NKG2D配體的表達(dá)直接影響NK細(xì)胞對不同發(fā)育階段DC的殺傷

1、NKG2D配體的表達(dá)直接影響NK細(xì)胞對不同發(fā)育階段DC的殺傷 作者：涂三芳, 郭坤元, 胡亮衫, 梅家轉(zhuǎn), 周健, 孫明【摘要】 目的: 探討NKG2D配體在不同發(fā)育階段樹突狀細(xì)胞（DC）表面的表達(dá)及其對自然殺傷（NK）細(xì)胞殺傷活性的影響。方法: 用細(xì)胞因子（rh IL-4、 rhGM-CSF、 TNF-）體外誘導(dǎo)培養(yǎng)單核細(xì)胞來源的未成熟樹突狀細(xì)胞（iDC）和成熟樹突狀細(xì)胞（mDC）并鑒定形態(tài)和表型, 免疫磁珠法分離純化NK細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測iDC和mDC表面NKG2D配體MICA/B、 ULBP1-3的表達(dá)。用LDH釋放法檢測NK細(xì)胞對iDC和mDC的殺傷活性以及抗NKG2D單克

2、隆抗體(mAb)阻斷NK細(xì)胞后的殺傷活性。結(jié)果: 培養(yǎng)的iDC和mDC具有典型的細(xì)胞形態(tài)和免疫表型特征。iDC表面表達(dá)MICA、 MICB、 ULBP1、 ULBP3, 表達(dá)率分別為(32.39±8.30）%、 (17.75±3.40)%、 (26.71±6.48)%、 (38.37±6.89)%; mDC表面表達(dá)MICA 、 ULBP3, 表達(dá)率分別為(7.82±2.67)%、 (8.36±2.42)%, 比iDC表面相應(yīng)配體表達(dá)率低（P<0.01）。各效靶比NK細(xì)胞對iDC的殺傷活性均比對mDC的殺傷活性高, 差異有

3、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)?？筃KG2D mAb阻斷NK細(xì)胞后對iDC殺傷活性比阻斷前減弱(P<0.05); 對mDC的殺傷活性與阻斷前相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論: NKG2D配體在iDC表面表達(dá)高, 介導(dǎo)了NK細(xì)胞對iDC的殺傷, 而對mDC的殺傷無影響, 是NK細(xì)胞對iDC選擇性高殺傷的分子機(jī)制之一。 【關(guān)鍵詞】 NKG2D配體 自然殺傷細(xì)胞 樹突狀細(xì)胞Abstract AIM: To investigate the expression of NKG2D ligands on dendritic cells（DC） at differ

4、ent development stages and its effect on cytotoxicity of natural killer（NK） cells. METHODS: The monocytes were cultured into immature dendritic cells（iDC） and mature dendritic cells（mDC） with cytokines. NK cells were obtained from normal peripheral blood by CD56 antibody magnetic isolation.The expre

5、ssion of NKG2D ligands (MICA/B, ULBP1-3) was detected by flow cytometry. Cytotoxicity of NK cells and the NK cells blocked with anti-NKG2D mAbs against iDC and mDC was tested using LDH-releasing method. RESULTS: IDC and mDC were of typical morphology and phenotypes. MICA, MICB, ULBP1, and ULBP3 were

6、 expressed on iDC and their expression rate was (32.39±8.30)%, (17.75±3.40)%, (26.71±6.48)%, (38.37±6.89)%, respectively. MICA and ULBP3 were expressed on mDC and their expression rate was (7.81±3.33)% and (8.36±2.42)%, respectively, which was lower than that on mDC (P&

7、amp;lt;0.01). At the each ET ratio cytotoxicity of NK cells against iDC was stronger than that against mDC (P<0.01). cytotoxicity of NK cells blocked with anti-NKG2D mAb against iDC was decreased compared with that of NK cells unblocked (P<0.05) while cytotoxicity of NK cells blocked w

8、ith anti-NKG2D mAb against mDC showed no decrease compared with that of NK cells unblocked (P>0.05). CONCLUSION: The expression of NKG2D ligands on iDC is higher than that on mDC, which plays an important role in the cytotoxic effect of NK cells against iDC, but has no effect on that aginst m

9、DC. NKG2D-NKG2D ligands shows one of the moleculer mechanisms that NK cells kill iDC selectivly.KeywordsNKG2D ligand; natural killer cell; dendritic cell樹突狀細(xì)胞（DC）和自然殺傷（NK）細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)最重要的組成部分, 二者之間存在相互作用1。Ruggeri等2, 3研究發(fā)現(xiàn)在異基因造血干細(xì)胞移植中供者NK細(xì)胞可以通過殺傷宿主DC來降低移植物抗宿主?。℅VHD）的發(fā)生。但NK細(xì)胞殺傷DC的作用機(jī)制仍未完全明確。NK細(xì)胞主要通過表面受配體

