黃岡師范學(xué)院2018年度-2018年度第二學(xué)年分子實(shí)驗(yàn)的考試問(wèn)題詳解

1、2011 2012學(xué)年分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)期末考試試卷答案一簡(jiǎn)答題1. 瓊脂糖凝膠電泳別離DNA勺原理是什么？DNA分子帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中受到電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)向正極移動(dòng)過(guò)程中， 因DNA分子的大小與構(gòu)象差異而呈現(xiàn)遷移位置上的差異，對(duì)于線形DNA分子，其電場(chǎng)中的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)值成反比，電泳時(shí)加溴化乙錠，其與DNA吉合形成一種熒光絡(luò)合物，在254365nn紫外照射下可產(chǎn)生桔紅色的熒光，可用于檢 測(cè)DNA此法可觀察到凝膠中2ng左右的DNA。瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，當(dāng)其加熱到沸點(diǎn)后再冷卻凝固就形成良好的 電泳介質(zhì)，其孔徑?jīng)Q定于其濃度。電泳介質(zhì)中的孔徑對(duì)電泳遷移中的帶電分子產(chǎn) 生一種阻力，阻

2、力的大小取決于帶電分子的大小與其物理性狀。因此，瓊脂糖可制成不同孔徑的凝膠，別離 DNA勺X圍廣，約200bp50kbb在一定電場(chǎng)強(qiáng)度下，假如無(wú)任何介質(zhì)阻礙遷移，如此大DNA分子比小DNA分子跑得快。但在實(shí)際電泳中，由于使用了瓊脂糖分子篩介質(zhì)，對(duì)大分子DNA產(chǎn)生了較強(qiáng)的阻力，因此大分子DNA盡管有較高的帶電量，仍難以快速前進(jìn)；小 分子DNA由于能夠穿越介質(zhì)網(wǎng)孔，其帶電量盡管相對(duì)較小，但仍能快速遷移到正 極。因此，不同的DNA分子在瓊脂糖凝膠中產(chǎn)生了不同的遷移距離，這種遷移距離的差異使得不同大小DNA尋以別離。2. 瓊脂糖凝膠電泳中DNA是靠什么發(fā)出熒光的？為什么？EB即溴化乙錠。因?yàn)殇寤义V含

3、有一個(gè)可以嵌入DNA堆積堿基之間的一個(gè)三環(huán)平面基團(tuán)。它與DNA勺結(jié)合幾乎沒(méi)有堿基序列特異性。在高離子強(qiáng)度的飽和 溶液中，大約每2.5個(gè)堿基插入一個(gè)溴化乙錠分子。當(dāng)染料分子插入后，其平面 基團(tuán)與螺旋的軸線垂直并通過(guò) X德華力與上下堿基相互作用。這個(gè)基團(tuán)的固定位 置與其與堿基的密切接近，導(dǎo)致與DNA吉合的染料呈現(xiàn)熒光，其熒光產(chǎn)率比游離 溶液中染料有所增加。DNA吸收254nm處的紫外輻射并傳遞給染料，而被結(jié)合的 染料本身吸收302nm和366nm的光輻射。這兩種情況下，被吸收的能量在可見(jiàn)光 譜紅橙區(qū)的590nm處重新發(fā)射出來(lái)。由于溴化乙錠-DNA復(fù)合物的熒光產(chǎn)率比沒(méi)有 結(jié)合DNA勺染料高出20-3

4、0倍，所以當(dāng)凝膠中含有游離的溴化乙錠0.5ug/ml 時(shí)，可以檢測(cè)到少至10ng的DNA條帶。3. 制備基因組DNA寸用到的以下試劑CTAB巰基乙醇、氯仿、無(wú)水乙醇、70% 乙醇分別起什么作用？CTAB溶解膜蛋白，破壞細(xì)胞膜，使蛋白質(zhì)變性而沉淀；巰基乙醇：抗氧化劑,有效地防止酚氧化成醌,防止褐變,能保護(hù)DNA另外巰基 乙醇能消除CTAB在震蕩過(guò)程中產(chǎn)生的大量氣泡；氯仿：去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等，純化 DNA無(wú)水乙醇：沉淀DNA70%乙醇：漂洗并沉淀DNA4. 什么是感受態(tài)細(xì)菌？感受態(tài)細(xì)菌的主要作用？感受態(tài)細(xì)菌：細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)稱(chēng)感受態(tài)細(xì)菌。主要作用：感受態(tài)的細(xì)菌適于攝取和容納外

