人表皮細胞中側群細胞表型的初步分析

1、人表皮細胞中側群細胞表型的初步分析 作者：程俊美任寧曾慶東施娟紅李勁松【摘要】 目的：檢測人表皮細胞中是否存在側群(side population，SP)細胞，并研究該表型細胞是否表達通用干細胞標志物ABCG2和表皮干細胞的標志物整合素6和1。方法：運用中性蛋白酶和胰蛋白酶兩步消化法從手術切除的人包皮組織中分離獲得表皮細胞。經(jīng)Hoechst33342熒光染料和PI染色，流式細胞儀分析并分選SP細胞。采用流式細胞儀分析SP細胞ABCG2、整合素6和1的表達情況。結果：人表皮細胞中存在SP細胞，其比例為0.2%0.3%。用流式細胞儀可檢測到在SP細胞以及總表皮細胞中均有少量細胞表達通用干細胞標志物

2、ABCG2以及表皮干細胞的標志物整合素6和1，但二者陽性細胞百分比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。結論：表皮細胞中的SP細胞是否是富集的表皮干細胞仍存在疑問，還需要進一步的動物體內(nèi)移植實驗、克隆形成能力和增殖能力的研究證實。 【關鍵詞】 側群細胞·表皮干細胞·ABCG2·整合素6·整合素1【ABSTRACT】 Objective: To explore side population(SP) cells in human epithelial cells and to observe the expression of the unive

3、rsal stem cell marker ABCG2, epidermal stem cell markers 6 integrin and 1 integrin on SP cells. Methods: Epithelial cells were obtained by digesting human skins with Dispase II and Trypsin and stained with Hoechst33342 and PI. The SP cells were analyzed and sorted by the fluorescence-activated cell

4、sorter. Then the expression of ABCG2, 6 integrin and 1 integrin was analyzed by flow cytometry. Results: SP cells accounted for 0.2%-0.3% of total human epithelial cells. Only a small part of cells expressed ABCG2, integrin 6 and integrin 1 of both SP cells and total human epithelial cells detected

5、by flow cytometry .The difference of positive rates between SP cells and total human epithelial cells was not significant. Conclusion: SP cells accounted for 0.2%-0.3% of total human epithelial cells. The difference of positive rates of stem cells marker ABCG2, integrin 6 and integrin 1 between SP c

6、ells and total human epithelial cells was not significant.【KEY WORDS】 Side population ·Epidermal stem cells ·ABCG2·integrin 6· integrin1側群 (side population，SP) 細胞是利用Hoechst熒光染料和流式細胞術進行造血干細胞分離時發(fā)現(xiàn)的一群特殊細胞，高表達干細胞標志物ABCG2 (ATP-binding cassette superfamily G member 2)1。SP細胞既具有類似干細胞的自我更

7、新和多向分化潛能，還具有獨特的表型標記和生物學特征，代表了一種新的干細胞類型2。已有越來越多的研究者將SP細胞分離法用于對干細胞的分離中。皮膚是始終處于不斷更新狀態(tài)的組織之一，這種不斷的更新是由位于表皮基底部和毛囊隆突部的表皮干細胞維持的。表皮干細胞在創(chuàng)傷修復和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程中具有重要作用，而且是腫瘤發(fā)生和基因治療的主要靶標3。本研究利用SP細胞分離法檢測人表皮細胞中是否存在SP細胞，并研究該表型細胞是否表達通用干細胞標志物ABCG2、表皮干細胞標志物整合素6和1，為進一步研究SP細胞提供線索和基礎。1資料與方法1.1一般資料收集山東大學齊魯醫(yī)院普外科2008年1月2008年10月56例腹

8、部手術患者的腹部皮膚組織。1.2主要試劑與儀器K-SFM培養(yǎng)基、維拉帕米(Gibco公司)，小牛血清(Hyclone公司)，中性蛋白酶、0.25%胰酶(Gibco公司)， Hoechst33342熒光染料、PI(碘化丙錠，Sigma公司)，小鼠抗人ABCG2-FITC、 CD71-PE、6-FITC單克隆抗體(Sigma公司)，羊抗人1-FITC單克隆抗體(millipore公司)，同型對照抗體IgG1-FITC、IgG1-PE(Sigma公司)。超凈工作臺(Air Tech公司)，超速離心機(Sigma公司)，CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(Heraeus公司)，F(xiàn)ACSAria流式細胞儀(BD公司)

