SRF和Myocardin在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的相互作用

1、SRF和Myocardin在血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化中的相互作用【摘要】 目的探討SRF和Myocardin在血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)表型轉(zhuǎn)化中相互作用的機(jī)制。方法采用免疫共沉淀和凝膠遷滯分析(EMSA)的方法檢測(cè)不同表型的VSMC中SRF和Myocardin的相互作用以及SRF與其順式元件相互結(jié)合的能力。結(jié)果與傳代培養(yǎng)處于去分化狀態(tài)的VSMC相比，原代培養(yǎng)處于分化狀態(tài)的 VSMC中SRF和Myocardin的相互作用明顯增強(qiáng)，而且SRF與其順式元件結(jié)合的能力顯著提高。結(jié)論SRF通過(guò)與Myocardin相互作用形成多蛋白復(fù)合體，即可有效地提高SRF與DNA調(diào)控元件即CArG-box的結(jié)合能力，

2、啟動(dòng)肌特異性基因的表達(dá)，從而調(diào)控VSMC的表型轉(zhuǎn)化。 【關(guān)鍵詞】 Myocardin; 血清應(yīng)答因子;血管平滑肌細(xì)胞 ;表型轉(zhuǎn)化血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖及向內(nèi)膜下遷移是動(dòng)脈粥樣硬化、血管成形術(shù)后再狹窄等心血管疾病的共同病理特征，而VSMC表型轉(zhuǎn)化是上述機(jī)制發(fā)生的基礎(chǔ)。因此，研究VSMC表型調(diào)節(jié)的分子機(jī)制，對(duì)上述相關(guān)疾病的防治具有重要意義。血清應(yīng)答因子(SRF)與其順式元件(CArG-box)之間的相互作用對(duì)于平滑肌標(biāo)志基因的轉(zhuǎn)錄是非常重要的。但SRF這樣普遍表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子能夠選擇性地激活平滑肌細(xì)胞特異性的基因轉(zhuǎn)錄，其機(jī)制尚不清楚。研究顯示SRF對(duì)平滑肌特異性基因表達(dá)的調(diào)節(jié)活性可受多個(gè)環(huán)節(jié)

3、的調(diào)節(jié)，涉及SRF的表達(dá)、核轉(zhuǎn)位、選擇性拼接以及SRF自身的翻譯后修飾等1，2。Myocardin與SRF相互作用而協(xié)同激活SRF依賴的基因轉(zhuǎn)錄最令人關(guān)注。但Myocardin在VSMC表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用尚未見報(bào)道。故本研究觀察在VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的過(guò)程中Myocardin和SRF相互作用的分子機(jī)制。1材料與方法1.1材料兔抗人Myocardin多克隆抗體(本室制備)，兔抗鼠SRF多克隆抗體(Santa Cruz 公司)，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-1標(biāo)記的羊抗兔二抗(北京中山公司)，隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒、凝膠遷滯試驗(yàn)(EMSA)試劑盒(Promega公司)，其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。1.

4、2細(xì)胞培養(yǎng)取5周齡SD大鼠胸腹主動(dòng)脈，用貼塊法分離VSMC，加入含10%FBS的M199進(jìn)行培養(yǎng)，用0.25% 胰蛋白酶消化傳代，取37代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.3原代VSMC培養(yǎng)按文獻(xiàn)3方法。取5周齡SD大鼠胸腹主動(dòng)脈，剪碎后，用0.01%型膠原酶和0.1% 胰酶聯(lián)合消化，8 000 r/min離心收集細(xì)胞，差速貼壁法純化VSMC。1.4免疫共沉淀按文獻(xiàn)4方法用三去污裂解液分別裂解原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)的VSMC，收集細(xì)胞裂解液，離心取上清加入明膠緩沖液后，加入兔抗鼠SRF多克隆抗體(或兔抗人Myocardin多克隆抗體)，4搖動(dòng)2 h。隨后，加入蛋白A-Sepharose，4搖動(dòng)過(guò)夜。離心收集蛋白A

5、-抗原-抗體三元復(fù)合物。依次用NET-洗滌緩沖液、和洗滌沉淀，離心后用2SDS上樣緩沖液懸浮沉淀，100加熱3 min后離心，取上清進(jìn)行Western印跡檢測(cè)SRF與Myocardin的相互作用。用法國(guó)Vilber Lourmat公司的Bio ID數(shù)碼成像分析軟件對(duì)Western 印跡結(jié)果進(jìn)行定量分析。1.5SRF結(jié)合元件CArG-box硫代反義寡核苷酸探針(ODNs)設(shè)計(jì)與合成按SM22基因啟動(dòng)子近端CArG-box的堿基序列合成正鏈及互補(bǔ)鏈ODNs(上海生工生物工程公司)，正鏈序列：5-CTTTCCCCAAATATGGAGCCTG-3。將合成的正鏈及其互補(bǔ)鏈ODNs溶解于3檸檬酸鈉(SSC