10、結(jié)合起殺傷作用, 本研究旨在通過檢測NKG2D配體在不同發(fā)育階段DC表面的表達(dá)水平來探索NKG2D受配體識別途徑是否參與介導(dǎo)了NK細(xì)胞對不同發(fā)育階段DC的殺傷, 為臨床運(yùn)用NK細(xì)胞降低GVHD的發(fā)生提供理論依據(jù)。1 材料和方法1.1 材料 RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自Gibco公司。重組人白細(xì)胞介素-4 ( rh IL-4)、 重組人粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子( rhGM-CSF)和腫瘤壞死因子（TNF-）均為Pep rotech公司產(chǎn)品?？笴D56免疫磁珠抗體、 MACS磁柱和MACS細(xì)胞分選儀均為Miltenyi公司產(chǎn)品。殺傷活性檢測試劑盒（Cytotox96 non-radio

11、active cytotoxocity assay）為Promega公司產(chǎn)品。CD3FITC、 CD16PECD56PE mAb為BD公司產(chǎn)品。FITC或PE標(biāo)記的鼠抗人CD80、 CD86、 HLA2DR、 CD83、 CD1a單克隆抗體(mAb)及其同型對照均為eBiosience公司產(chǎn)品。鼠抗人NKG2D、 MICA、 MICB、 ULBP1、 ULBP2、 ULBP3 mAb和FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG1購自RnD公司。FACScabilur型流式細(xì)胞儀為Beckman-Coulter公司產(chǎn)品。1.2 方法1.2.1 人外周血單核細(xì)胞來源的iDC與mDC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)與鑒定 常規(guī)分離健康

12、志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞, 以4×109/L細(xì)胞密度接種在6孔板中, 置于37、 50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)4 h后, 去除非貼壁細(xì)胞, 加入含20 g/L rhIL-4、 50 g /L rhGM-CSF、 100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液, 置于培養(yǎng)箱培養(yǎng), 隔天半量換液, 補(bǔ)充等量細(xì)胞因子。第6天補(bǔ)加80 g /L的TNF-, 共培養(yǎng)9 d。每天倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。收集第6天和第9天細(xì)胞用25 mL/L戊二醛固定, 漂洗, 脫水, 乙酸異物脂置換, 干燥, 噴金后上機(jī)用掃描電子顯微鏡觀察鑒定其形態(tài)。同樣收集第6天和第9天細(xì)胞計(jì)數(shù)后分管, 分別加C

13、D80PE、 CD86 PE-CY5、 HLA-DRPE、 CD1aFE、 CD83FITC mAb 4度標(biāo)記, 對照管加同型對照IgG1, 用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測各分子的表達(dá), 不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次。1.2.2 人外周血來源的NK細(xì)胞分離 分離另外3位健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞, 每107個(gè)細(xì)胞加入80 L PBS和20 L抗CD56免疫磁珠抗體, 4標(biāo)記15 min后洗滌, 用500 L的PBS充分混勻后加入到磁柱中, 在MACS細(xì)胞分選儀中分離, 推注器將分選的陽性細(xì)胞推入無菌試管, 為NK細(xì)胞。CD3FITC、 CD16PECD56PE mAb標(biāo)記NK細(xì)胞檢測NK細(xì)胞的純度。1.2.

14、3 iDC、 mDC表面NKG2D配體的FCM檢測 分別收集鑒定后的iDC與mDC洗滌計(jì)數(shù), 分6管, 每管109/100 mL細(xì)胞懸液, 按1 g/106個(gè)細(xì)胞密度分別加入MICA、 MICB、 ULBP1、 ULBP2、 ULBP3 mAb, 4度標(biāo)記30 min后洗滌, 加入FITC標(biāo)記的山羊抗鼠IgG1二抗4度標(biāo)記30 min, 第6管加等量同型IgG1作為陰性對照, 洗滌后以FCM檢測MICA、 MICB、 ULBP1、 ULBP2、 ULBP3的表達(dá)量。為避免實(shí)驗(yàn)誤差, 不同時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次。1.2.4 NK細(xì)胞對iDC與mDC殺傷活性的檢測 采用LDH釋放法4, 收集iDC, mD

