人造礦物纖維對肺泡巨噬細胞的毒作用研究

1、人造礦物纖維對肺泡巨噬細胞的毒作用研究    王起恩1韓春華2吳衛(wèi)東1劉世杰1神山宣彥3 【摘要】目的比較10種人造礦物纖維對肺泡巨噬細胞毒作用的差異。方法選用日本纖維狀物質(zhì)研究協(xié)會提供的10種標準人造礦物纖維(JFM纖維)，在體外用豚鼠肺泡巨噬細胞(AM)作為靶細胞，分別對JFM纖維作用于AM后超氧陰離子自由基（O-2）、過氧化氫（H2O2）的產(chǎn)生，谷胱甘肽(GSH)及細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的變化進行了測定。結(jié)果10種JFM纖維中，大多數(shù)都可引起O-2和H2O2的產(chǎn)生增多、GSH含量下降及細胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高，但其作用均低于溫石棉。結(jié)論JFM纖維

2、的一般細胞毒性均低于溫石棉。這些人造礦物纖維雖然作為石棉的代用品使用，但對機體仍會產(chǎn)生一定的有害作用。 【關(guān)鍵詞】細胞毒性，免疫活性氧組分人造礦物纖維 Studies on Cytotoxicity of Man-Made Mineral Fiber to Alveolar MacrophageWang Qi′en*, Han Chunhua, Wu Weidong, et al.*Department of Occupational Health, Beijing Medical University, Beijing 100083 【Abstract】Objective

3、To compare the difference in cytotoxicity to human alveolar macrophage caused by ten kinds of man-made mineral fiber. MethodsTen kinds of man-made mineral fiber prepared by Japan Fibrous Materials Research Association (JFM) were used with alveolar macrophage extracted from guinea pigs in vitro as th

4、e target cells. Changes in the production of O-2 and H2O2, levels of glutathione and cellular free calcium ion (Ca2+) in alveolar macrophage were determined. ResultsMost of the 10 kinds of JFM fiber could cause increased production of O-2 and H2O2, reduction of levels of glutathione and increase of

5、cellular free calcium ion (Ca2+) in alveolar macrophage, to a extent less than that caused by chrysotile. ConclusionIn general, the cytotoxicity of JFM fiber was less than that of chrysotile. Although these mineral fiber could be used as substitutes for asbestos, they still could cause certain harm

6、to human bodies. 【Key words】Cytotoxicity, immunologicReactive oxygen speciesMan-made mineral fiber 由于石棉已被確定為人類致癌物，因此近年來各種石棉代用品的開發(fā)和使用越來越多，其中以人造礦物纖維(MMMF)為目前最主要的石棉代用品。70年代末已有動物實驗表明，MMMF對機體也存在有害作用，其中包括致癌作用，但迄今尚缺乏人群流行病學調(diào)查資料。本研究選用了日本纖維狀物質(zhì)研究協(xié)會(JFMRA)提供的10種標準人造礦物纖維(JFM纖維)以及UICC溫石棉B，以肺泡巨噬細胞作為靶細胞，比較這10種JFM纖維

7、產(chǎn)生活性氧等指標的作用，并對其細胞毒作用機制進行了探討。 材料與方法 1.人造礦物纖維：JFM纖維由日本中央勞動災(zāi)害防止協(xié)會提供（日本勞動省產(chǎn)業(yè)醫(yī)學綜合研究所神山宣彥博士研制），其名稱及主要特性見表1。石棉為UICC溫石棉B。 2. 細胞：豚鼠肺泡巨噬細胞(AM)經(jīng)支氣管肺泡灌洗法獲得。 3. 超氧陰離子自由基(O-2)的測定1：取2×106個AM，分別加入200 μg/ml的溫石棉或JFM纖維，在37作用2小時后，用細胞色素C還原法測定還原型細胞色素C的生成量來代表O-2的產(chǎn)生量。 4. 過氧化氫(H2O2)的測定2：取2×106個AM，

8、分別加入200 μg/ml的溫石棉或JFM纖維，在37作用2小時后，用酚紅氧化法測定H2O2的產(chǎn)生量。 5. 谷胱甘肽(GSH)含量的測定3：取2×106個AM，分別加入200 μg/ml的溫石棉或JFM纖維，在37作用2小時后，超聲破碎細胞，用熒光法測定GSH的含量。 6. 細胞內(nèi)游離Ca2+濃度的測定4：取1×106個AM，用Fluo-3/AM負載后，分別加入200 μg/ml的溫石棉或JFM纖維，在37作用1小時后，用熒光分光光度計測定熒光強度。 7. 統(tǒng)計分析方法：用Primer軟件對數(shù)據(jù)進行t檢驗。 結(jié)