6、)溶液中，加熱至80后，緩慢降溫至55，使其退火生成雙鏈ODNs。1.6凝膠阻滯分析(EMSA)按文獻(xiàn)3方法從原代和傳代培養(yǎng)的VSMC中提取核蛋白。各取10 g與末端標(biāo)記的SM22基因啟動(dòng)子近端CArG-box進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，以100倍過(guò)量的非標(biāo)記探針作為特異性競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合對(duì)照。DNA-核蛋白復(fù)合物經(jīng)4%PAGE分離后，-70放射自顯影顯現(xiàn)電泳區(qū)帶的遷移變化。2結(jié)果2.1原代和傳代培養(yǎng)的VSMC中SRF和Myocardin的相互作用無(wú)論是用抗Myocardin抗體免疫沉淀原代和傳代培養(yǎng)的VSMC提取物，再用抗SRF抗體做免疫印跡分析;還是用抗SRF抗體免疫沉淀原代和傳代培養(yǎng)的VSMC提取物，再用抗M

7、yocardin抗體做免疫印跡分析，結(jié)果均表明，在傳代培養(yǎng)的處于去分化狀態(tài)的VSMC中，很難檢測(cè)到SRF和Myocardin復(fù)合物的形成。而在原代培養(yǎng)的處于分化狀態(tài)的 VSMC中SRF和Myocardin的相互作用明顯增強(qiáng)。結(jié)果提示，SRF與Myocardin這個(gè)特異性轉(zhuǎn)錄因子的相互作用在VSMC表型轉(zhuǎn)化中起著核心作用。見圖1，圖2。2.2原代和傳代培養(yǎng)的VSMC中SRF與DNA結(jié)合能力的改變EMSA結(jié)果表明，從原代和傳代培養(yǎng)的VSMC細(xì)胞中提取的核蛋白都可與SM22啟動(dòng)子近端CArG-box相結(jié)合，在4% PAGE上出現(xiàn)遷移率變慢的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物區(qū)帶。其中表現(xiàn)出收縮表型特征的原代培養(yǎng)的

8、VSMC中DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物區(qū)帶較表現(xiàn)出合成型特征的傳代培養(yǎng)的細(xì)胞明顯加深，說(shuō)明核蛋白與DNA的結(jié)合能力顯著增強(qiáng)。SRF-DNA復(fù)合物形成的特異性由過(guò)量未標(biāo)記的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合而證實(shí)。原代培養(yǎng)的VSMC(收縮型)中 SRF結(jié)合CArG-box的能力明顯增強(qiáng)，推測(cè)是由于SRF和Myocardin相互作用形成多蛋白復(fù)合體，有利于激活分化型標(biāo)志基因的表達(dá)，從而調(diào)控了VSMC的表型轉(zhuǎn)化。見圖3。圖1抗Myocardin抗體免疫沉淀VSMC圖2抗SRF抗體免疫沉淀VSMC圖3SRF與DNA結(jié)合能力3討論研究表明Myocardin可在多種非肌細(xì)胞中，以SRF依賴的方式啟動(dòng)平滑肌特異性基因的表達(dá)5，提示在組織特

9、異性的平滑肌中Myocardin可能是SRF的重要輔助因子6。但在VSMC 表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中Myocardin和SRF的作用尚未見報(bào)道。本研究結(jié)果提示，在VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的過(guò)程中SRF起一個(gè)平臺(tái)作用，可以募集其他的轉(zhuǎn)錄因子(例如myocardin)，SRF通過(guò)與一個(gè)或數(shù)個(gè)平滑肌特異性轉(zhuǎn)錄因子相互作用形成蛋白復(fù)合體，即可有效地提高SRF與DNA調(diào)控元件即CArG-box的結(jié)合能力，啟動(dòng)肌特異性基因的表達(dá)，從而調(diào)控了VSMC的表型轉(zhuǎn)化。血清和純化的生長(zhǎng)因子通過(guò)兩個(gè)獨(dú)立的途徑可刺激SRF的活化。其中，一條途徑是通過(guò)有絲分裂原激活蛋白(MAP)激酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)使得ETS-結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子家族中的三元復(fù)合物

10、因子(ternary complex factor，TCF)發(fā)生磷酸化作用7;另一條是依賴Rho信號(hào)和actin動(dòng)力學(xué)的途徑8。但到目前為止，TCF非依賴性的途徑如何直接調(diào)節(jié)SRF活性的具體機(jī)制尚不清楚。Myocardin可能在此機(jī)制中起一重要作用。有研究表明在RhoA信號(hào)刺激下actin發(fā)生聚合作用,因此原本被G-actin抑制的Myocardin相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MRTFs)被釋放出來(lái)，從胞漿移位至胞核，由此激活了SRF的活性9。因而推測(cè)Myocardin作為一個(gè)橋梁聯(lián)系了Rho-actin信號(hào)和SRF依賴性的轉(zhuǎn)錄。在VSMC表型轉(zhuǎn)化中其具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1Owens

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