多肽藥物的含量測(cè)定方法

1、肽類藥物的含量測(cè)定方法肽類藥物的含量測(cè)定方法背景：背景：多肽類藥物及其主要優(yōu)勢(shì)人體多肽類藥物及其主要優(yōu)勢(shì)人體的生長(zhǎng)和發(fā)育都離不開(kāi)多肽，多肽是調(diào)節(jié)的生長(zhǎng)和發(fā)育都離不開(kāi)多肽，多肽是調(diào)節(jié)系統(tǒng)功能系統(tǒng)功能和和細(xì)胞生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。多肽類藥物作為藥物開(kāi)發(fā)的主要方向，細(xì)胞生長(zhǎng)的基礎(chǔ)。多肽類藥物作為藥物開(kāi)發(fā)的主要方向，它包括它包括多種類型，常見(jiàn)的多多種類型，常見(jiàn)的多肽類藥物有如下肽類藥物有如下幾種幾種 .多肽類疫苗：多肽類疫苗的研制為人類攻克肝炎、艾滋病多肽類疫苗：多肽類疫苗的研制為人類攻克肝炎、艾滋病等疾病帶來(lái)了希望。等疾病帶來(lái)了希望。 .抗腫瘤多肽類藥物：腫瘤危害人類的生存，其產(chǎn)生是多方抗腫瘤多肽類藥物：腫瘤

2、危害人類的生存，其產(chǎn)生是多方面因素共同作用的結(jié)果，但歸根到底是癌基因表達(dá)的問(wèn)題。面因素共同作用的結(jié)果，但歸根到底是癌基因表達(dá)的問(wèn)題。多肽類抗癌藥物由于其能夠多肽類抗癌藥物由于其能夠成為腫瘤成為腫瘤基因表達(dá)基因表達(dá)時(shí)的調(diào)控因子，因而成為了抗癌藥物研究的新希望時(shí)的調(diào)控因子，因而成為了抗癌藥物研究的新希望。 .抗病毒類多肽藥物：一般來(lái)說(shuō)，病毒感染細(xì)胞的過(guò)程包括以下幾個(gè)主要階段：吸抗病毒類多肽藥物：一般來(lái)說(shuō)，病毒感染細(xì)胞的過(guò)程包括以下幾個(gè)主要階段：吸附、自我復(fù)制、重新組合、釋放病毒等?？共《径嚯耐ǔＷ饔糜诓《疚胶筒《緩?fù)制附、自我復(fù)制、重新組合、釋放病毒等。抗病毒多肽通常作用于病毒吸附和病毒復(fù)制兩個(gè)階

3、段，通過(guò)與宿主細(xì)胞特異性結(jié)合或者病毒蛋白酶結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用。兩個(gè)階段，通過(guò)與宿主細(xì)胞特異性結(jié)合或者病毒蛋白酶結(jié)合來(lái)發(fā)揮作用。一一 、酸堿滴定法酸堿滴定法示例：苯示例：苯酪酪酞的測(cè)定酞的測(cè)定測(cè)定方法：取本品約0.5g精密稱定，加中性乙醇（對(duì)酚酞指示液呈中性）60ml，振搖，溶解后加酚酞指示液數(shù)滴，用氫氧化鈉滴定（0.1mol/L)，即可。二二、 紫外分度光度法紫外分度光度法 示例：五肽胃泌素含量測(cè)定示例：五肽胃泌素含量測(cè)定五肽胃泌素為白色或類白色粉末。五肽胃泌素為白色或類白色粉末。本品能促進(jìn)胃酸、胃蛋白酶及內(nèi)因本品能促進(jìn)胃酸、胃蛋白酶及內(nèi)因子的分泌，其促胃酸分泌作用相當(dāng)子的分泌，其促胃酸分泌作用相

4、當(dāng)于內(nèi)源性胃泌素的于內(nèi)源性胃泌素的1/4，作用可持續(xù)，作用可持續(xù)1040分鐘。臨床上主要用于胃酸分分鐘。臨床上主要用于胃酸分泌機(jī)能的檢查泌機(jī)能的檢查。方法原理：方法原理： 供試品加供試品加0.01mol/L氨溶液定量稀釋，制成供試液，置紫氨溶液定量稀釋，制成供試液，置紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)外可見(jiàn)分光光度計(jì),于于280nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，計(jì)算出其含量。波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，計(jì)算出其含量。 試劑：試劑： 氨溶液（氨溶液（0.01mol/L） 標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品：E1%1cm 為為70計(jì)算計(jì)算儀器設(shè)備：儀器設(shè)備： 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)注：分光光度法應(yīng)以配制供試品的同批溶劑為對(duì)照，采用注：分光光

