生物化學(xué)-質(zhì)粒DNA測(cè)定實(shí)驗(yàn)報(bào)告

1、實(shí)驗(yàn)名稱(Title of Experimetn)質(zhì)粒提取、定量與酶切鑒定實(shí)驗(yàn)日期(Date of Experiment)2015-11-17實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)(Lab No.)第四實(shí)驗(yàn)室合作者(Partner)指導(dǎo)老師(Instructor)總分(Total Score)XX教師簽名(Signature)李某某批改日期(Date)2013-06-03【實(shí)驗(yàn)報(bào)告第一部分（預(yù)習(xí)報(bào)告內(nèi)容）：實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)材料（包括實(shí)驗(yàn)樣品、主要試劑、主要儀器與器材）、實(shí)驗(yàn)步驟（包括實(shí)驗(yàn)流程、操作步驟和注意事項(xiàng)）；評(píng)分（滿分30分）：XX】1實(shí)驗(yàn)原理1）PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)?/p>

2、反應(yīng)，是指在DNA聚合酶催化下，以DNA為模板，特定引物為延伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，在體外復(fù)制DNA的過(guò)程。2）堿裂解法提取質(zhì)粒：基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異；在高堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA變性；但當(dāng)以高鹽緩沖液調(diào)節(jié)其pH值至中性時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA能復(fù)性并保存在溶液中，染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可通過(guò)離心形成沉沉淀去除。離心層析柱：采用堿裂解法提取質(zhì)粒，吸附柱內(nèi)的硅基質(zhì)質(zhì)膜在高鹽低PH狀態(tài)下選擇性地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過(guò)去蛋白液和漂洗液將雜質(zhì)和其他細(xì)菌成分去除，最后低鹽，高PH的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從硅基質(zhì)上洗脫。3）質(zhì)粒

3、DNA定量測(cè)定-紫外光吸收法因?yàn)榻M成核酸的堿基(G,A,T,C）在260nm處具有強(qiáng)吸收峰，所以通過(guò)測(cè)定260nm的吸收峰即可對(duì)DNA進(jìn)行定量。而蛋白質(zhì)的紫外吸收峰在280nm處。通過(guò)測(cè)定260nm和280nm的吸光度比值（A260/A280），可估計(jì)核酸的純度。A260/A280的比值可以反應(yīng)DNA的純度 Ratio= 1.8 DNA樣品較純,符合實(shí)驗(yàn)要求； Ratio1.9 RNA污染； Ratio1.6 蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)的污染；4）質(zhì)粒DNA的酶切鑒定限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶，是體外剪切基因片段的重要工具酶,可分為型。其中，II型識(shí)別和切割的

4、核苷酸序列專一限制性核酸內(nèi)切酶識(shí)別序列，其識(shí)別位點(diǎn)長(zhǎng)度為46個(gè)核苷酸的回文序列。本實(shí)驗(yàn)中用到的兩種酶類：EcoR和Hind就是II型限制性核酸內(nèi)切酶，可將質(zhì)粒DNA割成不用大小片段。不同質(zhì)粒DNA有不同的核苷酸序列，因而其酶切位點(diǎn)和數(shù)量也不同。瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性環(huán)境中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng).DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同的DNA，分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶。遷移速率：共價(jià)閉環(huán)超螺旋DNA線性DNA開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀D

5、NA2.實(shí)驗(yàn)材料1）樣品：含pMD18-T質(zhì)粒的大腸桿菌DH52）試劑：LB培養(yǎng)基（液體、固體）質(zhì)粒提取試劑盒：溶液S1（細(xì)菌懸浮液）、裂解液S2、中和液S3、洗滌液W、洗脫液、RNase A(100mg/ml)、DNA吸附柱Hind III核酸內(nèi)切酶（TaKaRa）電泳實(shí)驗(yàn)上樣緩沖液EcoR I核酸內(nèi)切酶（TaKaRa）10× M 酶切緩沖液：蒸餾水3）儀器：恒溫培養(yǎng)箱、恒溫?fù)u床、超凈工作臺(tái)、臺(tái)式離心機(jī)、高壓滅菌鍋易瑞質(zhì)粒小量提取試劑盒、微量移液器（20、100、1000L）、1.5mL塑料離心管、塑料離心管架（30孔）、紫外檢測(cè)儀、電泳儀、水平電泳槽、凝膠成像儀、UVette比色

6、皿等3.實(shí)驗(yàn)步驟1）堿裂解法提取質(zhì)粒2）質(zhì)粒DNA定量測(cè)定95L 蒸餾水紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280調(diào)零加5L質(zhì)粒加樣槍調(diào)勻測(cè)定三組數(shù)據(jù)3）質(zhì)粒DNA的酶切鑒定在一個(gè)潔凈的0.5 ml離心管中混勻下列反應(yīng)物：反應(yīng)物 體積（µl)10× M 酶切緩沖液 2質(zhì)粒DNA 5001000ng (10 µl)Hind III 1EcoR I 1H2O至 20混合后37 水浴12h瓊脂糖凝膠電泳：制備 上樣：加樣前，樣品先與6×上樣緩沖液混勻。用加樣器吸取樣品，輕輕的加入到凝膠的樣品孔中，加樣量為6 µl 蓋上電泳槽，接通電源，開(kāi)始電泳。電泳條件：

