發(fā)酵液中紅霉素的含量測定

1、發(fā)酵液中紅霉素的含量測定張宇，龔文靜，沈以凌，苗秀珍(南京工業(yè)大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京 210009)摘要：建立了紅霉素的含量測定方法初篩用紫外分光光度法（UV），復篩用高效液相色譜法（HPLC）。UV法確定磷酸濃度10mol/L，反應溫度80，反應時間3min，測定波長485nm；HPLC法確定柱溫50，波長210nm。此種方法針對性好，適用于大批量的紅霉素發(fā)酵液的檢測。關鍵詞：紅霉素；發(fā)酵液；紫外分光光度法；高效液相色譜法中圖分類號： Q939.97 文獻標志碼：A 文章編號： Determination of Erythromycin in Fermentation Liquo

2、rZHANG Yu，GONG Wenjing，SHEN Yiling， MIAO Xiuzhen（1.Nanjing University of Technology, Nanjing 210009, China）Abstract：A method for determination of Erythromycin was established - screened by UV, re-screened by HPLC. The optimal determination conditions were obtained as follows: UV contained phosphate

3、concentration 10mol / L, reaction temperature 80, reaction time 3min, detection wavelength 485nm; HPLC contained the column temperature 50, the wavelength 210nm. This method is convenient and suitable for batch determination of erythromycin.Key words：Erythromycin; Fermentation Liquor; UV; HPLC作者簡介：張

4、宇（1987-），女，碩士研究生，研究方向為工業(yè)微生物的育種與發(fā)酵。紅霉素（Erythromycin，簡寫為Er）為白色或類白色的結晶或粉末；無臭，味苦；微有引濕性 中華人民共和國藥典委員會. 中華人民共和國藥典：二部M. 北京：化學工業(yè)出版社，2005。分子式為C37H67O13N，分子量為733.91。紅霉素是1952年問世的第一個由放線菌產生的14元環(huán)大環(huán)內酯類抗生素，抗菌譜和青霉素相似，主要是對革蘭氏陽性菌如金葡菌、溶血性鏈球菌、肺炎球菌、白喉桿菌、炭疽桿菌及梭形芽胞桿菌等有強大的抗菌作用。對革蘭氏陰性菌活性較差，并可用于青霉素過敏患者。雖然現(xiàn)今抗菌藥物越來越多，紅霉素在治療領域仍占有

5、自己的地位。其適應癥似乎還在擴大。尤其是半合成紅霉素衍生物的開發(fā)成功如阿齊霉素(Azithromycin)、甲紅霉素(Clarithromycin)、地紅霉素(Dirithromycin)、羅紅霉素(Roxithromycin)、氟紅霉素(Flurithromycin)，使得大環(huán)內酯類抗生素在未來的抗感染藥物中所擁有的市場份額進一步加強和擴大。測定抗生素效價的國際常用方法是管碟法 雷波. 管碟法測定抗生素效價方法的優(yōu)化研究J. 重慶師范大學學報（自然科學版），2006, 23(3)：85-87.，是利用抗生素在特定實驗菌的瓊脂培養(yǎng)基內的擴散作用，形成一定濃度的含抗生素的球型區(qū)，抑制了試驗菌的繁

6、殖而呈現(xiàn)出透明的抑菌圈，將已知效價的標準溶液和未知效價的供試樣品溶液在相同條件下進行培養(yǎng)，比較兩者的抑菌圈的大小，利用各種不同的計算原理，就可以準確地測定出供試樣品的效價。但是在使用標準樣品比較時，由于各種因素的影響使得抑菌圈在相同劑量下偏小，不規(guī)則，且對低劑量的效價難于測定，使效價測定的誤差更大。而紅霉素與磷酸進行水解反應顯色在特定波長處有最大吸收，利用這一特性我們可以用紫外可見分光光度法（UV）代替管碟法進行紅霉素效價的測定。紫外可見分光光度法 唐建. 分光光度法測定紅霉素及該類藥品的含量J. 中國獸藥雜志，2000, 35(3)：24-26.- 金紅星,胡炎華,成文玉. 可見光分光光度法