5、度法應(yīng)以配制供試品的同批溶劑為對(duì)照，采用1cm的石英吸收池。的石英吸收池。以吸收度最大的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)，一般供試品的吸收度讀數(shù)，以在以吸收度最大的波長(zhǎng)作為測(cè)定波長(zhǎng)，一般供試品的吸收度讀數(shù)，以在0.3-0.7之間的誤差較小。儀器的狹縫波帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶的半寬度，否則之間的誤差較小。儀器的狹縫波帶寬度應(yīng)小于供試品吸收帶的半寬度，否則測(cè)得的吸收度偏低。狹縫寬度的選擇，應(yīng)以減少狹縫寬度時(shí)供試品的吸收度測(cè)得的吸收度偏低。狹縫寬度的選擇，應(yīng)以減少狹縫寬度時(shí)供試品的吸收度不再增加為準(zhǔn)。由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測(cè)定供試品的不再增加為準(zhǔn)。由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測(cè)定供試

6、品的吸收度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，再計(jì)算含量。吸收度后應(yīng)減去空白讀數(shù)，再計(jì)算含量。三、效價(jià)測(cè)定法三、效價(jià)測(cè)定法實(shí)例（實(shí)例（1）：抑肽酶效價(jià)的測(cè)定）：抑肽酶效價(jià)的測(cè)定抑肽酶抑肽酶(Trasylol，別名：抑胰肽酶、屈來(lái)密多，別名：抑胰肽酶、屈來(lái)密多) 能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻能抑制胰蛋白酶及糜蛋白酶，阻止胰臟中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活。臨床用于預(yù)防和止胰臟中其他活性蛋白酶原的激活及胰蛋白酶原的自身激活。臨床用于預(yù)防和治療急性胰腺炎、纖維蛋白溶解引起的出血及彌漫性血管內(nèi)凝血。還可用于抗治療急性胰腺炎、纖維蛋白溶解引起的出血及彌漫性血管內(nèi)凝血。還可用于抗休克治療。在腹腔手術(shù)后，直接

7、注入腹腔可預(yù)防腸休克治療。在腹腔手術(shù)后，直接注入腹腔可預(yù)防腸粘連。粘連。抑肽酶通過(guò)酶上的絲氨酸活性部分，形成抑肽酶抑肽酶通過(guò)酶上的絲氨酸活性部分，形成抑肽酶-蛋白酶復(fù)合物而達(dá)到抑制作蛋白酶復(fù)合物而達(dá)到抑制作用。然而與不同的蛋白酶結(jié)合，顯示出不同的離解常數(shù)。與胰蛋白酶的結(jié)合最用。然而與不同的蛋白酶結(jié)合，顯示出不同的離解常數(shù)。與胰蛋白酶的結(jié)合最牢固與人體纖溶酶的結(jié)合不很牢固。牢固與人體纖溶酶的結(jié)合不很牢固。（1）底物）底物溶液的溶液的制備制備 (2) 胰蛋白酶胰蛋白酶稀釋溶液的制備稀釋溶液的制備精密量取胰蛋白酶溶液精密量取胰蛋白酶溶液1ml，用硼砂氯化鈣緩沖液（，用硼砂氯化鈣緩沖液（pH 8.0）

8、稀釋成）稀釋成20ml，室溫，室溫放置放置10min，置于冰浴中。置于冰浴中。取取N-苯甲酰苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽精氨酸乙酯鹽酸鹽171.3mg，加水溶解并稀釋至，加水溶解并稀釋至25ml。臨用時(shí)配制。胰蛋白。臨用時(shí)配制。胰蛋白酶溶液的酶溶液的 制備制備 取胰蛋白酶對(duì)照品適量，精密稱定，加鹽酸滴定液（取胰蛋白酶對(duì)照品適量，精密稱定，加鹽酸滴定液（0.001mol/L）溶）溶解并制成每解并制成每1ml中約含中約含0.8單位（每單位（每1ml中約含中約含1mg）的溶液，臨用時(shí)配制并置于冰浴中。）的溶液，臨用時(shí)配制并置于冰浴中。(3) 供供試品溶液的制備試品溶液的制備取本品適量，精密稱定，加硼

