不同濃度游離脂肪酸對(duì)大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)的影響

1、不同濃度游離脂肪酸對(duì)大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)的影響 作者：魏明 盧永申 張俊峰 李盼盼【摘要】 目的 探討不同濃度游離脂肪酸（FFAs）對(duì)大鼠系膜細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)及合成分泌的影響。方法 以體外培養(yǎng)大鼠系膜細(xì)胞為基礎(chǔ)，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）技術(shù)檢測(cè)型膠原（Col）、纖維連接蛋白（FN）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF1）mRNA的表達(dá)；采用酶聯(lián)免疫吸附ELISA）試驗(yàn)法檢測(cè)培養(yǎng)系膜細(xì)胞上清液Col、FN的水平。 結(jié)果 25、100、400 mol/L 軟脂酸（PA）刺激組Col、FN、TGF1 mRNA的表達(dá)分別為（0.99±0.18、1.24±0.16、1.38&#

2、177;0.21）、（0.91±0.13、1.14±0.12、1.28±0.11）和（1.21±0.09、1.43±0.07、1.54±0.06），與0 mol/L對(duì)照組比較（0.61±0.17、0.62±0.08、0.81±0.10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.01）；25、100、400 mol/L PA刺激組Col、FN的分泌分別為（59.97±6.48、67.24±6.86、74.38±7.21）ng/ml和（100.91±7.13、135.04±

3、8.12、154.18±9.11）ng/ml，與0 mol/L對(duì)照組比較（48.84±6.17、88.68±8.08）ng/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.01）。結(jié)論 FFAs具有促進(jìn)系膜細(xì)胞外基質(zhì)基因表達(dá)和分泌的作用，可能在腎小球硬化病理過程中發(fā)揮著重要作用。 【關(guān)鍵詞】 脂肪酸；型膠原；纖維連接蛋白；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子分別采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR）技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試驗(yàn)法對(duì)系膜細(xì)胞外基質(zhì)型膠原(Col)、纖維連接蛋白(FN)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子1（TGF1）mRNA表達(dá)和體外培養(yǎng)合成分泌水平進(jìn)行檢測(cè)，旨在探討不同濃度游離脂肪酸（FFAs）對(duì)系膜細(xì)

4、胞外基質(zhì)Col、FN、TGF1 mRNA表達(dá)的影響以及其在腎小球硬化發(fā)病機(jī)制中的作用。1 材料與方法1.1 材料RPMI1640培養(yǎng)基及新生小牛血清（FCS）為美國(guó)Gibco產(chǎn)品，軟脂酸（PA）及小牛血清蛋白（dBSA）為美國(guó)Sigma產(chǎn)品。1.2 細(xì)胞培養(yǎng)大鼠腎小球系膜（HBZY1）細(xì)胞購(gòu)于鄭州大學(xué)生理教研室，用含10FCS、100 U/ml青霉素及100 g/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液制成單個(gè)細(xì)胞懸液，接種于100 ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)。當(dāng)HBZY1細(xì)胞長(zhǎng)至80融合時(shí)，用0.25胰蛋白酶消化傳代，取第1114代HBZY1細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。37 5CO2 100%濕度條件下培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞處

5、于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，換成0.5 FCS RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使細(xì)胞處于靜止期。1.3 實(shí)驗(yàn)分組吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入PA使終濃度分別為25、100、400 mol/L dBSA，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.4 RTPCR體系按上述方法分組給藥，HBZY1細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)72 h，PBS沖洗3次，加入1 ml Trizol RNA提取液，提取細(xì)胞總RNA。根據(jù)A260/A280值計(jì)算總RNA濃度。Col、FN、TGF1 mRNA的引物序列見表1。引物由上海生物工程公司合成。在25 l 的反應(yīng)體系中含引物各10 pmol/L，2.5l的10×buffer，1 mmol/L dNTP，1l Taq

6、酶，變性94 1 min，退火57 1 min，延伸72 1 min，35個(gè)循環(huán)，72延伸2 min。表1 Col、FN、TGF1 mRNA引物序列（略）1.5 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳取擴(kuò)增產(chǎn)物5 l加載樣緩沖液1 l，在含有0.5 g/ml 溴化乙啶的2瓊脂糖凝膠中電泳，標(biāo)準(zhǔn)物為DL2 000 Marker。通過法國(guó)紫外凝膠成像系統(tǒng)分析電泳帶灰度。1.6 ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)上清液Col、FN含量將5×104/ml HBZY1細(xì)胞接種于24孔微量板中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，換成0.5FCS RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使細(xì)胞處于靜止期。加入軟脂酸1 ml使終濃度分別為

