水稻抗性轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展

1、5生物工程進(jìn)展62001,Vol.21,No.2水稻抗性轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展張祥喜1華志華2陳光宇1黃大年2(11江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物工程中心,江西南昌330200;21中國水稻研究所生物工程系,浙江杭州310006摘要隨著水稻遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的發(fā)展,通過基因工程手段獲得抗病蟲草害及逆境水稻品種成為可能。本文綜述了近年來國內(nèi)外水稻抗性轉(zhuǎn)基因的技術(shù)、方法和策略等研究現(xiàn)狀、發(fā)展趨勢、存在的問題及解決方法,對水稻抗性轉(zhuǎn)基因在水稻育種上的應(yīng)用也作了評價(jià)。關(guān)鍵詞轉(zhuǎn)基因抗性水稻水稻(O ryza sativa L.是世界上最重要的禾谷類作物之一,包括大多數(shù)發(fā)展中國家在內(nèi)約占總數(shù)40%的人口,其主要營養(yǎng)來源于水稻13

2、。但在水稻生產(chǎn)中,由于稻瘟病、紋枯病、白葉枯病,各種線蟲、病毒病,以及螟蟲、飛虱、葉蟬等病蟲草的為害和不良?xì)夂蚺c環(huán)境(逆境的影響,嚴(yán)重制約了水稻的高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn),從而直接威脅到人類的生存與發(fā)展39。實(shí)踐證明,培育和利用抗性品種是解決上述問題最經(jīng)濟(jì)有效的方法。但由于品種選育周期較長,抗性親本缺乏等原因,通過常規(guī)育種手段獲得抗性品種相當(dāng)困難。80年代以來,由于生物工程技術(shù)的興起和發(fā)展,特別是基因工程技術(shù)在改良作物抗性上的廣泛應(yīng)用,為培育抗性品種提供了新的手段,從而開辟了水稻抗性育種的新時(shí)代1,10。自1986年P(guān)owell Abel 等人首次獲得轉(zhuǎn)CP基因抗T M V煙草植株以后,第一批水稻轉(zhuǎn)基因植株

3、亦在1988年問世1112。水稻的抗性轉(zhuǎn)基因研究在過去的十幾年中取得了重大的進(jìn)展,某些抗性材料已完成生物安全性評價(jià),進(jìn)入了田間釋放和大田應(yīng)用階段,正向?qū)嵱没l(fā)展13。到目前為止,已報(bào)道成功地獲得抗性轉(zhuǎn)基因水稻植株的國家有中國、美國、菲律賓、英國、日本、印度等,其轉(zhuǎn)化技術(shù)日趨成熟、轉(zhuǎn)化頻率逐步提高,展示出巨大的應(yīng)用潛能和美好的前景。植物抗性轉(zhuǎn)基因一直是生物工程技術(shù)人員的研究重點(diǎn)。高效穩(wěn)定的水稻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立為外源基因轉(zhuǎn)入水稻創(chuàng)造了條件5。轉(zhuǎn)基因技術(shù)將水稻基因庫中不具有的抗性基因?qū)胨?實(shí)現(xiàn)了傳統(tǒng)育種方法無法實(shí)現(xiàn)的基因重組,大大提高了育種水平12。國內(nèi)外科學(xué)家對水稻抗性轉(zhuǎn)基因作了大量研究。目前,

4、水稻抗性基因的轉(zhuǎn)化方法以基因槍法為主,農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、PEG法、電擊法次之;許多重要的抗病、抗蟲、抗除草劑、抗環(huán)境脅迫等基因已從植物或其他生物中分離,應(yīng)用最多的抗性外源基因是bar基因、Bt毒蛋白基因、X a基因(包括X a4、Xa7、X a10、Xa21和G NA基因,其他如CpTI、C P、O C2 1$D86、Chitin、Pin2、Cecroption B、BA D H、HV A1基因應(yīng)用較少(表1。1抗病轉(zhuǎn)基因在現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中,研究者通過基因槍法、PEG 法、電擊法、花粉管通道法以及胚浸泡等方法將抗病基因?qū)胨净蚪M,獲得抗稻瘟病、白葉枯病、細(xì)菌性條斑病、線蟲病以及病毒病等轉(zhuǎn)基因水稻