5、來(lái) DNA。再者，將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn) 入感受態(tài)細(xì)菌進(jìn)展表達(dá)，不僅可以檢驗(yàn)重組載體是否構(gòu)建成功，最主要的是感受 態(tài)細(xì)菌作為重組載體的宿主可以進(jìn)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如蛋白質(zhì)表達(dá)純化等工作。5. 簡(jiǎn)單表示質(zhì)粒DNA提取過(guò)程中參加各種試劑后分別會(huì)產(chǎn)生什么現(xiàn)象，簡(jiǎn)要解 釋為什么？溶液I :現(xiàn)象不明顯。菌體重懸于溶液中。溶液U:管底出現(xiàn)沉淀物質(zhì)。溶液II使菌體裂解、蛋白質(zhì)變性，管底就會(huì)出現(xiàn) 一些細(xì)胞碎片和蛋白質(zhì)沉淀物。溶液III :沉淀增加。乙酸鉀能使 SDS產(chǎn)生不溶水的沉淀并將蛋白質(zhì)和染色體沉淀下來(lái)。氯仿：異戊醇24:1 :現(xiàn)象待考溶解蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)無(wú)水乙醇作用：沉淀DNA70%乙醇作用：漂洗并沉淀 DNAT

6、E緩沖液作用：溶解質(zhì)粒 DNA注意：實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象自己對(duì)照實(shí)驗(yàn)報(bào)告寫(xiě)6藍(lán)白斑篩選的原理藍(lán)白斑篩選要篩選的是白班，因?yàn)榘装叽砟康幕蜣D(zhuǎn)入了大腸桿菌中， 藍(lán)斑表 示沒(méi)有轉(zhuǎn)入。具體原理見(jiàn)下：藍(lán)白斑篩選是重組子篩選的一種方法，是根據(jù)載體的遺傳特征篩選重組子，如a -互補(bǔ)、抗生素基因等。現(xiàn)在使用的許多載體都 帶有一個(gè)大腸桿菌的DNA的短區(qū)段，其中有B -半乳糖苷酶基因lacZ的調(diào)控 序列和前146個(gè)氨基酸的編碼信息。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)MCS，它并不破壞讀框，但可使少數(shù)幾個(gè)氨基酸插入到B-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能，這種載體適用于可編碼B -半乳糖苷酶C端局部序列的宿主細(xì) 胞。因此，宿主和

7、質(zhì)粒編碼的片段雖都沒(méi)有酶活性，但它們同時(shí)存在時(shí)，可形成 具有酶學(xué)活性的蛋白質(zhì)。這樣，lacZ基因在缺少近操縱基因區(qū)段的宿主細(xì)胞與帶有完整近操縱基因區(qū)段的質(zhì)粒之間實(shí)現(xiàn)了互補(bǔ)，稱(chēng)為a-互補(bǔ)。由a-互補(bǔ)而產(chǎn)生的LacZ+細(xì)菌在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在時(shí)產(chǎn)生藍(lán)色菌 落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源 DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，幾乎不可防 止地導(dǎo)致無(wú)a-互補(bǔ)能力的氨基端片段，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。 這種重組子的篩選，又稱(chēng)為藍(lán)白斑篩選。量程的調(diào)節(jié)在調(diào)節(jié)量程時(shí)，如果要從大體積調(diào)為小體積，如此按照正常的調(diào)節(jié)方法，逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)旋鈕即可；但如果要從小體積調(diào)為大體積時(shí)， 如此可

8、先順時(shí)針旋轉(zhuǎn)刻度旋鈕至超過(guò)量程的刻度，再回調(diào)至設(shè)定體積，這樣可以 保證量取的最高準(zhǔn)確度。在該過(guò)程中，千萬(wàn)不要將按鈕旋出量程，否如此會(huì)卡住內(nèi)部機(jī)械裝置而損壞了移液槍。槍頭吸液嘴的裝配在將槍頭pipette tips 套上移液槍時(shí)，很多人會(huì)使勁地在槍頭盒子上敲幾下，這時(shí)錯(cuò)誤的做法，因?yàn)檫@樣會(huì)導(dǎo)致移液槍的內(nèi)部配件 如彈 簧因敲擊產(chǎn)生的瞬時(shí)撞擊力而變得松散，甚至?xí)?dǎo)致刻度調(diào)節(jié)旋鈕卡住。正確 的方法是將移液槍器垂直插入槍頭中，稍微用力左右微微轉(zhuǎn)動(dòng)即可使其嚴(yán)密 結(jié)合。如果是多道如8道或12道移液槍?zhuān)绱丝梢詫⒁埔簶尩牡谝坏缹?duì)準(zhǔn) 第一個(gè)槍頭，然后傾斜地插入，往前后方向搖動(dòng)即可卡緊。槍頭卡緊的標(biāo)志是略 為超過(guò)