9、果 JFM纖維對AM產(chǎn)生O-2、H2O2、GSH和游離Ca2+含量的影響見表2。 討論 在礦物纖維的致病機理中，活性氧被認為起了很重要的作用5。本研究結(jié)果表明，溫石棉使AM產(chǎn)生的O-2和H2O2量均明顯增多，而在10種JFM纖維中，除WO1外，其他均可使O-2的產(chǎn)生明顯增多，但其中只有GW1、SC1、RW1、TO1、WO1和MG1產(chǎn)生的H2O2明顯增多，其他4種JFM纖維則與對照的差異無顯著性，提示不同的JFM纖維刺激AM產(chǎn)生活性氧的能力不同。與溫石棉相比，在刺激O-2產(chǎn)生的過程中，10種JFM纖維均明顯低于溫石棉；而在刺激H2O2的產(chǎn)生過程中，只有GW1的作用與溫石棉相似，其他JFM纖維產(chǎn)生

10、活性氧的能力則均低于溫石棉。有研究表明,陶瓷纖維(RCF14)、玻璃棉(MMVF10和11)、巖棉(MMVF21)和礦渣棉(MMVF22)均能使活性氧的產(chǎn)生增多6。巖棉(MMVF21)和玻璃纖維(CODE100/475)、陶瓷纖維(碳化硅和RCF1)可使AM產(chǎn)生少量的O-27。結(jié)合本結(jié)果，可以認為大多數(shù)MMMF均可刺激活性氧的產(chǎn)生，除個別纖維外，其刺激程度均低于石棉。雖然MMMF通過活性氧致病的作用低于石棉，但仍存在不同程度的毒性作用，值得引起注意。 玻璃棉(MMVF10)和陶瓷纖維(RCF1)均可使AM中的GSH含量下降，但其程度均低于鐵石棉8。本結(jié)果也表明，溫石棉與PT1、TO1、SC1、

11、WO1、MG1和RF2均可明顯降低AM中的GSH含量。其中PT1和TO1的作用與溫石棉相似，提示這些MMMF的確可使細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激。 表1實驗所用礦物纖維的名稱及長度與直徑(μm) 樣品名 中文名稱 英文名稱 長度 直徑 GW1 玻璃棉 glass wool 20.2±2.58 0.88±3.10 RW1 巖棉 rock wool 16.5±2.51 1.80±2.32 MG1 微細玻璃纖維 micro glass fiber 3.0±2.22 0.24&plu

12、smn;2.35 RF1 耐火纖維(陶瓷纖維) refractory fibers (ceramic fiber) 12.0±2.36 0.77±2.53 RF2 耐火纖維(陶瓷纖維) refractory fibers (ceramic fiber) 11.0±1.96 1.10±2.00 RF3 耐火纖維(富鋁紅柱石) refractory fibers (mullite fiber) 11.0±1.75 2.40±1.37    

13、; PT1 鈦酸鉀須晶 potassium titanate whisker 6.0±2.04 0.35±1.51 SC1 碳化硅須晶 silicon carbide whisker 6.4±2.45 0.30±1.58 TO1 氧化鈦須晶 titanium oxide whisker 2.1±2.00 0.14±1.53 WO1 硅灰石(天然礦物纖維) wollastonite (nature mineral fiber) 10.5&plusm

14、n;2.03 1.00±1.72 表2標準人造礦物纖維對豚鼠肺泡巨噬細胞產(chǎn)生O-2、H2O2、谷胱甘肽和 游離Ca2+的影響(±s，n=4) 序位 礦物纖維 還原型細 胞色素C (μmol/L) 礦物 纖維 H2O2 (μmol/L) 礦物 纖維 谷胱甘肽 (μg/106 細胞) 礦物 纖維 游離Ca2+ (nmol/L) 1 溫石棉 14.50± 0.20* GW1 4.033± 0.266* PT1 0.188± 0.007* 溫石棉 1

15、563.4± 264.9* 2 RW1 11.34± 1.19* 溫石棉 3.948± 0.461* 溫石棉 0.198± 0.017* SC1 640.1± 103.3* 3 RF2 11.13± 0.87* SC1 2.200± 0.266* TO1 0.221± 0.016* TO1 425.7± 26.5* 4 RF1 10.98± 0.58* RW1 2.157&am

