動物細(xì)胞血涂片的制備

1、動物細(xì)胞血涂片的制備、瑞氏染液及細(xì)胞觀察一、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康腶) 學(xué)習(xí)涂片制備的一般方法b) 學(xué)習(xí)瑞氏染色的方法c) 學(xué)習(xí)辨認(rèn)各種血細(xì)胞二、實(shí)驗(yàn)原理a) 血涂片的簡介血涂片的顯微檢查是血液細(xì)胞學(xué)檢查的基本方法，臨床上應(yīng)用極廣泛，特別是對于各血液病的診斷具有重要的價(jià)值。血涂片制備時(shí)手工推片法用血量少、操作簡單，是最廣泛應(yīng)用的方法。血涂片制備是血液學(xué)檢查的重要基本技術(shù)之一。一張良好的血片，厚薄要適宜，頭體尾要明顯，細(xì)胞分布要均勻，膜的邊緣要整齊，并留有一定的空隙。b) 血涂片的制備及瑞氏染液的配制用推片法將血液制成薄的血涂片，使血細(xì)胞成單層排列。瑞氏染料是由堿性染料天青（ Methvlem blue ）

2、和酸性染料伊紅（ Eostm Y ）合稱伊紅天青 染料即瑞氏 （天青伊紅Y）染料 。甲醇作瑞氏染料溶劑，即成瑞氏染液。（注：甲醇具有強(qiáng)大的脫水力，可將細(xì)胞固定在一定形態(tài)及增加細(xì)胞結(jié)構(gòu)的表面積，提高細(xì)胞對染料吸收作用，同時(shí)由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升溫，加速染色反應(yīng)。）c) 細(xì)胞染色的原理細(xì)胞的染色既有物理的吸附作用，又有化學(xué)的親和作用，各種細(xì)胞成分化學(xué)性質(zhì)不同，對各種染料的親和力也不一樣。因此，在同一血片上，可以看到各種不同的色彩。例如：嗜酸性顆粒為堿性蛋白質(zhì)，與酸性染料伊紅結(jié)果，染粉紅色，稱為嗜酸性物質(zhì)；細(xì)胞核蛋白為酸性，與堿性染料天青結(jié)合，染紫藍(lán)色，稱為嗜堿性物質(zhì)；中性顆粒呈等電狀

3、態(tài)與伊紅和天青均不易結(jié)合，染淡紫色，稱為中性物質(zhì)。d) 哺乳動物各類血細(xì)胞特點(diǎn)i. 紅細(xì)胞：圓餅狀無核，中間薄，周圍厚；數(shù)量最多。ii. 淋巴細(xì)胞：基本為圓形，比紅細(xì)胞稍大；核幾乎占據(jù)整個(gè)細(xì)胞，一側(cè)常有小凹陷，染色呈很深的紫色；胞質(zhì)很少，僅在細(xì)胞核外有一薄圈，幾乎無色。iii. 單核細(xì)胞：最大、少、胞體為圓形或橢圓形；胞核形態(tài)多樣，有卵圓形、腎形、馬蹄形等，常偏位，著色比淋巴細(xì)胞核淺；核質(zhì)比小于淋巴細(xì)胞。iv. 嗜中性粒細(xì)胞：基本為圓形，比紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞大，但比單核細(xì)胞??；核長，為臘腸狀或分葉狀（2-5葉），經(jīng)常很難分辨。v. 嗜酸性粒細(xì)胞：胞體為圓形，有一個(gè)大而染成淡紫色的核；胞質(zhì)充滿粗大