5、當(dāng)代植株,有的研究還對抗病基因的遺傳與表達(dá)作了系統(tǒng)的分析。稻瘟病是水稻重要病害之一,各國科學(xué)家一直致力于抗稻瘟病基因的標(biāo)記、定位和克隆。最近,日本科學(xué)家Wang等13基于圖位克隆策略,成功地分離出一個(gè)對日本大多數(shù)稻瘟病菌生理小種具有高抗表現(xiàn)的Pib基因,分析了其結(jié)構(gòu)和標(biāo)記片段;同時(shí)用PEG法轉(zhuǎn)化感病品種Nipponbare,得到496株轉(zhuǎn)基因水稻植株,其中有112株對生理小種003表現(xiàn)抗性,進(jìn)一步的分子分析表明獲得/c230的轉(zhuǎn)化事件具有對稻瘟病的抗性;2個(gè)T2代株系的抗感分離比表現(xiàn)為3B1。作者沒有對轉(zhuǎn)基因植株作進(jìn)一步的田間試驗(yàn),但抗稻瘟病基因的克隆無疑對今后抗稻瘟病基因的遺傳轉(zhuǎn)化和品種選育

6、具有劃時(shí)代的意義。Lin等6用PEG法將CaM V35S啟動子驅(qū)動的幾丁質(zhì)酶基因(CHI11轉(zhuǎn)入秈稻品種Chinsurah Boro15的原生質(zhì)體,獲得了28株可育植株,Southern及生物測定結(jié)果表明,外源基因已整合并表達(dá)對水稻紋枯病的抗性;T1代分離比例大部分符合3B1分離規(guī)律。表1水稻抗性轉(zhuǎn)基因研究中的主要外源基因基因名稱作用應(yīng)用文獻(xiàn)Xa21抗白葉枯病基因抗水稻白葉枯病7,18 Cecropin B抗菌肽B基因抗水稻白葉枯病、細(xì)條病15,16C HI11幾丁質(zhì)酶基因抗水稻紋枯病等6Pib抗稻瘟病基因抗水稻稻瘟病13OC2I$D86半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因抗線蟲8C P外殼蛋白基因抗病毒

7、病19,20,21Pi n2馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因抗蟲5C pTI豇豆胰蛋白酶抑制基因抗蟲27cryIA(bB t毒蛋白基因抗鱗翅目昆蟲2,4,9,22,24G NA雪花蓮凝集素抗蟲26,27bar抗草丁磷基因抗PPT類除草劑,外源基因、選擇標(biāo)記基因2,3,5,15,16,25,26, 28,29,31,32,33,34, 39,42BAD H甜菜堿醛脫氫酶基因耐鹽38 HVA1胚胎發(fā)生后期豐富蛋白基因耐旱39,40目前在抗水稻細(xì)菌性病害轉(zhuǎn)基因研究方面比較成功的是抗菌肽基因、Xa21基因的遺傳轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)基因水稻對白葉枯病、細(xì)菌性條斑病的抗性明顯提高。黃大年1415、簡玉瑜等16用基因槍法將Cec

8、ropin B 基因?qū)刖竞投i稻品種,獲得了抗白葉枯病和細(xì)條病水平顯著提高的轉(zhuǎn)基因植株。華志華等17對轉(zhuǎn)CecropinB基因水稻T0T5代共6個(gè)世代的不同株系進(jìn)行抗白葉枯病分析,結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因水稻對白葉枯病的抗性在后代中得到遺傳,抗病性能傳至高世代(T4代,單株之間抗病性存在較大差異,并認(rèn)為其原因可能與Cecropin B基因的分離、丟失或基因沉默有關(guān)。Tu等7通過基因槍法將Xa21基因?qū)隝R72,獲得抗白葉枯病的轉(zhuǎn)基因植株,T1代獲得抗性基因遺傳并出現(xiàn)3B1的分離規(guī)律;進(jìn)一步用病菌小種4和小種6接種鑒定,結(jié)果表明T1代陽性植株抗白葉枯病。嚴(yán)成其等18通過花粉管通道法將含X a21廣譜抗

9、白葉枯病的1188(美國品種外源D NA轉(zhuǎn)入到1067等7個(gè)品種中,經(jīng)檢測部分供體D NA已整合到受體品種(系中。陳善葆等11也用花粉管通道法將水稻白葉枯病抗性供體品種早生愛國3號的D N A導(dǎo)入高感受體水稻品種856403中,得到了高抗白葉枯病的植株,并且能遺傳至24代。Vin等8用基因槍法將半胱氨酸蛋白酶抑制劑基因(OC2I$D86轉(zhuǎn)入非洲重要的水稻品種I TA212等,獲得對線蟲病的抗性。結(jié)果表明,所有品種的轉(zhuǎn)化頻率都達(dá)到8%以上,部分轉(zhuǎn)化株系分析表明,植株根部半胱氨酸蛋白的表達(dá)水平達(dá)到012%。轉(zhuǎn)基因植株可使線蟲的產(chǎn)卵量減少55%,這為M e loid2 o gyin inco gni