7、電壓80v；時(shí)間2530分鐘；電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠。電泳結(jié)果分析：紫外檢測(cè)儀直接觀察電泳條帶。取出凝膠，置于凝膠成像儀中觀察結(jié)果，并拍照記錄。4.注意事項(xiàng)1）堿裂解法提取質(zhì)粒DNA加入250L裂解液S2不可過(guò)分用力振蕩，避免染色體DNA因外力作用斷裂成小片段，從而與質(zhì)粒DNA混合在一起，引入誤差。2）紫外分光度法測(cè)定酶切質(zhì)粒DNA（1）拿UVette比色皿時(shí)，應(yīng)注意拿著比色皿的粗糙面。最好在使用之前用干凈的紙巾擦拭光學(xué)面。并且放比色皿時(shí)注意將光學(xué)面與出光方向一致?？瞻讓?duì)照和樣品應(yīng)該在同一個(gè)比色皿中檢測(cè)，以防誤差。（2）在比色皿中稀釋時(shí)，要用加樣槍充分混勻并防止氣泡和其他懸浮物的出現(xiàn)。

8、（3）在酶切反應(yīng)體系中，質(zhì)粒DNA最后加入，以防止操作不當(dāng)引起的試劑的污染，而且在混合后避免強(qiáng)烈振蕩，保證不使內(nèi)切酶變性及DNA分子的完整。3）質(zhì)粒DNA的酶切分析（1）因?yàn)榫彌_液具有致癌性，所以在混合緩沖液是一定到戴手套操作。若不慎沾到要立即用大量清水沖洗。（2）在離心管中混勻物質(zhì)時(shí)，HindIII和EcoRI應(yīng)最后加入。（3）水浴時(shí)應(yīng)把管蓋蓋緊，避免水蒸氣進(jìn)入。【實(shí)驗(yàn)報(bào)告第二部分（實(shí)驗(yàn)記錄）：主要實(shí)驗(yàn)條件（如材料的來(lái)源、質(zhì)量；試劑的規(guī)格、用量、濃度；實(shí)驗(yàn)時(shí)間、操作要點(diǎn)中的技巧、失誤等，以便總結(jié)實(shí)驗(yàn)時(shí)進(jìn)行核對(duì)和作為查找成敗原因的參考依據(jù)）；實(shí)驗(yàn)中觀察到的現(xiàn)象（如加入試劑后溶液顏色的變化）；原

9、始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。評(píng)分（滿分20分）：XX】1.實(shí)驗(yàn)條件1）材料：由實(shí)驗(yàn)室提供2）試劑：規(guī)格用量嚴(yán)格按照操作步驟中的要求進(jìn)行2.實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象1）堿裂解法提取質(zhì)粒DNA加入中和液S3之后，管內(nèi)出現(xiàn)絮狀白色沉淀。離心后沉淀于底部，上清液呈無(wú)色透明。2）紫外分光度法測(cè)定酶切質(zhì)粒DNA：三次測(cè)量結(jié)果如下圖3）質(zhì)粒DNA的酶切分析電泳完畢之后，利用紫外檢測(cè)儀和凝膠成像儀觀察電泳條帶，并拍照得到以下圖片：標(biāo)志如下圖酶切DNA共價(jià)閉環(huán)超螺旋DNA線性DNA開(kāi)環(huán)的雙鏈環(huán)狀DNA3.原始數(shù)據(jù)測(cè)量次數(shù) 質(zhì)粒DNA濃度（ug/ml） Ratio比值(A260/A280)1 56.4 1.802 56.6 1.763 55.8

10、 1.83平均值 56.3 1.80【實(shí)驗(yàn)報(bào)告第三部分（結(jié)果與討論）：結(jié)果（定量實(shí)驗(yàn)包括計(jì)算）：應(yīng)把所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如觀察現(xiàn)象）和數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、歸納、分析、對(duì)比，盡量用圖表的形式概括實(shí)驗(yàn)的結(jié)果；討論：不應(yīng)是實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重述，而是以結(jié)果為基礎(chǔ)的邏輯推論。結(jié)論：簡(jiǎn)單扼要，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)果。（包括思考題）。評(píng)分（滿分45分）：XX】1結(jié)果由紫外分光度法測(cè)定酶切質(zhì)粒DNA， dsDNA濃度為約為56.3 ug/ml，Ratio比值(A260/A280)為1.80。酶切DNA：2000pb質(zhì)粒DNA中出現(xiàn)三條帶，從下到上（遠(yuǎn)到近）的順序?yàn)椋撼菪|(zhì)粒DNA、線性DNA和開(kāi)環(huán)狀質(zhì)粒DNA。2.討論1

11、）由Ratio比值(A260/A280)均值為1.80可知DNA樣品較純,符合實(shí)驗(yàn)要求。實(shí)驗(yàn)操作比較規(guī)范沒(méi)有出現(xiàn)大差錯(cuò)。但是并不是每次實(shí)驗(yàn)結(jié)果都是1.80，所以也有一定的操作失誤：在混合后馬上測(cè)定DNA的濃度，沒(méi)有用加樣槍充分混合均勻。也就是說(shuō)在溶液混合的過(guò)程中，沒(méi)有等到溶液充分混勻、靜置就直接測(cè)定了DNA的濃度，使得第二組比值偏低。向菌種加S1時(shí)，振蕩不充分，導(dǎo)致有少量細(xì)胞貼于管壁，未破裂，致使提取的DNA減少，第二組比值偏低。比色皿的光學(xué)面使用過(guò)度，存在老化，模糊的雜質(zhì)貼在壁上，影響了測(cè)量的精度。2）超螺旋質(zhì)粒DNA、線性DNA和開(kāi)環(huán)狀質(zhì)粒DNA這三種不同構(gòu)型的分子有不同的遷移率，在一般情況下，超螺旋型遷移速