4、的嗜酸性顆粒（紅色）；由于核占據(jù)了細(xì)胞的很大一部分，使顆粒在整個(gè)細(xì)胞內(nèi)的分布并不均勻。vi. 嗜堿性粒細(xì)胞：細(xì)胞呈圓形，胞質(zhì)內(nèi)有大量小的嗜堿性顆粒，呈藍(lán)紫色，分布于整個(gè)細(xì)胞，覆蓋核。vii. 血小板：最小，多角形聚集成群。e) 牛蛙各類血細(xì)胞特點(diǎn)i. 紅細(xì)胞：橢圓形，有核，最大。ii. 淋巴細(xì)胞：特征同哺乳動物的淋巴細(xì)胞，但是為血細(xì)胞中最小的一種。iii. 單核細(xì)胞：細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則；核偏位，占整個(gè)細(xì)胞的1/2-2/3。iv. 嗜酸性粒細(xì)胞：細(xì)胞呈圓形或卵圓形，大小差別比較大，有的比紅細(xì)胞還大，有的與其他兩種粒細(xì)胞大小接近；核很大，位于細(xì)胞中央或一側(cè)，呈腎形或卵圓形，也有分葉狀、環(huán)狀，染色為淡紫

5、紅色；胞漿充滿紅色圓形顆粒，排列緊密。v. 嗜堿性粒細(xì)胞：數(shù)量極少，細(xì)胞為圓形；胞質(zhì)中充滿藍(lán)色或深紫色圓形顆粒，顆粒大小不一，常掩蓋核。vi. 嗜中性粒細(xì)胞：細(xì)胞為圓形或卵圓形；核偏位，形狀不規(guī)則，具有多樣性，有腎形、帶狀、彎月狀或分成兩葉至多葉，胞核染色為紫紅色；胞質(zhì)著色較淺，其中有淡藍(lán)色顆粒狀物質(zhì)不均勻地分布在胞質(zhì)內(nèi)，有時(shí)顆粒狀物質(zhì)不十分明顯。三、 實(shí)驗(yàn)材料及試劑a) 材料新鮮采集的牛蛙血（采集時(shí)加入肝素鈉溶液抗凝）。（由老師完成）b) 試劑i. 肝素鈉溶液：用生理鹽水配成180IU/mL。（由老師配制）ii. 瑞氏染液：瑞氏染料粉末0.1g和甲醇60mL。配法：把染料放在研缽內(nèi)，加入少量

6、甲醇研磨，使染料溶解，然后把溶解的染料倒入干凈的棕色的玻璃瓶當(dāng)中，并至用完甲醇為止。（由老師配制）iii. pH6.4的PBS：磷酸二氫鉀（無水）0.3g，磷酸二氫鈉（無水）0.2g，加入少量蒸餾水溶解并定容至1000mL。（由老師配制）c) 用品普通光學(xué)顯微鏡、酒精棉、蠟筆、載玻片等。四、實(shí)驗(yàn)步驟流程：清潔加樣推片干片選區(qū)染色洗片a)清潔載玻片：載玻片在使用之前用酒精棉清潔晾干。 b)加樣：在干凈的載玻片長軸一端離邊緣約1cm處的中央用膠頭滴管滴1/5滴血。取另一張干凈的載玻片作為推片，讓推片的一端先出于血滴推片方向的前側(cè)，并與血滴玻片成3545夾角。c)推片：先將推片向后拉至血滴處，待血液

7、沿著兩塊載玻片接觸線向兩邊擴(kuò)散后，將推片保持夾角，向血玻片左側(cè)均速推進(jìn)，血液隨推片而行，在血玻片上形成一層血膜，即為血涂片d)干片：推好的血涂片在空氣中晃動，使其迅速干燥。e)選區(qū)：在顯微鏡下觀察，尋找涂片中均勻分散良好的血膜，用蠟筆在四周畫線（多畫幾圈），作為提防。f)染色：滴加適量的瑞氏染液覆蓋選定區(qū)域，染1分鐘；在滴加等量的PH6.4的PBS緩沖液稀釋染液，輕搖混勻，液面浮現(xiàn)一層金黃色金屬物質(zhì)，然后靜置染色15-20min。g)洗去多余染液：用流水或滴加蒸餾水直接洗去浮液。（不要先將染液倒掉）將載玻片自然晾干，用于觀察。h)觀察辨認(rèn)各種細(xì)胞。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果a)上圖中的1框內(nèi)的細(xì)胞形狀不規(guī)則