9、砂一氯化鈣緩沖液（取本品適量，精密稱定，加硼砂一氯化鈣緩沖液（pH 8.0）溶解并制成每）溶解并制成每1ml中約含中約含1.67單位（每單位（每1ml中約含中約含0.6mg）的溶液，精密量?。┑娜芤?，精密量取0.5ml與胰蛋白酶溶液與胰蛋白酶溶液2ml，再用硼砂，再用硼砂一氯化鈣緩沖液（一氯化鈣緩沖液（pH 8.0）稀釋成）稀釋成20ml，反應(yīng)，反應(yīng)10分鐘，置冰浴中（分鐘，置冰浴中（2小時(shí)內(nèi)使用）。小時(shí)內(nèi)使用）。(4) 測(cè)定測(cè)定法法取硼砂氯化鈣緩沖液（取硼砂氯化鈣緩沖液（pH 8.0）9.0ml與底物溶液與底物溶液1.0ml，置，置25ml燒杯中，于燒杯中，于250.5恒溫水浴恒溫水浴中放置

10、中放置35分鐘，在攪拌下滴加氫氧化鈉滴定液（分鐘，在攪拌下滴加氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）調(diào)節(jié)）調(diào)節(jié)pH值為值為8.0，精密加入供試品溶液，精密加入供試品溶液（經(jīng)（經(jīng)25保溫保溫35分鐘）分鐘）1ml，并立即計(jì)時(shí)，用，并立即計(jì)時(shí)，用1ml微量滴定管以氫氧化鈉滴定液（微量滴定管以氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）滴定）滴定釋放出的酸，使溶液的釋放出的酸，使溶液的pH值始終保持在值始終保持在7.98.1。每隔。每隔60秒讀取秒讀取pH值恰為值恰為8.0時(shí)所消耗的氫氧化鈉時(shí)所消耗的氫氧化鈉滴定液（滴定液（0.1mol/L）的體積（）的體積（ml），共），共6分鐘。另精密量取胰蛋白酶稀釋溶液分鐘

11、。另精密量取胰蛋白酶稀釋溶液1ml，按上法操作，作，按上法操作，作為對(duì)照（重復(fù)一次）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，消耗的氫氧化鈉滴定液（為對(duì)照（重復(fù)一次）。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，消耗的氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）為縱坐標(biāo)作圖，應(yīng)為）為縱坐標(biāo)作圖，應(yīng)為一條直線。供試品和對(duì)照兩條直線應(yīng)基本重合，求出每秒鐘消耗氫氧化鈉滴定液（一條直線。供試品和對(duì)照兩條直線應(yīng)基本重合，求出每秒鐘消耗氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）的體）的體積（積（ml），按下式計(jì)算。），按下式計(jì)算。每每1mg抑肽酶的效價(jià)（單位抑肽酶的效價(jià)（單位）式中式中 4000為系數(shù)；為系數(shù)；W為抑肽酶制成每為抑肽酶制成每1ml中約含中約含1.67單位時(shí)的

12、酶量，單位時(shí)的酶量，mg；n1為對(duì)照測(cè)定時(shí)每秒鐘消耗的氫氧化鈉滴定液（為對(duì)照測(cè)定時(shí)每秒鐘消耗的氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）的體積，）的體積，ml；n2為供試品溶液每秒鐘消耗氫氧化鈉滴定液（為供試品溶液每秒鐘消耗氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）的體積，）的體積，ml；2為供試品溶液中所加入胰蛋白酶的量為對(duì)照測(cè)定時(shí)的為供試品溶液中所加入胰蛋白酶的量為對(duì)照測(cè)定時(shí)的2倍；倍；f為氫氧化鈉滴定液（為氫氧化鈉滴定液（0.1mol/L）校正因子。）校正因子。效價(jià)單位定義效價(jià)單位定義能能抑制一個(gè)胰蛋白酶單位抑制一個(gè)胰蛋白酶單位每秒鐘能水解每秒鐘能水解1mol的的N-苯甲酰苯甲酰-L-精氨酸乙酯（精氨酸