9、。1.3實驗方法1.3.1表皮細胞懸液制備無菌條件下取患者腹部皮膚、徹底清洗，去除皮下組織，將皮膚剪切成約0.5 cm×1.0 cm大小的皮片，中性蛋白酶消化，4 過夜。D-Hanks清洗，仔細分離表皮和真皮層，將表皮剪碎，加0.25 %胰酶，室溫孵育8 min，用含血清培養(yǎng)基終止消化，過200目篩網(wǎng)，1 000 r/min離心6 min;用K-SFM培養(yǎng)基重新懸浮細胞，吹打成單細胞懸液。1.3.2細胞染色和SP細胞分選取表皮單細胞懸液，用K-SFM培養(yǎng)液重懸成1×106 mL-1的細胞懸液，加入Hoechst33342至終濃度為5 g/mL。另取同一標本相同量表皮單細胞懸

10、液加入Hoechst33342至終濃度為5 g/mL，同時加入維拉帕米至終濃度為50 g/mL，做為對照組。37 水浴90 min，離心，棄上清。 D-Hanks清洗1次，重懸于含2%小牛血清的PBS緩沖液中，加入PI至終濃度為2 g/mL，上流式細胞儀分選SP細胞。Hoechst33342的激發(fā)光為407 nm紫光， 450/40帶通收集藍光， 695/40帶通和655長通收集紅光。PI的激發(fā)光為488 nm藍光，用575/26帶通收集紅光。1.3.3流式細胞儀分析收集同一標本總表皮細胞和分選的SP細胞，每106 個細胞分別加入5 L小鼠抗人ABCG2-FITC單克隆抗體，4 室溫避光孵育3

11、0 min，D-Hanks液清洗后待檢測，陰性對照管為IgG1-FITC。采用同樣的方法分別用小鼠抗人6-FITC、CD71-PE單克隆雙抗體(陰性對照管IgG1-FITC/IgG1-PE)和羊抗人1-FITC單克隆抗體(陰性對照管為IgG1-FITC)對2種細胞進行熒光抗體標記后，上流式細胞儀分析。1.4觀察項目根據(jù)陰性對照確定標本是否為陽性，Cellquest軟件自動分析陽性率。1.5統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行分析，SP細胞和總表皮細胞ABCG2、整合素6和1陽性表達率結果的記錄方式為至少3次獨立重復結果，記錄為x±s，數(shù)據(jù)進行u檢驗。P0.05為差異有統(tǒng)計學意

12、義。2結果2.1SP細胞分選結果表皮細胞染色后先經(jīng)過前向角和測向角散射光分析，去除左下角細胞碎片。PI染色分為PI陰性活細胞和PI陽性死細胞2群，去除死細胞。收集狀態(tài)良好的活細胞，分析Hoechst33342藍光和紅光的雙參數(shù)圖，SP細胞位于左下角2種熒光均陰性或很弱的區(qū)域。無維拉帕米組SP細胞比例約為0.2%0.3% (圖1A)，對照組經(jīng)維拉帕米阻斷后SP細胞比例減少(<0.01%，圖1B)。2.2流式細胞儀分析SP細胞ABCG2、整合素6和1表達流式細胞儀檢測到SP細胞和總表皮細胞中ABCG2陽性細胞數(shù)均較少(圖2)。SP細胞和總表皮細胞中均有少數(shù)6briCD71dim細胞和

13、整合素1陽性表達細胞(圖3、4)。2種細胞中ABCG2、6briCD71dim細胞和整合素1陽性表達率比較見表1。通用干細胞標志物ABCG2、表皮干細胞標志物整合素6和整合素1在SP細胞和總表皮細胞中的陽性表達率差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。3討論在干細胞表型標記和功能特性研究中，人們利用Hoechst熒光染料結合熒光激活細胞分選(fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS)進行造血干細胞的分析時，發(fā)現(xiàn)一群分布特殊的細胞，經(jīng)過紫外激發(fā)后用雙波長(450 nm和675 nm以上波長)檢測，可以觀察到這群細胞發(fā)出微弱的藍色和紅色熒光，在流式二