10、ta及其他線蟲病害的防治提供了一條新途徑。病毒外殼蛋白抗病毒病轉(zhuǎn)基因水稻的成功例子有:1991年日本獲得水稻品種Kinuhikari Nipponbai 轉(zhuǎn)RSV的CP基因工程植株,接種實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,轉(zhuǎn)基因植株在23周后,只有3%5%的發(fā)病率,而對照植株的發(fā)病率為9515%100%10。K ouassi 等19用基因槍法將RY M V的CP基因轉(zhuǎn)入粳稻品種臺北309的胚性愈傷組織中,獲得了對RY M V的抗性株系。Hayakaw a等20用電擊法將水稻條紋tenui 病毒的CP基因轉(zhuǎn)入兩個(gè)粳稻品種絹光、日本睛,R0及其自交后代均表現(xiàn)出高含量的C P蛋白及對病毒病傳染的抗性。Z heng等21將

11、RD V外殼蛋白基因S8轉(zhuǎn)入粳稻中華8號等,獲得轉(zhuǎn)基因植株,Southern 和Western印跡分析證實(shí),RD V S8基因已整合到水稻基因組,并在水稻中得到表達(dá)。2抗蟲轉(zhuǎn)基因利用生物工程技術(shù)將外源抗蟲基因?qū)胨?使水稻自身產(chǎn)生抗蟲蛋白而達(dá)到抗蟲目的成為可能。國內(nèi)外科技人員將外源基因如B t毒蛋白基因cryI A(b、豇豆胰蛋白酶抑制基因CpTI、雪花蓮凝集素G N A等轉(zhuǎn)入水稻,增強(qiáng)其對害蟲的抵抗力,取得了巨大的進(jìn)展,有的已進(jìn)入了田間試驗(yàn)階段。目前,16應(yīng)用最廣泛的抗蟲基因是蘇云金桿菌(Bac illus thuringiensisBt毒蛋白基因。它的表達(dá)產(chǎn)物與昆蟲腸道上皮紋緣細(xì)胞上的受

12、體位點(diǎn)結(jié)合,引起并破壞紋緣膜細(xì)胞滲透壓的平衡,使細(xì)胞裂解,對昆蟲產(chǎn)生特異殺傷作用10。其中用到的基因轉(zhuǎn)化方法主要是基因槍法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)法。舒慶堯等22用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將密碼子經(jīng)優(yōu)化的cryIA(b基因?qū)胄闼?1,獲得高抗二化螟、稻縱卷葉螟的轉(zhuǎn)c ryIA(b基因品系TS5、T S9等(命名為克螟稻,并檢測出其Bt毒蛋白的含量占可溶性蛋白的015%3%,對15齡幼蟲的毒殺作用達(dá)到100%;謝道昕等23采用花粉管通道法成功地將Bt 基因?qū)胨酒贩N中花11號,獲得了轉(zhuǎn)基因水稻植株,分子雜交技術(shù)證明殺蟲基因已整合到水稻基因組中。Datta等4研究了啟動子對抗蟲蛋白基因cryIA (b的遺傳和表達(dá)的影

13、響。將分別由CaM V35S和Actin21啟動子,以及兩種組織特異型啟動子(pith, PEPC構(gòu)成的啟動子驅(qū)動的cryIA(b基因,用基因槍法轉(zhuǎn)入12個(gè)水稻品種的原生質(zhì)體,得到1800株轉(zhuǎn)Bt基因水稻植株。Southe rn分析顯示至少100株獨(dú)立轉(zhuǎn)化的植株中整合有cryI A(b基因。由PEPC啟動子驅(qū)動的轉(zhuǎn)化植株,CryI A(b蛋白在綠色組織(如葉和莖中高效表達(dá),首次報(bào)導(dǎo)了避免組成型啟動子導(dǎo)致抗蟲蛋白在水稻種子和其它組織中的不必要表達(dá)的策略。對超過800株Southern陽性植株進(jìn)行了生物測定,結(jié)果81株轉(zhuǎn)基因植株對三化螟幼蟲的致死率為100%。此外,世界各地還有許多實(shí)驗(yàn)室開展了Bt

