎo)序列引導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄出前crRNA，前crRNA接著被加工成小crRNA。這些crRNA與反式激活crRNA形成一種嵌合分子，被稱為sgRNA(Single guide RNA)。最后，在sgRNA的作用下，Cas蛋白復(fù)合體干擾入侵噬菌體DNA序列 ，從而

10、使得宿主免受同一噬菌體的侵害8。CRISPR位點的間隔序列與細菌對特定噬菌體的抗性相關(guān)。圖2 CRISPR系統(tǒng)作用機制Fig.2 The mechanism of CRISPR System2 CRISPR/Cas系統(tǒng)的應(yīng)用Jiang等152014年構(gòu)建了一個靶向人工合成的無功能的GFP基因的Cas9/sgRNA載體，無功能的GFP基因經(jīng)修飾后成為有功能的GFP基因，從而轉(zhuǎn)化成功的T1代植物中能觀察到葉片組織中的綠色熒光信號。對6個T1代單株后分離的42個T2代植株的分析表明，50%的T2代為單拷貝插入。這項研究還發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)基因編輯是在遺傳發(fā)育早期時完成的，并且完成修飾的位點

11、能穩(wěn)定遺傳至T2和T3代中。Brooks等16首次利用CRISPR/Cas系統(tǒng)建構(gòu)2個sgRNAs來敲除番茄SlAGO7基因，通過根癌農(nóng)桿菌法侵染番茄子葉獲得轉(zhuǎn)基因突變植株，對轉(zhuǎn)基因后代分析CRISPR/Cas在番茄中誘導(dǎo)的突變能夠穩(wěn)定遺傳給后代，但不排除存在脫靶效應(yīng)。Jiang等17利用水稻原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化Cas9/sgRNA建構(gòu)靶向細菌性疫病的易感基因，OsSWEET14和OsSWEET11的啟動子區(qū)域，測序結(jié)果顯示靶標位點發(fā)生突變。有學(xué)者研究了2種水稻白葉枯病菌株(Xanthomonas oryzae)的CRISPR盒序列，發(fā)現(xiàn)其中1個菌系的CRISPR盒中雖然包含1段匹配Xop411基因組

12、的間隔片段，但依舊對Xop411噬菌體敏感。深入研究發(fā)現(xiàn)Xop411中與X.oryzae CRISPR間隔區(qū)段匹配的原初間隔區(qū)段發(fā)生突變，這與之前在嗜熱鏈球菌及其噬菌體中觀察到的結(jié)果相似18。3 CRISPR/Cas系統(tǒng)的展望CRISPR/Cas9等新型基因編輯技術(shù)開啟了合成生物學(xué)時代19, 20。包括CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)在內(nèi)的新型生物技術(shù)有著廣闊的應(yīng)用前景。雖然這些技術(shù)本身不是問題，但如何用好這些新技術(shù)將是社會各界需要清醒認識的重要問題。在植物育種方面最大的問題在于通過這些技術(shù)產(chǎn)生的植物和相關(guān)產(chǎn)物是否受轉(zhuǎn)基因相關(guān)法律約束。從科學(xué)角度來講，新型植物育種方法產(chǎn)生的植物同經(jīng)典方法產(chǎn)生的

13、植物可能是不可分辨的，且不會帶來更高的健康與環(huán)境風(fēng)險，這為監(jiān)管工作帶來更大的挑戰(zhàn)21。此外，這些新型基因組編輯技術(shù)也引發(fā)了對專利等知識產(chǎn)權(quán)保護和社會倫理、法律等更多領(lǐng)域問題的思考22。參考文獻1 Mahfouz M M, Piatek A, Stewart C N. Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: challenges and perspectivesJ. Plant biotechnology journal, 2014, 12(8): 1006-1014.2 Lozano-Juste J, Cutler S R.

14、 Plant genome engineering in full bloomJ. Trends in plant science, 2014, 19(5): 284-287.3 Liu L, Fan X D. CRISPRCas system: a powerful tool for genome engineering J. Plant molecular biology, 2014, 85(3): 209-218.4 Nakata A, Amemura M, Makino K. Unusual nucleotide arrangement with repeated sequences

15、in the Escherichia coli K- 12chromosome J. Journal of bacteriology, 1989, 171(6): 3553-3556.5 Pourcel C, Salvignol G, Vergnaud G. CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studiesJ. Microbiology,

16、2005, 51(3): 653-663.6 Mojica F J, García- Martínez J, Soria E. Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements J. Journal of Molecular evolution, 2005, 60(2): 174-182.7 Bolotin A, Quinquis B, Sorokin A, et al. Clustered regularly interspa

17、ced short palindrome repeats (CRISPRs) have spacers of extrachromosomal origin J. Microbiology, 2005, 151(8): 2551-2561.8 Barrangou R, Fremaux C, Deveau H, et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes J. Science, 2007, 315 (5819): 1709-1712.9 Bland C, Ramsey T L, Sabree

18、F, et al. CRISPR recognition tool(CRT): a tool for automatic detection of clustered regularly interspaced palindromic repeats J. BMC bioinformatics, 2007, 8(1): 209.10 Klug A. The discovery of zinc fingers and their applications in gene regulation and genome manipulation J. Annual review of biochemi

19、stry, 2010, 79: 213-231.11 Wei C, Liu J, Yu Z, et al. TALEN or Cas9 rapid, efficient and specific choices for genome modifications J. Journal of Genetics and Genomics, 2013, 40(6): 281-289.12 Grissa I, Vergnaud G, Pourcel C. The CRISPRdb database and tools to display CRISPRs and to generate dictiona

20、ries of spacers and repeats J. Bmc Bioinformatics, 2007, 8(1): 172.13 Richter H, Randau L, Plagens A. Exploiting CRISPR/Cas:Interference mechanisms and applications J. International journal of molecular sciences, 2013, 14(7): 14518-14531.14 Marraffini L A, Sontheimer E J. CRISPR interference: RNA-di

21、rected adaptive immunity in bacteria and archaea J. Nature Reviews Genetics, 2010, 11(3): 181-190.15 Jiang W, Yang B, Weeks D P. Efficient CRISPR/Cas9- mediated gene editing in Arabidopsis thaliana and inheritance of modified genes in the T2 and T3 generations J. PloS one, 2014, 9(6): e99225.16 Broo

22、ks C, Nekrasov V, Lippman Z B, et al. Efficient Gene Editing in Tomato in the First Generation Using the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR- Associated9 System J. Plant physiology, 2014, 166(3):1292-1297.17 Jiang W, Zhou H, Bi H, et al. Demonstration of CRISPR/Cas9/sg RNA- mediated targeted gene modification in Arabidopsis, tobacco, sorghum and rice J. Nucleic acids research, 2013, doi: 10. 1093/nar/gkt780.18 Seme