PPARγ在肝外膽管癌中的表達(dá)及其意義

1、PPAR在肝外膽管癌中的表達(dá)及其意義 作者：劉兵 王文斌 王安峰 呂海濤 劉明【摘要】 目的 觀察PPAR mRNA和蛋白在肝外膽管癌組織中的表達(dá)，并探討其與肝外膽管癌臨床病理特征之間的關(guān)系。方法 采用RTPCR和Western印跡檢測PPAR mRNA和蛋白在30例肝外膽管癌組織中的表達(dá)情況。結(jié)果 RTPCR法檢測結(jié)果顯示肝外膽管癌組織中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PPAR mRNA表達(dá)分別為0.47±0.06和0.24±0.07，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);低分化組和高中分化組PPAR mRNA表達(dá)分別為0.3±0.19和0.17

2、7;0.01，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);、期和期肝外膽管癌組織PPAR mRNA表達(dá)分別為0.63±0.35和0.63±0.28，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Western印跡結(jié)果顯示肝外膽管癌組織中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組PPAR 蛋白表達(dá)水平分別為2.0±0.44和0.93±0.21，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);低分化組和高中分化組中，PPAR蛋白表達(dá)分別為0.87±0.23和0.96±0.15，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。、期和期，PPAR蛋

3、白表達(dá)分別為2.45±0.54和1.95±0.24，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 PPAR 可能對肝外膽管癌的發(fā)生和發(fā)展起促進(jìn)作用。 【關(guān)鍵詞】 PPAR; 肝外膽管癌;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);免疫印跡過氧化物酶體增殖物激活受體(PPARs)是一類由配體激活的核轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝與糖代謝、脂肪細(xì)胞分化和能量平衡、炎癥反應(yīng)、動脈粥樣硬化及腫瘤細(xì)胞的分化與凋亡等生理和病理過程，其中PPAR與腫瘤的關(guān)系已日益引起人們關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，PPAR位于機體多種信號傳導(dǎo)的交叉點，相關(guān)文獻(xiàn)已經(jīng)證明PPAR 配體( pioglitazone，PGZ) 對肝門膽

4、管癌細(xì)胞系 QBC939 細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用，從而成為新的腫瘤治療靶點1。然而，PPAR在膽管癌組織中的表達(dá)尚無報道。本文利用RTPCR及Western印跡技術(shù)檢測PPAR mRNA和蛋白在肝外膽管癌中的表達(dá)情況，并探討其表達(dá)與肝外膽管癌臨床病理特征的關(guān)系。1 材料與方法1.1 材料 手術(shù)切除并經(jīng)病理證實的肝外膽管癌組織30例(腺癌26例，其中高中分化15例，低分化11例;黏液腺癌4例)，男18例，女12例，年齡3774(平均57.2)歲。術(shù)前均未作放療、化療、免疫治療等抗腫瘤治療。期 11例，、期19例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例。所有患者均取新鮮癌組織標(biāo)本，取材后迅速

5、投入液氮中冷凍保存。引物由上海生物工程有限公司合成。1.2 RTPCR檢測PPAR mRNA表達(dá) 采用異硫氰酸胍一步法提取肝外膽管癌總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PCR反應(yīng)：PPAR 引物序列為正義：5GCA GTG GGG ATG TCT CAT AAT GC3，反義:5CAG GGG GGT GAT GTG TTT GAA C3，產(chǎn)物長度為328 bp。GAPDH引物序列為：正義：5GGAAGGTGAAGGTCGGAGT3，反義：5CCTGGAAGATGGTGATGGG3，產(chǎn)物長度為231 bp。反應(yīng)條件：94變性5 min，94 50 s，54 30 s，72 30 s，35次循環(huán)后72

6、延伸10 min。PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，90 V，40 min，紫外分析儀中觀察并照相，凝膠分析軟件定量。采用凝膠分析軟件(BIO1D)分析各條帶平均灰度值，以PPAR與內(nèi)參照基因GAPDH的灰度比值表示PPAR mRNA相對表達(dá)量。1.3 Western印跡檢測PPAR蛋白的表達(dá) 冰PBS洗滌后的組織加入蛋白裂解液，勻漿收集上清。蛋白定量后，經(jīng)10% SDSPAGE后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉4 h，加入1400一抗小鼠抗人PPAR (E8)單克隆抗體，Santa Cruz公司4過夜，二抗室溫孵育1 h 后，ECL發(fā)光。以PPAR與actin條帶的比值表示PPAR蛋

7、白的表達(dá)量。1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析;采用單因素方差分析(ANOVA)，數(shù)據(jù)采用x±s表示。2 結(jié) 果2.1 PPAR mRNA表達(dá)與肝外膽管癌臨床病理特征的關(guān)系 RTPCR檢測結(jié)果顯示：肝外膽管癌組織中，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組PPAR mRNA表達(dá)水平分別為0.47±0.06和0.24±0.07，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01) (圖1)。低分化組和高中分化組中PPAR mRNA表達(dá)分別為0.3±0.19和0.17±0.01，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖2)。、期和期癌組織

8、PPAR mRNA表達(dá)分別為0.63±0.35和0.63±0.28，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。2.2 PPAR蛋白表達(dá)與肝外膽管癌臨床病理特征的關(guān)系 Western印跡結(jié)果顯示肝外膽管癌組織淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組和無轉(zhuǎn)移組中PPAR 蛋白表達(dá)水平分別為2.0±0.44和0.93±0.21，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01) (圖4)。低分化組和高中分化組中PPAR蛋白表達(dá)分別為0.87±0.23和0.96±0.15，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖5)。、期和期癌組織PPAR蛋白表達(dá)

