組合型人工肝的研究進展

1、組合型人工肝的研究進展         05-12-16 14:34:00     作者：佚名    編輯：studa9ngns摘 要: 近年來以生物人工肝為主附加血或血漿灌流組成的體外的組合型人工肝輔助裝置，成為研究最多的、最有希望的人工肝。本文就此型人工肝的意義，研究近況、存在的問題與前景作了綜述。 1、導 言 近年來，人工肝的研究有了很大的進展。目前分為四型：（）非生物型；（）中間型；（）生物型；（）組合型1。研究最多的是組合型人

2、工肝裝置（Hybrid artificial Liver Device ,HALD）,亦稱組合型人工 肝支持系統(tǒng)（Hybrid Artificial Liver Support System,HALSs），是由型加型或型加型組成。這是因為過去40多年里，人們先后嘗試了血液透析、血液透析濾過、血或血漿灌流、血漿置換、活性炭灌注、交叉循環(huán)、交換輸血及整體洗滌等多種形式的人工肝輔助裝置，用這些方法雖然改善病人的神經(jīng)狀況，但不能改善其生率2。因此，人們認識到用肝細胞的生物肝才是較理想的人工肝。而生物肝雖然能較好地替代肝臟的解毒與生物合成功能，但急性肝衰竭患者體內(nèi)積累的大量代謝產(chǎn)物及毒性物質(zhì)，難以在有限

3、的交換中由肝細胞來解毒，反過來還可能對培養(yǎng)肝細胞的存活及生物學功能產(chǎn)生不利影響，如將生物人工肝與偏重于解毒作用的人工肝結(jié)合起來，可使人工肝輔助裝置的作用更完善。目前報道最多的是生物人工肝加上血或血漿灌流裝置，后者內(nèi)置活性碳或樹脂等吸附劑3。 2、組合型人工肝的適應證意義 就目前所知，肝臟至少有600多種酶。在醫(yī)學領域里有很少情況比急性肝功能衰竭更具有破壞性，這是因為會細胞的壞死破壞了肝臟的合成，代謝、解毒和排泄功能與途徑，導致高達80%的死亡率1，4。在未來人工肝有可能成為治療急性肝功能衰竭的主要手段之一，通過下列途徑得以治療，并包括治療一些相關的疾病：（1）肝組織再生，如果肝臟以前的結(jié)構(gòu)與功

4、能是正常的，暴發(fā)性肝衰幸存者的肝組織可以完全再生，同時人工肝的肝細胞可分泌一些促再生的物質(zhì)如肝細胞生長因子返回到病人肝臟中，促進肝細胞的再生，因此人工肝有可能維持肝衰病人存活，一直到肝細胞再生與功能恢復。（2）肝移植的橋梁：盡管肝移植術是目前治療肝功能衰竭的唯一有效辦法，但受嚴重的器官短缺所限制。一個理想的人工肝有可能通過支持肝功能來解決移植前的重在難題，直到有一個合適的供肝被移植。（3）治療肝移植后的最初無功能（PNF）。（4）提高再移植的存活率：如果人工肝能使肝的急癥再移植手術變成擇期手術的話，可提高再移植肝的存活率5。（5）有助于行肝葉吸量切除術，肝葉極量切除術后用人工肝支持其功能，使病

5、人渡過危險期一直到肝組織再生。（6）人工肝可減少肝癌化療的毒性作用。（7）有可能治療和預防慢性肝功能衰竭的失代償5。 3、組合型人工肝研究的現(xiàn)況 目前大多數(shù)組合型人工肝包括生物成分、生物反應器和血或血漿灌流三個部分3，6。 3.1 生物成分 為了替代肝臟的功能，曾試用了肝臟的切片、細片、凍干粉沫、肝細胞酶等，但因其機能短且質(zhì)量低，現(xiàn)很少應用。目前所用的多為動物或人的肝細胞。 3.1.1 細胞來源 動物肝細胞中豬肝細胞為首選。雖然分離后的肝細胞在體外很少增生，但來源是無限的。盡管動物試驗與臨床有可喜的報告。但問題是動物肝細胞所合成的物質(zhì)能否完全取代人的相應物質(zhì)，并且異基因蛋白和酶進入到血循環(huán)中也