7、測定米曲霉發(fā)酵液中總黃酮J. 中國釀造，2009（9）：142-144.只能測其總效價，而不能將多組分的紅霉素的各種組分分離或分別計算其含量。紅霉素是多組分的抗生素，除部分A外，尚有少量或微量的B、C、D等，因此，明確單獨紅霉素A的效價很重要。高效液相色譜法 齊霞昌,陳昌發(fā),錢江潮,等.采用高效液相色譜測定紅霉素發(fā)酵液組分J. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2009, 35(7)：151-155.是20世紀70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術,它是在經典液相色譜基礎上，引入氣相色譜理論，在技術上采用高壓輸液泵、剃度洗脫技術、新型高效填充劑以及各種高靈敏度檢測器，與經典液相色譜相比較，具有分析速度快、分離

8、效率高、靈敏度高和操作自動化等優(yōu)點。所以我們可利用HPLC來測定紅霉素A的含量。本文把UV作為發(fā)酵液中紅霉素效價測定的初篩方法，然后將高效價的發(fā)酵液進一步用HPLC進行復篩，考察紅霉素A的含量。1 材料與方法1.1菌種 紅色鏈霉菌(Streptomyces Erythreus)，實驗室保存。1.2儀器與試劑752型紫外可見分光光度計：上海凌光技術有限公司；P230型高效液相色譜儀：大連依利特儀器公司；甲醇(色譜純)、乙睛(色譜純)、K2HPO4、磷酸、雙蒸水,所用試劑皆為分析純。1.3 分析方法紫外分光光度法采用紫外可見分光光度計752s型（上海棱光技術有限公司）進行測定。 高效液相色譜法不銹

9、鋼色譜柱(內裝填料PLRS-S，100，8m，色譜柱長250mm，內徑4.6mm，Agilent)；流動相：V（0.025 mol/L的K2HPO4溶液）V（乙睛）= 6040；流速：1.0mL/min；進樣量100L。1.4 標準品的配制精密稱取紅霉素標準品(標準品效價1000g/mL)0.0500g置50ml容量瓶內，加入5ml無水乙醇溶解后，用水沖液稀釋至刻度，既得l000g/mL的紅霉素樣品液。精確吸取紅霉素樣品液(1000g/mL)l、2、3、5、8mL，(濃度相當于1000、2000、3000、5000、8000g/mL)分別置于5個10ml干燥容量瓶中，精密補水使之總體積為10m

10、l，既得100、200、300、500、800g/mL的紅霉素標準液。1.5 供試品的處理與配制紫外分光光度法：取經濾紙過濾后的發(fā)酵液1mL置于1個10mL干燥容量瓶中，精密補水使之總體積為10ml，既得供試品溶液。高效液相色譜法：取經濾紙過濾后的發(fā)酵液10mL加入等體積正庚烷，搖勻，取下層，加入10mL氯仿萃取,將萃取液分裝，自然晾干后，加入流動相溶解，經0.45m濾膜過濾, 既得供試品溶液。2 結果與討論2.1 紫外分光光度法 測定波長的選擇精密吸取300g/mL紅霉素標準溶液2.0ml置于25mL容量瓶中，精密加入10mol/L磷酸溶液10ml搖勻，放入沸水浴中煮沸3min，取出放冷至室

11、溫，再用10mo1/L磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，用分光光度計在450520nm范圍內測定吸收度，結果見圖1。由圖1可以看出紅霉素標準液在485nm下的吸收度最大，所以本實驗確定485nm為紅霉素紫外可見分光光度法的檢測波長。圖1 不同波長下的吸收度Figure 1. The absorbance in different wavelength2.1.2顯色劑加入量的確定 精密吸取300g/mL紅霉素標準溶液2.0ml置于25mL容量瓶中，精密加入10mol/L磷酸溶液2、4、6、8、10、12、14ml搖勻，放入80的水浴鍋中反應3min，取出放冷至室溫，再用10mo1/L磷酸溶液稀釋至刻度，

12、搖勻，用分光光度計在在485nm范圍內測定吸收度。取500g/mL的濃度按上述方法重試，結果如表1。由表1可以看出，10mL的10mo1/L磷酸溶液與紅霉素溶液反應能保持相對穩(wěn)定，所以本實驗確定10mL為顯色劑的加入量。表1 不同顯色劑加入量下的吸收度Table 1. The absorbance in different colour developing agent紅霉素濃度(g/mL)10mo1/L 磷酸溶液（mL）24681012143000.1130.1450.2730.3290.3540.3410.2985000.2080.2290.4870.5660.5970.5810.5022