15、C作為靶細(xì)胞, NK細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞, 按照Cytotox96 non-radioactive cytotoxocity assay殺傷試劑盒說明書操作, 倍比稀釋法按效靶比201、 101、 51鋪板, 阻斷組先加抗NKG2D mAb 10 g/100 L常溫下孵育15 min, 封閉NK細(xì)胞表面NKG2D受體, 再加靶細(xì)胞。顯色后ELX-800酶標(biāo)儀上測A值。NK細(xì)胞殺傷率=(實(shí)驗(yàn)孔A值靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔A值效應(yīng)細(xì)胞自發(fā)釋放孔A值)/(靶細(xì)胞最大釋放孔A值靶細(xì)胞自發(fā)釋放孔A值)×100%1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理, 數(shù)據(jù)以x±s表示,

16、采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn), P<0.05者表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 iDC和mDC的形態(tài)和表型 倒置顯微鏡下觀察第6天細(xì)胞大部分半懸浮聚集成簇生長, 胞體增大, 表面可見短小毛刺狀突起。第9天細(xì)胞大部分懸浮生長, 表面樹突結(jié)構(gòu)明顯。掃面電鏡下觀察第6天細(xì)胞大小10 m左右, 表面突起短小, 多見薄沙或云霧狀皺褶, 符合iDC的形態(tài)特征（圖1A）; 第9天細(xì)胞表面突起更多更長, 呈典型樹突狀結(jié)構(gòu), 云霧狀皺褶稀疏, 符合mDC的形態(tài)特征（圖1B）。FCM結(jié)果顯示第6天DC表面共刺激分子CD80和CD86分別為（40.8±7.9）%和（45.1±3.7）%,

17、 HLA-DR表達(dá)為（59.9±5.2）%, 特異性分子標(biāo)志物CD1a高表達(dá)為（71.9±5.2）%, 成熟分子標(biāo)志物CD83低表達(dá)為（14.9±1.9）%, 為不成熟階段表型。第9天測得CD80、 CD86和HLA-DR表達(dá)升高為（71.5±7.3）%、 （79.9±6.7）%和（88.6±6.6）%, CD1a仍高表達(dá), CD83表達(dá)升高為(65.5±3.8)%, 為成熟階段表型。圖1 掃描電鏡下觀察DC形態(tài)（略）Fig 1 The morphologies of DC observed by scanning elec

18、tron microscopeA: Day 6; B: Day 9.2.2 NK細(xì)胞的純度 FCM結(jié)果顯示外周血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)免疫磁珠分選后NK細(xì)胞（CD3-CD16+CD56+）的純度為（91.66±4.04）%, 能滿足實(shí)驗(yàn)要求（圖2）。圖2 免疫磁珠法分選后NK細(xì)胞的純度（略）Fig 2 Purification of NK cells after immunomagnetic isolation2.3 iDC和mDC表面NKG2D配體的表達(dá) iDC表面表達(dá)MICA、 MICB、 ULBP1和ULBP34個(gè)配體; mDC表面只表達(dá)MICA、 ULBP22個(gè)配體, 且比iDC表面相

19、應(yīng)配體表達(dá)率低, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。其他配體表達(dá)率均低于5%, 視為陰性結(jié)果(表1, 圖3)。表1 NKG2D配體在iDC和mDC表面的表達(dá)率（略）Tab 1 Expression of NKG2D ligands on the surface of iDC and mDCbP<0.01 vs iDC.圖3 iDC和mDC膜表面NKG2D配體的表達(dá)（略）Fig 3 Expression of NKG2D ligands on the surface of iDC and mDC2.3 NK細(xì)胞對iDC與mDC的殺傷活性 各效靶比NK細(xì)胞對iDC的殺

20、傷活性分別高于對mDC的殺傷活性, 差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。NKG2D mAb阻斷NK細(xì)胞后, 各效靶比NK細(xì)胞對iDC的殺傷活性降低（P<0.05）; 對mDC的殺傷活性與阻斷前相比均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）; 阻斷后的NK細(xì)胞對iDC的殺傷活性比阻斷前NK細(xì)胞對mDC的殺傷活性高, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05, 圖4）。圖4抗NKG2D mAb阻斷前后NK細(xì)胞對iDC和mDC的殺傷活性（略）Fig 4 Cytotoxicity of NK cells and the NK cells blocked with an

21、ti-NKG2D mAb against iDC and mDC3 討論 NK細(xì)胞和DC是機(jī)體天然免疫和獲得性免疫系統(tǒng)中重要的組成部分, 近年來研究1, 5表明二者在天然免疫早期階段存在相互作用, DC能增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷活性, 同時(shí)NK細(xì)胞能選擇性殺傷iDC, 到目前為止其殺傷機(jī)制仍在探索中。DC根據(jù)發(fā)育階段的不同可分為iDC和mDC, 其在形態(tài), 表型和功能上有所不同6。NK細(xì)胞的殺傷活性同時(shí)受活化性和抑制性受配體結(jié)合產(chǎn)生的信號平衡調(diào)節(jié)起作用7, 其活化性受體主要包括II型跨膜蛋白受體NKG2D和NK細(xì)胞自然細(xì)胞毒受體NCR, 與配體結(jié)合向NK細(xì)胞傳遞活化性信號。NKG2D配體8主要包括多