9、分別為2.45±0.54和1.95±0.24，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) (圖6)。3 討 論肝外膽管癌屬于少見的惡性腫瘤,據(jù)統(tǒng)計在所有惡性腫瘤中所占比例不足2%，但其發(fā)病率有逐漸增多趨勢。雖然手術(shù)切除為其主要的治療手段，但是國內(nèi)近10年的手術(shù)切除率僅18%，一般為10%20%，大多數(shù)經(jīng)手術(shù)切除治療的患者仍死于腫瘤的局部復(fù)發(fā)2。在膽管癌的治療中，放療及化療的作用還不肯定。隨著分子生物學(xué)和分子病理學(xué)的發(fā)展，已認(rèn)識到細(xì)胞癌變是基因的異常激活或失活所致，腫瘤的基因治療成為研究熱點。PPAR作為核激素受體超家族中的成員之一，可通過抑制增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及分化

10、、抑制腫瘤血管形成和降低腫瘤侵襲能力等不同機制發(fā)揮抗腫瘤作用。由于人類癌癥的多樣性和復(fù)雜性，在不同的腫瘤中，PPAR經(jīng)其配體激活后通過多種途徑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，研究證實在肝細(xì)胞癌、胃癌、結(jié)腸癌以及胰腺癌等腫瘤中，誘導(dǎo)細(xì)胞停滯在G0/G1期36。而在膽管細(xì)胞癌細(xì)胞系SG231、CCLP1和HuCCT1的研究中，國外學(xué)者Han等7發(fā)現(xiàn)15 dPGJ2(PPAR的配體)和TGZ在3個細(xì)胞系中誘導(dǎo)生長抑制、G2/M阻滯;研究顯示吡格列酮作為PPAR的高親和力配體可能通過激活PPAR導(dǎo)致細(xì)胞周期進(jìn)程出現(xiàn)G2/M期阻滯以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其對膽管癌細(xì)胞的生長抑制作用。國內(nèi)學(xué)者同樣證明了此觀點8。P

11、PAR在結(jié)腸癌、卵巢癌、胃癌等多種腫瘤組織中高表達(dá)911。PPAR在肝外膽管癌中表達(dá)的情況及與臨床病理的關(guān)系尚未見報道。本研究表明，肝外膽管癌組織中存在PPAR mRNA和蛋白的表達(dá)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組其表達(dá)明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示PPAR與肝外膽管癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。PPAR的表達(dá)可能促進(jìn)了肝外膽管癌組織的淋巴轉(zhuǎn)移過程，但具體機制尚不清楚。而PPAR mRNA和蛋白的表達(dá)與肝外膽管癌組織分化及臨床分期無明顯相關(guān)，與文獻(xiàn)中其他腫瘤的表達(dá)不盡相同，提示PPAR所起的作用在不同的腫瘤類型中可能是不同的，亦或是與檢查方法不同有關(guān)。 PPAR對肝外膽管癌細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移過程及其他惡性生物學(xué)行為的影響需進(jìn)一步

12、深入探討，以便為膽管癌的基因治療及放化療提供新的依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 程 文,程南生,熊先澤,等.過氧化物酶增殖物激活受體 在肝門部膽管癌中的表達(dá)及其配體對膽管癌細(xì)胞生長的抑制作用J.中華實驗外科雜志,2005;22(11):1406.2 黃志強.當(dāng)代膽道外科學(xué)M.上海:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社,1998:61536.3 Yoshizawa K，Cioca DP，Kawa S,et al.Peroxisome proliferatoractivated receptor gamma ligand troglitazone induces cell cycle arrest and apoptosi

13、s of hepatocellular carcinoma cell linesJ.Cancer，2002;95(10):224351.4 Yoshida K，Tauabe K，F(xiàn)ujii D,et al.Induction mechanism of apoptosis by troglitazone through peroxisome prolife ratoractivated receptorgamma in gastric carcinoma cellsJ.Anticancer Res，2003;23(1A):26773.5 Kitamura S，Miyazaki Y，Shinomu

14、ra Y,et al.Peroxisome proliferator activated receptor gamma induces growth arrest and differentiation markers of human colon cancer cellsJ.Jpn J Res,1999;90(1):7580.6 Itam IA,Watanabe G，Shimada Y,et al.Ligands for peroxisome proliferator activated receptor gamma inhibit growth of pancreatic cancers

15、both in vitro and in vivoJ.Int J Cancer，2001;94(3):3706.7 Han C，Demetris AJ，Michalopoulos GK,et al.PPAR ligands inhibit cholangiocarcinoma cell growth through p53dependent GADD45 and p21WAF1/Cip1pathwayJ.Hepatology,2003;38(1):16777.8 程 文,程南生,熊先澤,等.PPAR 在肝門部膽管癌中的表達(dá)及其配體激活后對膽管癌細(xì)胞的作用J.四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2006;37(5):7459.9 DuBois RN,Gupta R，Brockman J,et al.The nuclear ercosanoid receptor，PPARs，is aberrantly expressed in cilonic cancersJ.Carcinogenesis，1998;19(1):4953.10 Zhang GY，Ahmed N，Riley C,et al.Enhanced expression of peroxisome proliferators activated receptor gamma in epithe