13、.1.3水解反應時間的影響精密吸取300g/mL紅霉素標準溶液2.0ml置于25mL容量瓶中，精密加入10mol/L磷酸溶液10ml搖勻，放入80的水浴鍋中反應1、2、3、4、5min，取出放冷至室溫，再用10mo1/L磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，用分光光度計在在485nm測定吸收度。取500g/mL的濃度按上述方法重試，結果如表2。由表2可以看出，紅霉素與10mo1/L磷酸溶液反應，在3min的時候達到穩(wěn)定，所以本實驗確定3min為水解反應時間。表2 不同水解反應時間下的吸收度Table 2. The absorbance in different reaction time紅霉素濃度(g/m

14、L)水解反應時間（min）123453000.0920.1980.3540.3520.3245000.1360.3590.5970.5930.5712.1.4線性關系考察分別精密吸取100、200、300、500、800g/mL的紅霉素標準液2.0ml置于25ml容量瓶中，各精密加入10mol/L磷酸溶液10ml搖勻，放入80的水浴鍋中保溫3min，取出放冷至室溫，再用10mo1/L磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，用分光光度計在485nm處測定吸收度，以吸光度對紅霉素濃度(g/mL )繪制標準曲線，得回歸方程：y = 868.11x+16.61（r = 0.9996）。 2.1.5 加樣回收率實驗精

15、密吸取供試品溶液2.0ml分別置于5個25ml容量瓶中，各精密加入10mol/L磷酸溶液10ml搖勻，放入80的水浴鍋中保溫3min，取出放冷至室溫，再用10mo1/L磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻，用分光光度計在485nm處測定吸收度。同時作加標回收試驗,說明該法的可靠性，結果見表3。測定其平均回收率為100.08%，RSD為3.26%。表3樣品分析結果及回收試驗Table 3. Analysis results and recovery of erythromycin樣品測得的吸光度紅霉素濃度/(g/mL)加入標準量/(g/mL)測得的吸光度加標的紅霉素濃度/(g/mL)回收率/%平均回收率/%

16、RSD/%10.677604.3100.00.793705.0100.12100.083.2620.668596.5100.00.786698.9100.5030.672600.0100.00.789701.5100.2540.676603.5100.00.790702.499.8250.680606.9100.00.793705.099.692.2 高效液相色譜法2.2.1 測定波長的選擇取紅霉素標準溶液，以流動相為空白，用紫外可見檢測器測定，發(fā)現(xiàn)在210nm處有最大吸收，現(xiàn)代藥物分析認為在215nm處有最大吸收,因此采用四個波長（205nm、210nm、215nm、220nm）進行檢測，結

17、果在210nm的峰面積最大，所以選擇210nm作為高效液相色譜法檢測紅霉素的檢測波長。圖2 不同波長下的峰面積Figure 2. The peak area of erythromycin in different wavelength2.2.2 柱溫的選擇取30、40、50來檢測不同柱溫對液相色譜檢測效果的影響。溫度升高使流動相擴散增強，加快了流動相的層流和分析物分子的混合，紅霉素分離出來的保留時間減少，峰行又窄有高，分離效果好，但溫度過高，會使色譜柱不穩(wěn)定，影響柱子的壽命。所以選擇柱溫為50。304050圖3 溫度對紅霉素的影響Figure 3. Effect of temperature

18、 on erythromycin 2.2.3不同組分的標準色譜圖將混有紅霉素A、紅霉素B、紅霉素C的樣品配置成標準溶液進行液相檢測，觀察分離情況，從下圖我們可以發(fā)現(xiàn)三者有較好的分離。紅霉素B紅霉素A紅霉素C圖4 紅霉素A、B、C混合標準色譜圖Figure 4. Chromatogram for mixed of erythromycin A、B and C2.2.4 線性關系考察將100、200、300、500、800g/mL的紅霉素標準液在上述色譜條件下進樣測定，以峰面積對紅霉素濃度繪制標準曲線，得回歸方程：y = 0.1004x-3.2934（r = 0.9997）。2.2.5 加樣回收率

19、試驗精密吸取供試品溶液5份，每份0.5mL，一份作為空白對照，另外四份分別加入等體積濃度為100、200g/mL的標準液，測定結果見表4。測定其平均回收率為99.88%，RSD為0.57%。表4樣品分析結果及回收試驗Table 4. Analysis results and recovery of erythromycin樣品紅霉素濃度/(g/mL)加入標準量/(g/mL)加標的紅霉素濃度/(g/mL)回收率/%平均回收率/%RSD/%1549.8100.0650.1100.399.880.572100.0648.999.13200.0749.399.84200.0750.4100.32.2.7 標樣及發(fā)酵液分離色譜圖 在上述的色譜條件下，對照品和經過處理后的發(fā)酵