HPV18型E2蛋白高表達(dá)對巨噬細(xì)胞凋亡及其分泌功能的影響

1、HPV18型E2蛋白高表達(dá)對巨噬細(xì)胞凋亡及其分泌功能的影響 作者：彭俊, 朱翠明, 余敏君, 曹清香, 王鑫, 萬艷平【摘要】 目的: 研究HPV18 E2及其N端(TAD)、 C端(DBD)與GFP融合蛋白瞬時高表達(dá)對巨噬細(xì)胞（M）凋亡及分泌活性的影響, 為進(jìn)一步研究E2蛋白在HPV18致癌機(jī)制中的作用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法: 通過PCR從現(xiàn)有真核表達(dá)載體pEGFPC1/E2上分別擴(kuò)增出TAD、 DBD基因片段, 并構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFPC1/TAD、 pEGFPC1/DBD。將3種真核表達(dá)載體及pEGFPC1分別轉(zhuǎn)染M, 用倒置熒光顯微鏡觀察它們的表達(dá)與定位, 并以抗GFP抗體為一抗作We

2、stern blot檢測它們的表達(dá)。通過3種融合蛋白在M內(nèi)的瞬時高表達(dá), 在轉(zhuǎn)染48 h后分別檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF和IL1的含量, 并收集M經(jīng)染色以及流式細(xì)胞術(shù)（FCM）觀察檢測其凋亡。結(jié)果: GFPE2融合蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)也有表達(dá), 而GFPDBD融合蛋白僅表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi), GFPTAD僅表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。GFPE2、 GFPTAD融合蛋白在M內(nèi)高表達(dá)后M凋亡率上升, 細(xì)胞因子TNF和IL1分泌量增加, 且GFPTAD作用強(qiáng)于GFPE2。而EGFPDBD無此作用。結(jié)論: HPV18 E2及其TAD與EGFP融合蛋白瞬時高表達(dá)可誘導(dǎo)M凋亡并上調(diào)其分泌細(xì)胞因子TNF和IL1。

3、【關(guān)鍵詞】 人乳頭瘤病毒18型 E2蛋白 巨噬細(xì)胞 凋亡 細(xì)胞因子Abstract AIM: To study the effect of the over expression of GFPE2, GFPTAD(Nextremity domain of HPV18 E2) and GFPDBD (Cextremity domain of HPV18 E2) on the apoptosis and secretion of macrophages and to further explore the contribution of E2 gene to the uterine cervix

4、cancer. METHODS: TAD or DBD gene was amplified from pEGFPC1/HPV18 E2 by PCR respectively and then cloned into pEGFPC1 vector. After the transfection of recombinant plasmids or pEGFPC1 into the macrophages, their expression was examined by fluorescent microscopy and Western blot. The cytokine content

5、 of TNF or IL1 in the culture medium was tested quantitatively with ELISA kit respectively. The stained macrophages were observed and their apoptosis rate was tested by flow cytometry. RESULTS: After transfected into macrophages, GFPE2 fusion protein was mainly located in cytoplasma while GFPDBD fus

6、ion protein was completely located in nuclei and GFPTAD fusion protein was completely located in cytoplasma. The overexpression of GFPE2 or GFPTAD increased the level of TNF and IL1 and upregulate the apoptosis rate of macrophages. Furthermore, the effect of GFPTAD was obvious except on IL1 level bu

7、t the overexpression of GFPDBD did not show the same effect. CONCLUSION: The overexpression of GFPE2 or GFPTAD fusion protein can induce the apoptosis macrophages and upregulate TNF or IL1 secretion of macrophages.KeywordsHPV18; E2 protein; macrophage; apoptosis; cytokine人乳頭瘤病毒（human papillomavirus,

8、 HPV）高危型如HPV16、 18等常引起重度不典型性增生,甚至惡性腫瘤1。HPV18是一種無包膜的環(huán)狀病毒, 基因全長7900 bp, 早期基因區(qū)編碼的E2蛋白由365個氨基酸組成, 分為2個結(jié)構(gòu)域: N端轉(zhuǎn)錄活化結(jié)構(gòu)域（transactivation domain, TAD）, 由206 aa組成; C端DNA結(jié)合域（DNAbinding domain, DBD）, 由80 aa組成; 中間是一個可變的鉸鏈區(qū)（hinge）, 由79 aa組成2。E2蛋白既調(diào)節(jié)病毒的轉(zhuǎn)錄又調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制, 且通過多種途徑影響細(xì)胞增殖。目前國內(nèi)外有不少學(xué)者將E2蛋白用來研發(fā)HPV疫苗。 M是機(jī)體抗腫瘤免疫中