14、抗蟲蛋白轉(zhuǎn)基因研究工作。Wu等9利用基因槍法將Actin21啟動子驅(qū)動的cryI(b基因?qū)刖九_北309的愈傷組織,獲得了可育的轉(zhuǎn)基因植株,對三化螟的抗性明顯增強(qiáng)。Joachim等2也用基因槍法將cryIA (b基因轉(zhuǎn)入秈稻品種IR58,R0、R1、R2代植株對幾種鱗翅目昆蟲具有明顯的殺蟲效果,對三化螟、二化螟的殺蟲效果達(dá)到100%,對稻縱卷葉螟、M arasmia suppressalis也有抑制取食作用。Alam等24用基因槍法將cryIA(b基因?qū)攵i稻品種Vaidehi中,轉(zhuǎn)基因的遺傳在T1代植株中得到證實(shí);抗蟲性測定結(jié)果,轉(zhuǎn)基因植株對三化螟的抗性也增強(qiáng)了。除B t抗蟲蛋白轉(zhuǎn)基因研究

15、外,研究者還開展了馬鈴薯蛋白酶抑制劑基因(pin2、雪花蓮凝集素基因(G N A、大豆胰蛋白酶抑制基因(C TI、豇豆胰蛋白酶抑制基因(CPTI,以及玉米胱蛋白基因(corn cystain等轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的研究,以期獲得穩(wěn)定遺傳和表達(dá)的高抗抗蟲水稻5,2527。3抗除草劑轉(zhuǎn)基因抗除草劑基因工程是生物技術(shù)的一個(gè)重要領(lǐng)域?？钩輨┗蛟谥参镞z傳轉(zhuǎn)化中經(jīng)常作為標(biāo)記基因使用,因此是植物基因工程上涉及最多的領(lǐng)域之一,所取得的成效也最明顯。bar是水稻抗除草劑轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用最多的一個(gè)基因。1992年Cao等人獲得了對除草劑Batsta 具有抗性的轉(zhuǎn)基因水稻植株28。中國水稻研究所朱冰等29等利用基因槍

16、法將bar基因?qū)刖┮?19和中百4號的幼胚,獲得了可育的抗Basta的水稻植株,T0代轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)了對Basta的抗性,后代抗感分離比例不符合孟德爾遺傳分離規(guī)律,推斷bar 基因有可能是雙拷貝并處于非緊密連鎖狀態(tài)。經(jīng)過多年培育,現(xiàn)已成功獲得抗Basta轉(zhuǎn)基因水稻穩(wěn)定品系,并配置了多個(gè)抗除草劑轉(zhuǎn)基因雜交水稻組合,近年獲準(zhǔn)在浙江、四川、江西等省較大面積釋放。Sun 等30繼黃大年、朱冰等的工作之后,將抗Basta的京引119轉(zhuǎn)基因當(dāng)代植株用花藥培養(yǎng)獲得轉(zhuǎn)基因純系,加快轉(zhuǎn)基因植株穩(wěn)定株系的獲得。用類似的方法,許新萍等31、鄧小梅等32的研究豐富并發(fā)展了bar基因的遺傳轉(zhuǎn)化。Oard等3用基因槍法

17、將bar基因與抗潮霉素基因hpt共轉(zhuǎn)化遺傳背景不同的Gulfmont、IR72、Koshi2 hihari水稻品種,獲得抗除草劑Basta的轉(zhuǎn)基因水稻。S outhern及Northern印跡分析表明,外源基因已整合并穩(wěn)定表達(dá)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)bar基因在轉(zhuǎn)錄水平上有沉默現(xiàn)象。田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因株系是正?？捎?但有近一半的轉(zhuǎn)基因植株在穗期、株高、產(chǎn)量與親本有顯著差異。一般情況下,G ulf mont轉(zhuǎn)基因株系對除草劑抗性比Koshihihari的強(qiáng),這就意味遺傳背景對bar基因的表達(dá)具有重要作用。Rathore等33利用bar作為選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體,也獲得了抗Basta的轉(zhuǎn)基因植株,T0

18、代自交可育,并且認(rèn)為bar既是一個(gè)有用的選擇標(biāo)記基因,又能表現(xiàn)對除草劑的抗性。T oki等34的研究也取得了類似的結(jié)果。有意思的是,Tada等35、Uchimiya等36將轉(zhuǎn)bar 基因水稻用Basta處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Basta可以防止白葉枯病及稻瘟病病菌的侵染,因而能減輕兩病的發(fā)病癥狀,這為雜草防除和病害防治相結(jié)合創(chuàng)造了一條新思路。17此外,Li等37利用抗磺酰脲(sulfonylureaALS 基因(csr121作為一種新的選擇標(biāo)記,獲得了可育的抗磺酰脲類除草劑轉(zhuǎn)基因水稻植株。4抗逆轉(zhuǎn)基因逆境是限制植物生長、影響產(chǎn)量形成的重要因素之一?？鼓婊虻姆蛛x、克隆、轉(zhuǎn)化一直受到科學(xué)家們的高度重視。目