6、能出現(xiàn)副作用4，7。用人的肝細胞似乎是理想的，然而體外分化的肝細胞很少增值，因而其來源成了問題?，F(xiàn)常用的人肝細胞系是肝細胞瘤或肝胚細胞瘤，它們具有腫瘤的基因特征，雖然能表達一些特殊的酶且能合成一些蛋白和尿素，但這些細胞提供葡萄糖和代謝乳酸以及合成尿素的能力是很低的，同時對這些細胞引起的危險和副作用知甚少8。可行的事實是可以改變它們的基因型和表現(xiàn)型以及形成亞克隆，而仍具有分化功能。另一種希望是將來弄清肝細胞增生和分化的機制，在此基礎上通過基因工程在體外產(chǎn)生理想的穩(wěn)定肝細胞系并貯存起來，當需要 時用分化因子刺激；這種技術在其它高度分化的細胞中已經(jīng)應用。用胎兒肝細胞在試管內(nèi)增生并很可能被刺激而分化，

7、這需要一些關于肝細胞分化的基礎研究，也涉及到倫理問題。 3.1.2 細胞培養(yǎng) 在肝細胞單層培養(yǎng)中，盡管維持了幾種重要的代謝功能。但細胞在24小時內(nèi)失去了連接，在5天內(nèi)失去特殊功能，于1-2周內(nèi)死亡。以后由于認識到了肝細胞與肝細胞之間、肝細胞與基質(zhì)間的相互作用對于肝細胞保持分化功能與活性非常重要，使培養(yǎng)了的肝細胞經(jīng)長時間的也能保持其功能2，10。這是肝細胞培養(yǎng)技術的一個重要突破，因而使動物試驗與臨床有初步的效果。新改進的技術在培養(yǎng)基質(zhì)中加有生長因子、激素和細胞外的基質(zhì)成分以及與肝非實質(zhì)細胞共同培養(yǎng)。培養(yǎng)技術由最初的單層培養(yǎng)發(fā)展到不同的方法如多層平板型、膠原三明治狀、球型聚集肝細胞、微囊肝細胞、微

8、載體肝細胞培養(yǎng)、聚乙酰內(nèi)酯培養(yǎng)等2，11。分離后的肝細胞需要固定在載體基質(zhì)上如微載體、或多孔材料如樹脂、或多孔微載體、微型海棉等，其它固定化技術包括將肝細胞置于水凝膠中。目前多用的是將細胞固定后粘附到中空細纖維壁外或腔內(nèi)培養(yǎng)6。 3.2 生物反應器 3.2.1 生物反應器的設計要求： 一個理想的生物反應器應包括以下基本內(nèi)容：（1）細胞培養(yǎng)技術：生物反應器不僅能滿足細胞量的需求，并且應提供足夠的膜面積以供肝細胞固定和培養(yǎng)。（2）膜的特性：應保護植入的肝細胞不被宿主排斥，阻止病人血中的抗體和免疫成分進入?，F(xiàn)已證實膜截留物質(zhì)的分子量在5-10萬間能有效地阻止免疫成份。期待一種多孔的，海棉狀的和相當親