16、p;plusmn; 0.128* SC1 0.261± 0.020* PT1 418.5± 36.2* 5 RF3 10.82± 0.67* TO1 2.157± 0.222* WO1 0.280± 0.017* MG1 380.9± 28.0* 6 PT1 10.60± 1.02* WO1 2.157± 0.221* MG1 0.340± 0.011* RF3 363.8±

17、43.9* 7 TO1 10.51± 0.68* MG1 2.072± 0.074* RF2 0.430± 0.012* RF2 347.1± 30.1* 8 MG1 10.34± 0.93* PT1 1.859± 0.074 RF3 0.448± 0.013 RF1 340.0± 24.1* 9 GW1 10.13± 0.33* RF3 1.859± 0.147 GW1 0.

18、452± 0.013 RW1 329.4± 23.7* 10 SC11 9.86± 0.30* RF2 1.817± 0.074 RF1 0.455± 0.021 WO1 329.3± 55.3 11 WO1 6.96± 0.65 RF1 1.689± 0.074 RW1 0.488± 0.021 GW1 259.1± 28.8 12 空白對照組 6.74&plusmn

19、;0.58 空白對照組 1.475±0.266 空白對照組 0.488±0.033 空白對照組 256.3±33.1 與對照組比較*P<0.05，*P<0.01；與溫石棉組比較P<0.05，P<0.01 本結(jié)果還表明，溫石棉可使AM中游離Ca2+升高5倍，而10種JFM纖維中，除WO1和GW1外都可使AM中游離Ca2+水平發(fā)生不同程度的升高，但均低于溫石棉的效應(yīng)。提示多數(shù)MMMF可引起細胞內(nèi)游離Ca2+穩(wěn)態(tài)失調(diào)，這也可能是MMMF引起細胞毒作用(包括致癌作用)的一種機制。

20、早期研究認為，纖維的幾何形狀、長度和直徑、表面積等與其致病性有密切關(guān)系。我們根據(jù)表1中各種纖維的長度和直徑的乘積，算出每根纖維的比表面積。在同一重量的條件下，凡是細小的纖維，其實際根數(shù)也越多，其比表面積也越大。我們按計算所得的比表面積大小先排隊，然后再與4個指標的排隊結(jié)果相對應(yīng)，這時看到GSH和游離Ca2+與比表面積前4位排序的結(jié)果總數(shù)十分相似，表明這兩個指標與JFM纖維的比表面積有著十分密切的關(guān)系。這是因為分散度大，比表面積大，表面多帶負電荷，因而吸附細胞蛋白也多，其細胞毒性也必然相對較大。然而與產(chǎn)生活性氧的兩個指標的排序相比，則似乎沒有明確的關(guān)系。由此可知，JFM纖維雖均可刺激AM產(chǎn)生O-

21、2和H2O2，但與長度×直徑所得的比表面積無關(guān)，表明這種刺激AM產(chǎn)生O-2和H2O2的機制與MMMF的比表面積大小無關(guān)，而是通過其他途徑。此種排序比較的方法對多數(shù)致病性指標探索其因果關(guān)系時，不失為一種有益的嘗試。 綜上所述，本實驗通過4個毒性指標，初步認為10種JFM纖維的毒性均低于溫石棉，但由于10種JFM纖維在不同指標中所表現(xiàn)出的毒作用程度不同，僅用這4個指標很難區(qū)別出哪種纖維對機體的危害最大。因此有必要對這10種JFM纖維的毒性采用多種方法進行觀察，最后再綜合分析判斷。 本研究受日中醫(yī)學協(xié)會資助 作者單位：1 北京醫(yī)科大學勞動衛(wèi)生教研室100083，2 北京體育師范學

22、院，3 日本勞動省產(chǎn)業(yè)醫(yī)學綜合研究所 參考文獻 1Greenwald RA. CRC handbook of methods for oxygen radical research. Florida: CRC Press, 1985. 120-147. 2Pick E, Keisari Y. A simple colorimetric method for the measurement of hydrogen peroxide produced by cells in culture. J Immunol Methods, 1980, 38: 161-170. 3沈惠麒, 趙利英, 曲青山，等. 組織中谷胱甘肽的熒光測定法. 中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志, 1988, 6: 103-105. 4Qu QS, Chen LC. Modulation of Ca2+ influx by a mediator released from human tracheal epithelial cells exposed to ozone in vitro. Am J Physiol