22、態(tài)性的MHC-I類鏈相關(guān)的肽A、 B（MICA/B）和人巨細(xì)胞病毒UL16結(jié)合蛋白(ULBPs), 它們在不同發(fā)育階段DC的表達(dá)情況尚未見研究報(bào)道。我們通過FCM分別檢測iDC和mDC表面NKG2D配體的表達(dá), 結(jié)果顯示iDC表面表達(dá)MICA、 MICB、 ULBP1和ULBP3, 而mDC表面只表達(dá)MICA和ULBP3, 且表達(dá)率很低。因此iDC可以通過表面NKG2D配體與NKG2D結(jié)合激活NK細(xì)胞的殺傷活性, mDC通過NKG2D配體很難激活NK細(xì)胞。本研究殺傷試驗(yàn)顯示NK細(xì)胞對iDC的殺傷活性比對mDC的殺傷活性高很多, 與其他研究結(jié)果一致9。NKG2D mAb阻斷NK細(xì)胞后降低了NK細(xì)

23、胞對iDC的殺傷活性, 但對mDC的殺傷沒有影響。因此可認(rèn)為NKG2D受配體識別信號途徑介導(dǎo)了NK細(xì)胞對iDC的殺傷, 沒有介導(dǎo)對mDC的殺傷, 是NK細(xì)胞選擇性高殺傷iDC的機(jī)制之一。 NK細(xì)胞的殺傷作用除了受活化性信號作用之外, 同時(shí)受抑制性信號的共同調(diào)節(jié)作用。NK細(xì)胞抑制性信號受體主要包括殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體KIR和CD94/NKG2A等, 分別與靶細(xì)胞表面的HLA-類分子和不典型的I類分子結(jié)合, 向NK細(xì)胞傳遞抑制性信號10。本研究結(jié)果顯示抗NKG2D mAb阻斷后對iDC的殺傷活性仍比未阻斷前NK對mDC的殺傷活性高, 說明抗NKG2D mAb不能完全阻斷NK細(xì)胞對iDC的殺傷,

24、 同時(shí)其他受配體識別途徑介導(dǎo)。除了其他活化性信號途徑外, 更主要的就是抑制性信號在二者強(qiáng)弱不等。Ferlazzo等11發(fā)現(xiàn)mDC高表達(dá)抑制性配體MHC-I類分子, 而iDC低表達(dá), 這可能也是iDC被NK細(xì)胞選擇性殺傷的原因之一。 在異基因造血干細(xì)胞移植中利用NK細(xì)胞對iDC 的殺傷清除能力, 輸入KIR/HLA錯(cuò)配的NK細(xì)胞可能做為一種安全有效的過繼細(xì)胞免疫治療方法用于白血病的治療, 降低GVHD的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)NKG2D配體在iDC表面表達(dá), 并首次證實(shí)它直接影響NK細(xì)胞對iDC的選擇性殺傷, 為臨床造血干細(xì)胞移植合理選擇供者提供了一定的理論依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 Moretta L,

25、Ferlazzo G, Bottino C, et al. Effector and regulatory events during natural killer-dendritic cell interactionsJ. Immunological Reviews, 2006, 214（10）: 219-228.2 Ruggeri L, Mancusi A, Burchielli E, et al. Natural killer cell alloreactivity and haplo-identical hematopoietic transplantationJ. Cytothera

26、py, 2006, 8(6): 554-558.3 Ruggeri L, Capanni M, Urbani E, et al. Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismatched hematopoietic transplantsJ. Sience, 2002, 295(5562): 2097-2100.4 梅家轉(zhuǎn), 周 健, 郭坤元, 等. 低表達(dá)MICA/MICB導(dǎo)致NK細(xì)胞對人鼻咽癌多藥耐藥細(xì)胞（CNE2/DDP）殺傷活性下降J. 中國腫瘤生物治療雜志, 2006, 13（5）: 349-352

27、.5 Capobianco A, Rovere-Querini P, Rugarli C, et al. Multidirectional interactions are bridging human NK cells with plasmacytoid and monocyte-derived dendritic cells during innate immune responsesJ. Intrenatinal J Cancer, 2006, 119(12): 2861-2869.6 Karolina A, Nicolas T, Sanchez-Chapuis F, et al. Dendritic cells a