9、的重要效應(yīng)細(xì)胞, 激活的M可分泌TNF、 IL1等細(xì)胞因子直接殺瘤或抑制瘤細(xì)胞生長。HPV感染后, 在真皮基質(zhì)可檢測到大量的巨噬細(xì)胞。尖銳濕疣患者外周血TNF水平明顯高于正常對照組3, HPV感染者血漿及宮頸分泌物中IL1水平也升高4。本實(shí)驗(yàn)中我們通過檢測HPV18 E2蛋白及其TAD、 DBD高表達(dá)對M凋亡及其分泌TNF和IL1的影響, 為HPV18致癌機(jī)制以及E2蛋白相關(guān)疫苗的研究奠定前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。1 材料和方法1.1 材料 真核表達(dá)載體pEGFPC1、 pEGFPC1/HPV18 E2由法國巴斯德研究所Francoise Thierry教授惠贈; E.coli JM109由本室保存; 人

10、單核細(xì)胞白血病THP1細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保存中心（武漢）; 低溫高速離心機(jī)是HETTICH公司產(chǎn)品; 倒置熒光顯微鏡是日本Nikon公司產(chǎn)品; 全自動酶標(biāo)儀是芬蘭雷勃公司產(chǎn)品; 限制性核酸內(nèi)切酶、 T4 DNA連接酶、 佛波脂購于深圳晶美生物公司; SofastTM轉(zhuǎn)染試劑購于夏門太陽馬生物有限公司; 兔抗GFP抗體購于eBioscience公司; HRP標(biāo)記羊抗兔IgG購自Solarbio公司; TNF和IL1定量檢測試驗(yàn)盒購于上海森雄科技實(shí)業(yè)有限公司。1.2 方法1.2.1 pEGFPC1/TAD、 pEGFPC1/DBD重組載體的構(gòu)建 分別設(shè)計(jì)上、 下游含限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I

11、、 BamH I酶切位點(diǎn)的2對引物。P1: 5GTAGAATTCCATGGAGACACCGAAGGAAAC3和P2: 5CCCGGATCCACTGCACATAGAGTCATTAC3; P3: 5GCGAATTCCACTACGCCTATAATAC3和P4: 5GCCGGATCCTTACATTGTCATGTATC3。以pEGFPC1/E2為模板, 通過PCR分別擴(kuò)增出TAD、 DBD基因片段。以EcoR I、 BamH I雙酶切TAD、 DBD及空載體pEGFPC1, 用T4 DNA酶過夜連接, 轉(zhuǎn)化E.coli JM109并提取質(zhì)粒, 酶切鑒定后送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。1.2.2

12、 重組質(zhì)粒在M中的表達(dá)與定位 懸浮細(xì)胞THP1在體外培養(yǎng)經(jīng)佛波脂（PMA）活化后可分化為貼壁的M5。轉(zhuǎn)染前3 d, THP1細(xì)胞用按0.4×109細(xì)胞/L轉(zhuǎn)入24孔板, 每孔1 mL, 培養(yǎng)24 h后加入終濃度為40 g/L的PMA誘導(dǎo)48 h。用新鮮培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞后每孔分別加入3種重組質(zhì)粒及pEGFPC1各0.5 g, 同時作空白對照, 用SofastTM轉(zhuǎn)染試劑按說明書轉(zhuǎn)染細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后6 h, 用新鮮培養(yǎng)基洗滌2次, 每孔加1 mL培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。用倒置熒光顯微鏡觀察綠色熒光的表達(dá)與定位, 在表達(dá)熒光細(xì)胞數(shù)量最多時收集細(xì)胞, 置4下加入50 L細(xì)胞裂解液30 min, 100

13、00 r/min4離心5 min, 收獲細(xì)胞裂解上清液經(jīng)SDSPAGE后, 以抗GFP抗體為一抗作Western blot鑒定。1.2.3 重組質(zhì)粒高表達(dá)對M凋亡及其分泌活性影響的測定 按上述方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞, 每組設(shè)6個復(fù)孔, 然后于表達(dá)熒光細(xì)胞數(shù)量最多時取培養(yǎng)液100 L, 用TNF和IL1定量ELISA試劑盒按說明分別測定A492值, 求出TNF和IL1含量(ng/L)。同時取每組前3孔細(xì)胞作Giemsa染色, 顯微鏡下觀察各組M的形態(tài)變化, 并收集后3孔M于1.5 mL EP管中, 加入1 mL700 mL/L乙醇4過夜后由中國中醫(yī)藥研究院基礎(chǔ)所經(jīng)FCM測定細(xì)胞凋亡率（PI法）。結(jié)果用統(tǒng)計(jì)

