醫(yī)學(xué)微生物學(xué)病毒感染檢查方法和防治原則

1、醫(yī)學(xué)微生物學(xué)病毒感染檢查方醫(yī)學(xué)微生物學(xué)病毒感染檢查方法和防治原則法和防治原則 1 1）掌握病毒的分離培養(yǎng)方法；）掌握病毒的分離培養(yǎng)方法； 2 2）熟悉標(biāo)本的采集與送檢原則、病毒感染的快）熟悉標(biāo)本的采集與送檢原則、病毒感染的快速診斷；速診斷； 3 3）了解病毒感染的免疫預(yù)防、抗病毒治療。）了解病毒感染的免疫預(yù)防、抗病毒治療。第一節(jié)第一節(jié) 病毒感染的檢查方法病毒感染的檢查方法第二節(jié)第二節(jié) 病毒感染的特異性預(yù)防病毒感染的特異性預(yù)防第三節(jié)第三節(jié) 病毒感染的治療病毒感染的治療第一節(jié)第一節(jié)病毒感染的檢查方法病毒感染的檢查方法一、標(biāo)本的采集與運(yùn)送一、標(biāo)本的采集與運(yùn)送病人急性期標(biāo)本病人急性期標(biāo)本標(biāo)本抗生素標(biāo)本

2、抗生素抑制細(xì)菌真菌繁殖抑制細(xì)菌真菌繁殖病變組織加入病變組織加入50甘油緩沖鹽水低溫甘油緩沖鹽水低溫保存，盡快送檢。保存，盡快送檢。70保存保存血清標(biāo)本：在發(fā)病初期和發(fā)病后血清標(biāo)本：在發(fā)病初期和發(fā)病后23W各取一份血清，對(duì)比雙份血清抗體效價(jià)各取一份血清，對(duì)比雙份血清抗體效價(jià)的動(dòng)態(tài)變化。的動(dòng)態(tài)變化。: 病毒的分離培養(yǎng)病毒的分離培養(yǎng) 病毒的鑒定病毒的鑒定 病毒數(shù)量及感染性測(cè)定病毒數(shù)量及感染性測(cè)定二、二、病毒的分離培養(yǎng)與鑒定病毒的分離培養(yǎng)與鑒定病毒的分離培養(yǎng)方法：病毒的分離培養(yǎng)方法： 動(dòng)物接種動(dòng)物接種 雞胚培養(yǎng)雞胚培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng): 動(dòng)物接種動(dòng)物接種(animal inoculation)(an

3、imal inoculation)動(dòng)物：鼠、兔、猴、黑猩猩等動(dòng)物：鼠、兔、猴、黑猩猩等優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果易觀察，可建立動(dòng)物模型優(yōu)點(diǎn)：結(jié)果易觀察，可建立動(dòng)物模型缺點(diǎn)：有飼養(yǎng)條件要求，費(fèi)用高、動(dòng)物缺點(diǎn)：有飼養(yǎng)條件要求，費(fèi)用高、動(dòng)物 體內(nèi)常帶有潛伏病毒。體內(nèi)常帶有潛伏病毒。 目前已很少應(yīng)用。目前已很少應(yīng)用。 雞胚培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)(embryonated egg culture)(embryonated egg culture)受精卵受精卵孵育孵育9-149-14天天雞胚雞胚接種病毒接種病毒孵育孵育2-72-7天天收獲相應(yīng)的材料進(jìn)行鑒定收獲相應(yīng)的材料進(jìn)行鑒定尿囊腔接種尿囊腔接種絨毛尿囊膜絨毛尿囊膜接種接種卵黃囊卵

4、黃囊接種接種羊膜腔羊膜腔接種接種Chick embryo inoculationChick embryo inoculationAllantoic inoculation is done mainly for production of vaccine of influenza virus. 主要用于流感病毒疫苗的生產(chǎn)主要用于流感病毒疫苗的生產(chǎn)Viral replication produces visible lesions (pocks), grey-white area in the transparent(透明的透明的) allantoic(尿囊的尿囊的) membrane. Poxv

5、irus inoculate in allantoic membrane痘病毒絨膜尿痘病毒絨膜尿囊膜接種囊膜接種優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：易管理易管理 不帶微生物不帶微生物 成本較低成本較低缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：操作程序復(fù)雜操作程序復(fù)雜目前用雞胚培養(yǎng)的病毒主要是流感病毒目前用雞胚培養(yǎng)的病毒主要是流感病毒 雞胚培養(yǎng)雞胚培養(yǎng)(embryonated egg culture)(embryonated egg culture)根據(jù)細(xì)胞生長的方式分根據(jù)細(xì)胞生長的方式分: : 單層細(xì)胞培養(yǎng)（單層細(xì)胞培養(yǎng)（monolayer cell culturemonolayer cell culture）根據(jù)細(xì)胞來源、染色體特征及傳代次數(shù)分