13、乙酯（BAEE）為一個(gè)胰）為一個(gè)胰蛋白酶單位（蛋白酶單位（microkatal）的活力稱為一個(gè)抑肽酶活力單位（的活力稱為一個(gè)抑肽酶活力單位（EPU）。每）。每1EPU的抑肽酶相當(dāng)?shù)囊蛛拿赶喈?dāng)于于1800KIU。注意注意事項(xiàng)：事項(xiàng)：（1）本實(shí)驗(yàn)測(cè)定原理：在一定條件下（）本實(shí)驗(yàn)測(cè)定原理：在一定條件下（pH8.0，25），胰蛋白酶可使），胰蛋白酶可使N-苯苯甲酰甲酰-L-精氨酸乙精氨酸乙酯水解為酯水解為N-苯甲酰苯甲酰-L-精氨酸，使溶液精氨酸，使溶液pH下降，當(dāng)加入氫氧化下降，當(dāng)加入氫氧化鈉滴定后，使溶液鈉滴定后，使溶液pH又回到又回到8.0，水解繼續(xù)進(jìn)行。，水解繼續(xù)進(jìn)行。（2）當(dāng)胰蛋白酶中加入抑

14、肽酶后，使）當(dāng)胰蛋白酶中加入抑肽酶后，使50%的胰蛋白酶活性被抑制，剩余的胰的胰蛋白酶活性被抑制，剩余的胰蛋白酶繼續(xù)與底物進(jìn)行水解反應(yīng)，用氫氧化鈉滴定釋放出的酸，使蛋白酶繼續(xù)與底物進(jìn)行水解反應(yīng)，用氫氧化鈉滴定釋放出的酸，使pH始終維始終維持持7.98.0，在一定時(shí)間內(nèi)，根據(jù)根據(jù)樣品消耗的氫氧化鈉（，在一定時(shí)間內(nèi)，根據(jù)根據(jù)樣品消耗的氫氧化鈉（0.1mol/L）的體）的體積（積（ml)算出活力單位。算出活力單位。實(shí)例（實(shí)例（2）桿菌肽效價(jià)測(cè)定：）桿菌肽效價(jià)測(cè)定： 利用桿菌肽能夠抑制微生物生長(zhǎng)特性，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過(guò)與標(biāo)利用桿菌肽能夠抑制微生物生長(zhǎng)特性，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)微生物產(chǎn)生抑菌圈面

15、積的大小，從而得到待測(cè)樣品相對(duì)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)微生物產(chǎn)生抑菌圈面積的大小，從而得到待測(cè)樣品相對(duì)與標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)準(zhǔn)品的效價(jià)實(shí)例（實(shí)例（3）縮宮素的效價(jià)測(cè)定）縮宮素的效價(jià)測(cè)定 利用縮宮素的能夠改變小鼠子宮的收縮程度，來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。通利用縮宮素的能夠改變小鼠子宮的收縮程度，來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)子宮收縮程度進(jìn)行比較，從而得到該藥物相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)子宮收縮程度進(jìn)行比較，從而得到該藥物相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)品的效價(jià)。的效價(jià)?？偨Y(jié)：總結(jié)： 在進(jìn)行多肽藥物含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)可以采用了兩種形式：在進(jìn)行多肽藥物含量進(jìn)行測(cè)定時(shí)可以采用了兩種形式： 第一種屬于比較精準(zhǔn)的定量第一種屬于比較精準(zhǔn)的定量如酸堿滴定法和紫外分光光

16、度法。這兩種方法都是利用如酸堿滴定法和紫外分光光度法。這兩種方法都是利用多肽分子結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)。方法一利用游離的氨基或羧基，使多肽表現(xiàn)出酸堿性，可以利用低多肽分子結(jié)構(gòu)上的特點(diǎn)。方法一利用游離的氨基或羧基，使多肽表現(xiàn)出酸堿性，可以利用低濃度酸或堿進(jìn)行滴定；方法二利用某些特性的官能團(tuán)來(lái)進(jìn)行定量。因此再要進(jìn)行對(duì)某種多肽濃度酸或堿進(jìn)行滴定；方法二利用某些特性的官能團(tuán)來(lái)進(jìn)行定量。因此再要進(jìn)行對(duì)某種多肽物質(zhì)進(jìn)行定量時(shí)，可以從結(jié)構(gòu)特性下手，利用特性化學(xué)反應(yīng)或者物理特性進(jìn)行定量。物質(zhì)進(jìn)行定量時(shí)，可以從結(jié)構(gòu)特性下手，利用特性化學(xué)反應(yīng)或者物理特性進(jìn)行定量。 第二種屬于一種比較抽象的定量方式第二種屬于一種比較抽象的定量方式效價(jià)測(cè)定。跟酶活力單位類似是一個(gè)可以隨人為效價(jià)測(cè)定。跟酶活力單位類似是一個(gè)可以隨人為規(guī)定變化而變化的，但通過(guò)規(guī)定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，具有可比性。在效價(jià)測(cè)定的實(shí)例中，可以得出它規(guī)定變