14、學(xué)軟件SPSS13.0作多個樣本均數(shù)的多重比較分析。2 結(jié)果2.1 重組質(zhì)粒的鑒定 雙酶切重組質(zhì)粒瓊脂糖電泳結(jié)果見圖1。經(jīng)測序證明重組質(zhì)粒分別含有618 bp、 243 bp的目的基因片段, 無堿基錯配和移碼突變, 且分別與HPV18 E2 TAD和DBD讀碼框完全一致（數(shù)據(jù)未顯示）。圖1 pEGFPC1/DBD重組質(zhì)粒的鑒定（略）Fig 1 Enzymatic digestion of pEGFPC1/TAD and pEGFPC1/DBD recombinant1: 100 bp DNA marker; 2: pEGFP-C1/TAD cut with BamH I and EcoR I;

15、 3: TAD DNA fragment; 4: pEGFPC1/DBD cut with BamH I and EcoR I; 5: DBD DNA fragment; 6: pEGFPC1 cut with BamH I and EcoR I; 7: DNA marker DL 15000.2.2 重組質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)與定位 經(jīng)倒置熒光顯微鏡觀察, 重組質(zhì)粒的表達(dá)定位如圖2, GFPDBD融合蛋白完全表達(dá)定位于細(xì)胞核內(nèi), GFPTAD完全表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì), GFPE2、 GFP在細(xì)胞核、 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá), 但GFPE2表達(dá)組細(xì)胞核熒光亮度強(qiáng)于細(xì)胞胞質(zhì), GFP在細(xì)胞核質(zhì)內(nèi)呈均勻表達(dá)。轉(zhuǎn)

16、染48 h后發(fā)熒光細(xì)胞數(shù)量最多, 收集此時的細(xì)胞裂解, Western blot結(jié)果（圖3）, 圖3中相對分子質(zhì)量(Mr)約29400、 53400、 70700、 38600的條帶分別與預(yù)期GFP、 GFPTAD、 GFPE2、 GFPDBD大小一致。圖2 重組質(zhì)粒在細(xì)胞中表達(dá)的熒光顯微照片（略）Fig 2 Fluorescent microscopical photos of cells expressing(×400)圖3 重組質(zhì)粒在M表達(dá)產(chǎn)物的Western blot分析（略）Fig 3 Western blot result of macrophages transfect

17、ed by one kind of recombinant plasmids1: Macrophages lysate; 2: Macrophages lysate transfected by pEGFPC1; 3: Macrophages lysate transfected by pEGFPC1/TAD; 4: Macrophages lysate transfected by pEGFPC1/E2; 5: Macrophages lysate transfected by pEGFPC1/DBD.2.3 重組質(zhì)粒高表達(dá)對M分泌活性的影響 于48 h測各組培養(yǎng)液中TNF和IL1含量, 將

18、每組6個數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析, 結(jié)果（圖4）顯示: GFPE2、 GFPTAD表達(dá)組2種細(xì)胞因子含量均明顯升高, 與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。GFPE2與GFPTAD之間TNF濃度也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）, GFPTAD表達(dá)組TNF濃度大于GFPE2表達(dá)組; IL1濃度無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。GFPDBD、 GFP瞬時高表達(dá)對2種細(xì)胞因子的分泌均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖4 細(xì)胞培養(yǎng)基上清中TNF和IL1的濃度（略）Fig 4 The level of TNF or IL1 in the cell culture med

19、ium2.4 重組質(zhì)粒高表達(dá)對M凋亡的影響 于48 h后取各細(xì)胞作Giemsa染色, 鏡下觀察如圖5所示: 對照組和GFP、 GFPDBD表達(dá)組大部分M中等大小, 單個散在, 梭形或多角形, 折光性好, 呈正常細(xì)胞形態(tài)。GFPTAD、 GFPE2表達(dá)組部分M體積變小、 變圓, 細(xì)胞聚集, 胞質(zhì)濃縮, 核濃染, 部分細(xì)胞溶解、 核碎裂, 呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞形態(tài)。 FCM檢測各組細(xì)胞凋亡率, 將每組3個數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)分析, 結(jié)果: GFPE2、 GFPTAD表達(dá)組(n=3)M凋亡率明顯升高, 與對照組(n=3)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(11.99±0.58)% vs (4.48