19、前已分離出大量的抗逆相關(guān)基因,并在抗逆基因的遺傳轉(zhuǎn)化中取得了明顯的成績。郭巖等38用基因槍法將來源于含鹽生植物菠菜BAD H基因?qū)胨酒贩N中花8號等,提高其耐鹽性。在溫室015%NaCl鹽池中移栽的99株轉(zhuǎn)基因植株,19株結(jié)實(shí),而對照受鹽害現(xiàn)象明顯,幾乎全部枯萎。Xu等39將來源于大麥的胚胎發(fā)生后期豐富蛋白基因(L ea,HA V1,用基因槍法導(dǎo)入水稻懸浮細(xì)胞系,獲得了大量的轉(zhuǎn)基因植株,HAV1基因在水稻Actin21啟動子的驅(qū)動下在水稻根和葉片細(xì)胞中大量表達(dá);第二代轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出明顯抵抗干旱和鹽漬的能力,并據(jù)此認(rèn)為可以通過使轉(zhuǎn)基因植株積累Lea來提高非鹽生植物的抗鹽性。Q u等40也獲得

20、了類似的研究結(jié)果。Yokoi等41用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將來源于擬南芥的丙三醇232磷酸2脂?；D(zhuǎn)移酶基因(G PA T的cD NA 轉(zhuǎn)入水稻中,轉(zhuǎn)基因植株葉片中的不飽和脂肪酸含量比對照高出28%,光合作用效果比野生型高20%,據(jù)此研究認(rèn)為導(dǎo)入擬南芥屬GP AT的cD N A可以大大提高不飽和脂肪酸的含量,并賦予水稻光合作用的耐寒性。Su等42等用基因槍法將HVA22基因轉(zhuǎn)入水稻品種Kenf ong中,獲得了能穩(wěn)定表達(dá)脫水壓力調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)基因水稻植株。5水稻抗性轉(zhuǎn)基因研究中存在的問題與對策對于保護(hù)生態(tài)平衡、食物鏈的穩(wěn)定及減少環(huán)境污染,賦予農(nóng)作物以自身的抗性是最理想的防治病蟲草害及逆境的策略。轉(zhuǎn)基因水稻雖然

21、對病蟲草害及逆境可產(chǎn)生很大的抗性,但一個(gè)潛在的問題是抗性的持久性,因而保持轉(zhuǎn)基因植株的抗性穩(wěn)定性就顯得非常重要。對解決這一問題,國內(nèi)外的相關(guān)對策有:(1在同一植物中轉(zhuǎn)入多個(gè)抗性基因,如可以考慮將豇豆胰蛋白酶抑制基因(CpTI和慈姑蛋白酶抑制基因(API導(dǎo)入水稻,培育多種單基因抗蟲品種或多基因抗蟲品種;(2利用特異性的啟動子、內(nèi)含子片段,增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平;(3合理種植利用轉(zhuǎn)基因抗性水稻,以解決轉(zhuǎn)基因水稻抗蟲持久性問題。在轉(zhuǎn)化技術(shù)方面,還存在基因轉(zhuǎn)化頻率相對較低、實(shí)驗(yàn)成本較高、基因型依賴性強(qiáng)、容易發(fā)生基因沉默現(xiàn)象等問題,限制了這一技術(shù)的廣泛開展。目前的轉(zhuǎn)化技術(shù)所導(dǎo)入的外源基因拷貝數(shù)往往較多,

22、在后代中容易丟失,對片斷較大的外源基因難以導(dǎo)入,更未達(dá)到外源基因定性、定量、定位轉(zhuǎn)入的水平;基因沉默在轉(zhuǎn)基因植物中是一個(gè)很普遍的現(xiàn)象,給植物基因工程產(chǎn)物的商品化、產(chǎn)業(yè)化帶來了潛在的威脅14。因此抗性基因工程的研究還有待進(jìn)一步深入。轉(zhuǎn)基因水稻的安全性,一直是各國政府及研究人員十分重視的問題。要警惕水稻抗除草劑基因漂移到紅稻等雜草中去。此外,目前尚未見有針對水稻稻瘟病、紋枯病、粘蟲等病蟲害特異性基因的報(bào)道,應(yīng)加強(qiáng)主要病蟲害抗性基因的基礎(chǔ)研究。盡管目前的水稻轉(zhuǎn)基因研究存在上述諸多困難與問題,但近幾年轉(zhuǎn)基因水稻已在生產(chǎn)中逐漸顯示其應(yīng)有的威力。相信在21世紀(jì)初期水稻抗性轉(zhuǎn)基因會在生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用。參考

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