9、水性的膜，以使細胞更易粘附和發(fā)揮更大的功能。（3）生物物應器的生物相容性：如同血液透析器一樣，膜的選擇和內(nèi)裝的物質(zhì)不應引起病人的生化和免疫反應。（4）膜的彌散：生物反應器應保證成功地去除血中的毒素并使肝的特殊因子返回到病人的血中12。 3.2.2 生物反應器的類型 目前應用最多的生物反應器仍為中空纖維，所用半透膜多是醋酸鹽纖維素膜和纖維蛋白修飾的多聚砜膜。根據(jù)培養(yǎng)形式分為兩大類：一類是細胞培養(yǎng)在中空纖維或毛細管內(nèi)腔，另一類是細胞培養(yǎng)在膜外腔。臨床治療效果至少取決于三種因素，即細胞培養(yǎng)技術膜的特性和生物反應器的構(gòu)型。 常見的生物反應器構(gòu)型包括：（1）細胞培養(yǎng)在中空纖維腔內(nèi)凝膠床中：Nyberg等

10、于1992年提出將原代肝細胞和膠原凝膠混合后植入中空纖維管內(nèi)，當凝膠收縮時在腔內(nèi)形成一通道，利用此管道來增加細胞的營養(yǎng)，血液或血漿通過膜外循環(huán)，并產(chǎn)生第二個層流以減少血膜的界面與濃縮界面之間的阻力，也減少血凝塊的形成；缺點是流動液體中的濃度級差可使凝膠深部的細胞營養(yǎng)不足和代謝產(chǎn)物累積。（2）細胞培養(yǎng)在中空纖維膜外：1972年Gullino等報告了分離的哺乳細胞能夠成功地培養(yǎng)在中空纖維壁外，這些管排列在一個殼內(nèi)，即殼一管構(gòu)形，血液于管腔內(nèi)循環(huán)灌注，血液中的毒性物質(zhì)可通過半透膜而代謝，肝細胞分泌的營養(yǎng)成分進入血中。優(yōu)點是細胞容易且很快地種植，細胞的植入量不受管內(nèi)徑的限制，因此細胞群和微載體附的肝細

11、胞已培養(yǎng)在這型的生物反應器上，并且已商業(yè)化12。（3）細胞在毛細管膜編織的網(wǎng)間培養(yǎng)：這一生物反應器的概念于1993年由Gerlch等提出，其主要組成是用毛細管編織成墊，形成三個平面，每個平面呈90度角形成三維結(jié)構(gòu)，三個平面分別運輸氧、營養(yǎng)物質(zhì)和血漿，肝細胞培養(yǎng)在管膜外，且可與細胞外基質(zhì)或其它哺乳細胞共同培養(yǎng)13。已有報道，此種反應器的細胞密度可高達2.5×109/ml，細胞的功能達到5周之久14。優(yōu)點是運輸?shù)难鯇⒐┙o血漿，同時隨著濃度差也可營養(yǎng)肝細胞。同樣，營養(yǎng)物質(zhì)亦能供給血漿中相當數(shù)量的細胞而不依賴于溶質(zhì)的濃度。不同的膜墊組合，甚至在同一組中不同的膜墊，在不同的壓力下可以促使通過細

12、胞彌散對流來運輸高分子量的溶質(zhì)和迅速補給所消耗的溶質(zhì)。溶質(zhì)也隨著單純的彌散使其彌散能力極大地增強。然而這一現(xiàn)代化的裝置至今沒有得到臨床應用，并且關于動物試驗的效果知之甚少12。 3.3 血或血漿灌流 為了輔助生物肝的解毒功能，目前臨床上試用的組合型人工肝多是用血漿分離后通過活性炭或樹脂來吸附毒性物質(zhì)再灌注到中空 纖維中。血漿通過灌流去除中、大分子物質(zhì)?；钚蕴吭谠缙诘难芯恐幸壮霈F(xiàn)肺梗塞和出血傾向，以后出現(xiàn)了活性炭微囊以及將此微囊固定在氨基甲酸乙脂膜上等形式，使其發(fā)展較快。樹脂對于有毒物質(zhì)的清除有專一性能，因此是有前途的吸附材料。 4、組合型人工肝的動物試驗與臨床應用 盡管組合型人工肝有不同的類型