20、7;0.55)%、 (13.89±0.83)% vs (4.48±0.55)%, P<0.001。GFPE2與GFPTAD之間M凋亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(11.99±0.58)% vs (13.89±0.83)%, P<0.05。GFPDBD、 GFP瞬時高表達(dá)組（n=3）M凋亡率與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.87±0.69)% vs (4.48±0.55)%、 (4.58±1.15)% vs (4.48±0.55)%。圖5 Giemsa染色的各組M（略）Fig 5 The Giemsa st

21、ain of macrophages in different groups(×400)3 討論 在與HPV18 相關(guān)的宮頸癌中, 常發(fā)現(xiàn)其DNA整合于宮頸癌細(xì)胞基因組, 但在該整合過程中, 通常存在E2基因的缺失, 缺少E2蛋白的表達(dá)是HPV18所致宮頸癌的一個重要標(biāo)志。而且, 在HPV18感染的宮頸癌細(xì)胞中, 重新引入E2基因可以抑制HPV致癌基因E6、 E7的表達(dá), 使細(xì)胞周阻滯止于G1期, 細(xì)胞發(fā)生衰老或凋亡6。這些結(jié)果表明, HPV18 E2蛋白在癌變過程中可能發(fā)生負(fù)調(diào)控的作用。 M是重要免疫細(xì)胞, 具有較強(qiáng)吞噬和殺傷能力, 可調(diào)控局部細(xì)胞微環(huán)境及抑制腫瘤, 并能提呈抗原和

22、產(chǎn)生TNF、 IL1等細(xì)胞因子, 參與機(jī)體特異性免疫應(yīng)答。本研究中我們將HPV18 E2及其TAD、 DBD與EGFP融合蛋白載體在M中瞬時高表達(dá)發(fā)現(xiàn), GFPDBD融合蛋白完全表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi), GFPTAD完全表達(dá)于細(xì)胞質(zhì), GFPE2、 GFP在細(xì)胞核、 質(zhì)內(nèi)均有表達(dá), 但GFPE2主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)。該現(xiàn)象與Blachon等7的研究結(jié)果相一致, HPV18 E2蛋白N端結(jié)構(gòu)域含有一段核輸出序列（nuclear export sequence, NES）, C端結(jié)構(gòu)域含有一段核定位序列（nuclear localization sequence, NLS）。同時, 我們發(fā)現(xiàn)GFPE2、 G

23、FPTAD瞬時高表達(dá), 可上調(diào)M分泌TNF和IL1, 并誘導(dǎo)M凋亡, 且除IL1外, GFPTAD的作用均強(qiáng)于GFPE2, 原因可能是由于在細(xì)胞內(nèi)定位的不同導(dǎo)致其作用的差異。而GFPDBD、 GFP瞬時高表對M的分泌和凋亡均無顯著性影響, 這表明在無HPV感染的M中, 起作用的是E2蛋白N端結(jié)構(gòu)域。TNF與腫瘤細(xì)胞凋亡密切相關(guān), 當(dāng)M分泌TNF的量顯著升高時, 也有可能影響M的凋亡率。適量的TNF介導(dǎo)的免疫反應(yīng)對機(jī)體具有保護(hù)作用, 它可抑制病毒復(fù)制, 選擇性破壞病毒感染細(xì)胞, 但過量的TNF則會引起機(jī)體的損傷。在宮頸上皮內(nèi)瘤變前期E2蛋白高表達(dá), 而后期病變和高度惡性的宮頸癌中, 存在E2蛋白

24、去表達(dá)及E6、 E7癌蛋白的高表達(dá)的現(xiàn)象8, 本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)GFPE2、 GFPTAD在體外培養(yǎng)的M中瞬時高表達(dá)上調(diào)其TNF和IL1分泌水平, 因此我們推測E2蛋白對HPV感染者體內(nèi)細(xì)胞因子水平的改變以及免疫應(yīng)答方面起重要作用, 但HPV18 E2蛋白上調(diào)M分泌TNF對機(jī)體起何種作用及其機(jī)制目前尚不清楚, 有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Munoz N, Bosch FX, de Sanjose S, et al. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical canc

25、erJ. N Engl J Med, 2003, 348(6): 518-527.2 Dell G, Gaston K. Contributions in the domain of cancer research: Review Human papillomaviruses and their role in cervical cancer J. CMLS, 2001, 58(12): 1923-1942.3 顧 群, 孫脊峰, 余春艷, 等. 尖銳濕疣和尋常疣患者外周血T細(xì)胞亞群及細(xì)胞因子水平的檢測J. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2001, 17（4）: 397.4 Castle PE, Phillips TM, Hildesheim A, et al. Immune profiling of plasma and cervical secretions using recycling immunoaffinity chromatographyJ. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2003, 12(12