14、維分析點陣圖上，呈彗星狀分布在造血干細胞主群的一側，被稱為SP細胞1，這已成為一種常用的分離造血干細胞的方法。在成體多種組織，如肝、肺、腦、神經(jīng)、小腸、氣管等中都發(fā)現(xiàn)了SP細胞，SP細胞具有自我更新和多向分化潛能，在體內(nèi)能夠分化產(chǎn)生不同組織類型的細胞，很多學者認為其代表了一群新型干細胞，并將其稱為側群干細胞4。對SP細胞的研究有助于增加對干細胞各種特性的理解，還提供了一種從組織細胞中分離純化和利用干細胞的策略。表皮干細胞的分離與鑒定對機體穩(wěn)態(tài)維持、創(chuàng)傷愈合以及癌癥等研究起著重要作用。目前，表皮干細胞的分離方法有標記滯留法、克隆分析法、分子標記法5-7。但由于操作繁雜而不易分離，加上表皮干細胞數(shù)

15、量較少，且缺乏特異性分子標志，為其研究帶來了一定困難。因此，本研究采用不依賴分子標記的Hoechst33342染色結合FACS分析人表皮細胞中是否存在干細胞樣的SP細胞。Triel等8采用人(455歲)胸部及耳部皮膚檢測到表皮細胞中SP細胞比例分別為0.01%5.39%、0.08%2.01%，并得出SP細胞比例與部位無相關性的結論。本研究采用人腹部皮膚作為表皮細胞來源，經(jīng)消化分離獲得表皮細胞，結果顯示人皮膚的表皮細胞中存在SP細胞，比例為0.2%0.3%。范圍小于Triel等8的結果，可能與皮膚供者年齡范圍較窄有關。ABC轉(zhuǎn)運蛋白(ATPbinding cassette transporter

16、)是一類跨膜蛋白超家族，參與了多種物質(zhì)分子的“出”、“入”細胞的跨膜轉(zhuǎn)運過程，能選擇性地把一些染料(如Hoechst33342)和藥物泵出細胞外，其成員包括MDR1、ABCG2、ABCA3等9。多數(shù)研究認為高表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白是產(chǎn)生SP表型的原因，提示ABCG2可作為SP細胞的表型標志而用于分離鑒定10。ABCG2能夠被鈣離子拮抗劑維拉帕米非特異性阻斷，抑制染料外排，減少SP細胞比例。本研究在對照組中加入維拉帕米后可見SP亞群明顯減少，與Goodell等1的研究結果相符。但流式細胞儀分析結果顯示，與總表皮細胞相比，SP細胞ABCG2表達并不增高。近來，Zhou 等11通過一系列研究證實ABCG

17、2和MDR1均表達于造血干細胞， 并證實維拉帕米不僅可以阻斷ABCG2，還可阻斷MDR1。所以SP細胞外排Hoechst染料并不只與ABCG2表達有關，應該還有其他的轉(zhuǎn)運蛋白參與，還需進一步研究證實。整合素是一類位于細胞膜表面的糖蛋白受體超家族分子，由和兩種亞單位組成。表皮基底細胞主要表達21、31和64。整合素不僅介導表皮干細胞與細胞外基質(zhì)的黏附，也調(diào)控終末分化啟動。Jones等7發(fā)現(xiàn)整合素1高表達的表皮細胞富含表皮干細胞。Tani等12研究證實， 使用整合素6和另一個表皮細胞的表面標志CD71來區(qū)分表皮干細胞、暫時增殖細胞和終末分化細胞更有優(yōu)勢。通過6和CD71 可以將表皮細胞分為3 種類

18、型，其中6briCD71dim細胞約占細胞總數(shù)的8%，這類細胞代表表皮干細胞。因此，高表達整合素6也被認為是表皮干細胞的表面標志之一。本研究顯示SP細胞中存在6briCD71dim細胞和整合素1陽性表達細胞;總表皮細胞中6briCD71dim細胞比例和整合素1陽性表達率與Jones等7和Tani等12的研究結果一致;但是與總表皮細胞相比，SP細胞表達整合素6和1并不增高。這與Triel等8的研究結果一致。Jones等7已證實高表達整合素6和1是表皮干細胞的標志，而SP細胞整合素6和1表達不增高，因此Triel等8認為表皮細胞中SP細胞可能不是表皮干細胞。本研究認為，雖然SP細胞并不高表達通用干

19、細胞標志物ABCG2、表皮干細胞標志物整合素6和整合素1，但還需要進一步的動物體內(nèi)移植實驗檢測SP細胞的克隆形成能力和增殖能力以及在維持皮膚內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中的作用，才有可能明確表皮細胞中SP細胞是否是富集的表皮干細胞?！緟⒖嘉墨I】 1 Goodell MA, Brose K, Paradis G, et al. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivoJ. Exp Med, 1996,183(4):66-78.2 Bhatt RI, Brow

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