13、，但基本結(jié)構(gòu)是相似的，即血或血漿進入到含有肝細胞的生物反應器中，再返回到病人血中，其循環(huán)上再加上一個輔助解毒的裝置。第一個臨床試用組合型人工肝的是Matsumura，他于1987年報道了用血液透析裝置內(nèi)置兔的肝細胞，治療了一例沒有手術的膽管癌患者，使其膽紅素下降并使肝性腦病得到了改善。次年Uchino等報道了用組合型人工肝治療無肝犬，他用犬的肝細胞培養(yǎng)在膠原覆蓋的硼鹽玻璃器皿中，然后置入丙烯酸的容器中，證實了合成尿素，糖原和白蛋白的功能達兩周，并維持凝血酶原時間、氨的代謝在正常水平，使無肝犬存活65小時15。而最近研究最多的是Rozga他于1994年報道了組合型人工肝的臨床應用，1995年報道

14、了用人工肝治療8例急性肝細胞衰竭患者，其中前3例用的是生物人工肝，后5例用的是組合型人工肝，皆取得了好的臨床效果。1997年Watanabe與Rozga等報告了用組合型人工肝治療31例嚴重肝衰的病人，所用的裝置是將5×10/ml豬肝細胞粘附在膠原覆蓋的葡萄糖微載體上，再接種到由醋酸纖維素制成的中空纖維壁外間隙；當病人血漿分離后先經(jīng)過纖維素包裹的活性炭吸附，再灌注到中空纖維管內(nèi)循環(huán)。另外在裝置中配有溫度調(diào)節(jié)和氧合裝置以便為細胞提供生理環(huán)境。所有病人分為三組：第一組為暴了性肝功能衰竭患者，共18人，經(jīng)治療后16例成功地用人工肝作為橋梁而行肝移植術，一例病情恢復后沒有行肝移植，另一例死于伴

15、發(fā)嚴重的胰腺炎；第二組有3人，為肝移植后的最初無功能患者，皆成功地用人工肝作為橋梁而實行了肝的再移植術；第三組有10人，為慢性肝臟疾病的急性惡性化，治療后有2例病人肝功能恢復后成功地行肝移植術，其它8人雖用人工肝得以支持，但因不適合行肝移植而死亡。這是互到目前為止臨床應用組合型人工肝最令人鼓舞的結(jié)果。 5、組合型人工肝的問題與展望 5.1 問題 盡管組合型人工肝可以提供體外解毒、代謝、合成和調(diào)節(jié)功能，但仍有以下問題：（1）仍然不知道用何種來源的細胞為佳；（2）分離后的肝細胞怎樣才能維持分離前的高度分化形式和活性；（3）對異種肝細胞的排斥反應未完全解決；（4）由于人工肝需培養(yǎng)大量的肝細胞，而生物

16、反應器未按比例地發(fā)展；（5）目前生物反應器的膜設計是為其它方面的用途，而不是專為滿足肝功能輔助裝置的需求12；（6）生物反應器的設計迄今為止不太注意流體力學、幾何學以及細胞量在生物反應器上分布；（7）對急性肝功能衰竭的病生理了解不夠，如不了解某些因子的特性，很難推測限定這些因子運輸?shù)囊蛩?，也不可能制造出理想的?7。 5.2 展望 今后，理想的組合型人工肝是最有希望的人工肝輔助裝置4.10.18。下列幾個方面需加以發(fā)展：（1）發(fā)展具有分化功能的正常人類肝細胞系，有能力擴增胎干或成人肝細胞以誘導它們的分化功能，以使用于人工肝裝置中，在這方面基因工程是有希望的；（2）在細胞培養(yǎng)中通過用新型的基質(zhì)、生長因子以及與其它類型的細胞共同培養(yǎng)，將肝細胞聚集成球形或細胞簇來增強肝細胞的分化功能19；（3）改進肝細胞的冷凍保