7、25、100、400 mol/L dBSA，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù)以x±s表示。對(duì)于正態(tài)分布的變量應(yīng)用單因素方差分析，偏相關(guān)分析用于在其他變量固定的條件下某兩個(gè)相關(guān)變量相關(guān)分析的檢驗(yàn)；所有統(tǒng)計(jì)學(xué)處理均使用SPSS10.0軟件進(jìn)行。2 結(jié)果2.1 不同濃度PA刺激對(duì)HBZY1細(xì)胞Col、FN、TGF1 mRNA表達(dá)的影響以25、100、400mol/L PA刺激后，Col、FN、TGF1 mRNA表達(dá)量均明顯升高，與0 mol/L對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。Col、FN、TGF1 mRNA表達(dá)量間兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P0.05）。H

8、BZY1細(xì)胞Col、FN、TGF1 mRNA表達(dá)量呈濃度依賴性升高，見圖1和表2。表2 不同濃度 PA對(duì)HBZY1細(xì)胞Col、FN、TGF1 mRNA表達(dá)的影響(略)2.2 不同濃度 PA刺激對(duì)HBZY1細(xì)胞Col、FN分泌水平的影響以25、100、400 mol/L PA刺激后，Col、FN分泌水平均明顯升高，與0 mol/L對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。Col、FN 分泌水平間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。 PA 促進(jìn)HBZY1細(xì)胞合成分泌Col、FN，并具有濃度依賴性。見表3。表3 不同濃度 PA對(duì)HBZY1細(xì)胞Col、FN分泌的影響(略)3 討論 細(xì)胞外基質(zhì)（FN、C

9、ol、TGF1）是細(xì)胞生存的微環(huán)境，廣泛存在各種細(xì)胞表面，是構(gòu)成基底膜的主要成分。在人體的發(fā)育、細(xì)胞分化與遷移、信號(hào)傳導(dǎo)等生理過程和炎癥損傷與修復(fù)、免疫應(yīng)答以及腫瘤轉(zhuǎn)移病理過程中具有重要功能和作用1。長(zhǎng)期以來，細(xì)胞一直是生物界研究疾病的重點(diǎn)。近年來，細(xì)胞外基質(zhì)在疾病的發(fā)生中所起的作用越來越受到重視。FFAs與腎小管間質(zhì)損傷密切相關(guān)，是慢性腎臟疾病的一個(gè)進(jìn)展因素。Kamijo等2報(bào)道FFAs能導(dǎo)致腎小管間質(zhì)損傷。在腎病綜合征不是由于白蛋白而是由于結(jié)合了FFAs的白蛋白引起了腎小管損傷3。Thomas等4通過大鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，白蛋白結(jié)合FFAs組在巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、細(xì)胞凋亡和皮質(zhì)細(xì)胞增殖方面均比白蛋白

10、未結(jié)合組顯著。 本研究結(jié)果顯示，不同濃度 PA刺激HBZY1細(xì)胞后，Col、FN、TGF1 mRNA表達(dá)量均明顯升高，并呈濃度依賴性。提示PA能促進(jìn)系膜細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)。同時(shí)還顯示HBZY1細(xì)胞合成分泌Col、FN水平也顯著增加，并呈濃度依賴性，表明PA能促進(jìn)系膜細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成。提示FFAs可能是腎小球硬化的一個(gè)誘導(dǎo)因素?？傊?，在生理情況下腎小球內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解保持動(dòng)態(tài)平衡，以維持正常的生理功能。當(dāng)某些病理因素（糖尿病、腎病等）致FFAs增多，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)合成增加或降解減少，造成細(xì)胞外基質(zhì)成分積聚，使細(xì)胞外基質(zhì)的大量堆積引起腎小球硬化發(fā)生、發(fā)展?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 潘琳，李光偉，

11、郭艷茹，等.細(xì)胞外基質(zhì)纖維連接蛋白和層黏連蛋白在糖尿病大鼠DR微血管病變表達(dá)的研究J.中華糖尿病雜志，2004；12（1）:568.2 Kamijo A，Sugaya T，Hikawa A,et al.Urinary fatty acid bound to albumin aggravate tubulointerstitial damageJ.Kindney Int，2002；62（12）:162837.3 Kamijo A，Sugaya T，Hikawa A,et al.Urinary fatty acid binging protein as a new clinical marker for the progression of chronic renal diseaseJ. Rinsho Byori，2003；51（2）：