9、0型環(huán)，并可以看到連接局部形成清晰的密封圈。移液的方法移液之前，要保證移液器、槍頭和液體處于一樣溫度。吸取液體時(shí)，移液器保持豎直狀態(tài)，將槍頭插入液面下 2-3毫米。在吸液之前，可以先 吸放幾次液體以潤(rùn)濕吸液嘴尤其是要吸取粘稠或密度與水不同的液體時(shí)。這 時(shí)可以米取兩種移液方法。一是前進(jìn)移液法。用大拇指將按鈕按下至第一停點(diǎn)，然后慢慢松開(kāi)按鈕回原點(diǎn)。接著將按鈕按至第一停點(diǎn)排出液體，稍停 片刻繼續(xù)按按鈕至第二停點(diǎn)吹出剩余的液體。 最后松開(kāi)按鈕。二是反向移液法。此法一般用于轉(zhuǎn)移高粘液體、生物活性液體、易起泡液體或極微量的 液體，其原理就是先吸入多于設(shè)置量程的液體， 轉(zhuǎn)移液體的時(shí)候不用吹出剩余的 液體。先

10、按下按鈕至第二停點(diǎn)，慢慢松開(kāi)按鈕至原點(diǎn)。接著將按鈕按至第一停點(diǎn) 排出設(shè)置好量程的液體，繼續(xù)保持按住按鈕位于第一停點(diǎn)千萬(wàn)別再往下按， 取下有殘留液體的槍頭，棄之。移液器的正確放置使用完畢，可以將其豎直掛在移液槍架上，但要小心別掉下來(lái)。當(dāng)移液器槍頭里有液體 時(shí)，切勿將移液器水平放置或倒置，以免液體倒流腐蝕活塞彈簧。維護(hù)保養(yǎng)時(shí)的須知事項(xiàng)如不使用，要把移液槍的量程調(diào)至最大值的刻度，使彈簧處于松弛狀態(tài)以保護(hù)彈簧。最好定期清洗移液槍?zhuān)梢杂梅试硭?0 %的異丙醇，再用蒸餾水清洗，自然晾干。高溫消毒之前，要確保移液器能適應(yīng)高溫。校準(zhǔn)是可以在20-25度環(huán)境中，通過(guò)重復(fù)幾次秤量蒸餾水的方法來(lái)進(jìn)展。使用時(shí)要檢

11、查是否有漏液現(xiàn)象。方法時(shí)吸取液體后懸空垂直放置幾秒中，看看液面是否下降。如果漏液，原因大 致有一下幾方面：1、槍頭是否匹配；2、彈簧活塞是否正常；3、如果是易揮發(fā)的液體許多有機(jī)溶劑都如此，如此可能是飽和蒸汽壓的問(wèn)題。可以先吸放幾次液體，然后再移液。論述題1.答：1如果該目的基因?yàn)榛颍倚蛄?，如此通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)查到基因序列，根 據(jù)序列設(shè)計(jì)引物，PCR獲得全長(zhǎng)，凝膠回收后，與載體連接、轉(zhuǎn)化、挑單克隆培 養(yǎng)提取質(zhì)粒DNA測(cè)序驗(yàn)證。2如果該目的基因?yàn)樾虏牧现械幕颍倚蛄形粗?，如此可通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn) 展同源基因序列搜索，比對(duì)分析，根據(jù)同源性高的局部設(shè)計(jì)引物，PCR獲得片段, 測(cè)序得到局部序列，根據(jù)的局部序列設(shè)計(jì)GSF引物，利用RACE分別獲得5'與3' 端序列，測(cè)序拼接成全長(zhǎng)序列，再根據(jù) 1步的步驟獲得該目的基因。關(guān)鍵技術(shù)：引物設(shè)計(jì)，利用堿基互補(bǔ)原理，注意引物 Tm值、GC含量、發(fā) 夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體、錯(cuò)配等。連接、轉(zhuǎn)化，利用 Taq酶反響加A的特性，與 T載體可以互補(bǔ)，連接。轉(zhuǎn)化，如此是利用a互補(bǔ)顯色反響原理，對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn) 展篩選。注意連接時(shí)目的片段與載體的摩爾比為 5: 1-10 : 1, 一般16度過(guò)夜連 接,轉(zhuǎn)化時(shí)注意感受態(tài)