8、，且核偏位，占整個(gè)細(xì)胞的2/3左右。所以，我認(rèn)為它是單核細(xì)胞。上圖中的2框內(nèi)的細(xì)胞圓餅狀、有核，且與其他細(xì)胞相比最大，而且在視野當(dāng)中的數(shù)量明顯比其他細(xì)胞多。所以，我認(rèn)為它是牛蛙的紅細(xì)胞。b）上圖中的1框內(nèi)的細(xì)胞中有大量的深紫色堿性顆粒。所以，老師認(rèn)為它是嗜堿性粒細(xì)胞。（但是，因?yàn)榧?xì)胞中的顆粒狀物質(zhì)并沒有掩蓋核，所以我開始的時(shí)候以為這個(gè)細(xì)胞是嗜中性粒細(xì)胞。由上可知，嗜中性粒細(xì)胞與嗜堿性粒細(xì)胞之間的分界線并不是非常的明顯。）上圖中的2框內(nèi)的細(xì)胞首先比周圍其他的細(xì)胞都小，基本為圓形，核幾乎占據(jù)整個(gè)細(xì)胞，而且細(xì)胞質(zhì)很少，且基本無色。所以，我認(rèn)為它是淋巴細(xì)胞。C）上圖中的1框內(nèi)細(xì)胞為卵圓形，核偏位且分為

9、兩葉，細(xì)胞核染色為紫紅色，且細(xì)胞質(zhì)著色比周圍的細(xì)胞著色都淺。所以我認(rèn)為它是嗜中性粒細(xì)胞。d)上圖中的1框內(nèi)的細(xì)胞呈卵圓形，細(xì)胞的左上部分為染成淡紫紅色的腎形細(xì)胞核，右下部分為排列緊密的紅色顆粒狀物質(zhì)。所以我認(rèn)為它是嗜酸性粒細(xì)胞。上圖中的2框內(nèi)的細(xì)胞，我認(rèn)為是嗜中性粒細(xì)胞（但是我不知道是不是正確）。六、實(shí)驗(yàn)結(jié)論及分析實(shí)驗(yàn)中我并沒有真的找到嗜中性粒細(xì)胞。是在實(shí)驗(yàn)后查看所拍的圖片的時(shí)候覺得上圖細(xì)胞有一些像嗜中性粒細(xì)胞而已。我覺得，自己的推片還是有一定問題，有些載玻片細(xì)胞的細(xì)胞分布非常不均勻，根本就不能用。有一些可能是推片太厚了，所以晾干比較慢，所以在最后觀察時(shí)很多紅細(xì)胞都已經(jīng)皺縮了。另外，我覺得染色

10、的效果也不是非常理想，紅色和紫色的區(qū)分并不是非常的明顯。七、實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)a)血量不能多，標(biāo)本過厚，細(xì)胞重疊不便觀察，并且造成細(xì)胞皺縮變形。b)染液PH值是6.4-6.8，染色偏酸或偏堿都會使染色反應(yīng)異常。PH對細(xì)胞染色有影響。由于蛋白質(zhì)系兩性電解質(zhì)，所帶電荷隨溶液PH而定，在偏酸性環(huán)境中下在正電荷增多，易與伊紅結(jié)合，染色偏紅；在偏堿性環(huán)境中負(fù)電荷增多，易與天青結(jié)合，染色偏藍(lán)。因此細(xì)胞染色對氫離子濃度十分敏感，染色用片必須清潔，無酸堿污染。配制瑞氏染液時(shí)必須用優(yōu)質(zhì)甲醇，稀釋染色必須用緩沖液，沖洗用水應(yīng)近中性，否則可導(dǎo)致各種細(xì)胞染色反應(yīng)異常，以致識別困難，甚至造成錯(cuò)誤。c)沖洗時(shí)不能先倒掉染液，以防染料沉著在血涂片上；沖洗時(shí)間不能過久，以防脫色。如血涂片上有染料顆粒沉積就，可滴加甲醇，然后立即用流水沖洗。