6、根據(jù)細(xì)胞來源、染色體特征及傳代次數(shù)分: : 原代培養(yǎng)細(xì)胞原代培養(yǎng)細(xì)胞 二倍體細(xì)胞株二倍體細(xì)胞株 傳代細(xì)胞系或株傳代細(xì)胞系或株原代培養(yǎng)細(xì)胞（原代培養(yǎng)細(xì)胞（primary cultural cells)primary cultural cells)組織組織 組織塊組織塊 分散的單個(gè)細(xì)胞分散的單個(gè)細(xì)胞 單層細(xì)胞單層細(xì)胞 剪碎 蛋白酶( (原代細(xì)胞原代細(xì)胞) )單層細(xì)胞單層細(xì)胞( (次代細(xì)胞次代細(xì)胞) )傳代培養(yǎng)培養(yǎng)基原代培養(yǎng)細(xì)胞（原代培養(yǎng)細(xì)胞（primary cultural cells)primary cultural cells)epithelial cells特點(diǎn)特點(diǎn): : 對(duì)多種病毒敏感對(duì)多

7、種病毒敏感 生長能力有限生長能力有限, , 獲取成本高獲取成本高 可攜帶潛伏病毒可攜帶潛伏病毒應(yīng)用應(yīng)用: : 病毒分離與鑒定病毒分離與鑒定 病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 不能用于制備疫苗不能用于制備疫苗原代培養(yǎng)細(xì)胞（原代培養(yǎng)細(xì)胞（primary cultural cells)primary cultural cells)體外分裂體外分裂5050100100代仍保持二倍染色體數(shù)目的單型細(xì)胞代仍保持二倍染色體數(shù)目的單型細(xì)胞特點(diǎn)特點(diǎn): : 對(duì)多種病毒敏感對(duì)多種病毒敏感 不帶異種蛋白不帶異種蛋白( (人源性人源性) ) 不帶病毒不帶病毒, ,無致瘤潛能無致瘤潛能應(yīng)用應(yīng)用: : 病毒分離與鑒定病毒分離與

8、鑒定 病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 制備疫苗制備疫苗二倍體細(xì)胞株二倍體細(xì)胞株(diploid cell strain)(diploid cell strain)fibroblastic cells傳代細(xì)胞系傳代細(xì)胞系(continuous cell line )(continuous cell line )特點(diǎn)特點(diǎn): : 對(duì)多種病毒敏感性高對(duì)多種病毒敏感性高 繁殖能力強(qiáng)繁殖能力強(qiáng), ,傳代時(shí)間長傳代時(shí)間長 有致癌危險(xiǎn)有致癌危險(xiǎn)( (來源于癌細(xì)胞或來源于癌細(xì)胞或突變的二倍體細(xì)胞株突變的二倍體細(xì)胞株) )應(yīng)用應(yīng)用: : 病毒分離與鑒定病毒分離與鑒定 病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)研究 不能用于制備疫苗不

9、能用于制備疫苗能在體外無限傳代的細(xì)胞系。如能在體外無限傳代的細(xì)胞系。如 HeLa, Hep-2epithelioid cells: 病毒的分離培養(yǎng)病毒的分離培養(yǎng) 病毒的鑒定病毒的鑒定 病毒數(shù)量及感染性測(cè)定病毒數(shù)量及感染性測(cè)定二、二、病毒的分離培養(yǎng)與鑒定病毒的分離培養(yǎng)與鑒定 病毒在細(xì)胞中增殖的指標(biāo)病毒在細(xì)胞中增殖的指標(biāo) 病毒形態(tài)學(xué)鑒定病毒形態(tài)學(xué)鑒定 病毒抗原鑒定病毒抗原鑒定 病毒病毒基因鑒定基因鑒定 病毒在敏感細(xì)胞內(nèi)增殖引起特有的細(xì)胞病變。病毒在敏感細(xì)胞內(nèi)增殖引起特有的細(xì)胞病變。 CPECPE：病毒感染細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變：病毒感染細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變Syncytium formation in cel

10、l culture caused by RSV (top), and measles virus (bottom). CPE：病毒感染細(xì)病毒感染細(xì) 胞與鄰近細(xì)胞融合胞與鄰近細(xì)胞融合CPECPE：形成包涵體（：形成包涵體（inclusion bodyinclusion body）Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet. 紅細(xì)胞吸附（紅細(xì)胞吸附（hemadsorption, HAdhemadsorption, HAd

11、）受染細(xì)胞膜表面血凝素（受染細(xì)胞膜表面血凝素（HAHA） RBCRBC表面表面HAHA受體受體 干擾現(xiàn)象（干擾現(xiàn)象（interferenceinterference）風(fēng)疹病毒人胚腎細(xì)胞風(fēng)疹病毒人胚腎細(xì)胞 病毒增殖，病毒增殖，CPECPE（）（）?？刹《救伺吣I細(xì)胞埃可病毒人胚腎細(xì)胞 病毒增殖，病毒增殖，CPECPE（）（）人胚腎細(xì)胞人胚腎細(xì)胞風(fēng)疹病毒？風(fēng)疹病毒？?？刹《景？刹《綜PE(-)CPE(-)埃可病毒?？刹《? (+) ) 風(fēng)疹病毒風(fēng)疹病毒(+) (+) CPE(+)CPE(+)?？刹《景？刹《?+)(+) 風(fēng)疹病毒風(fēng)疹病毒(-)(-) 細(xì)胞代謝的改變細(xì)胞代謝的改變細(xì)胞培養(yǎng)瓶細(xì)胞培養(yǎng)瓶

12、代謝變化代謝變化-PH 病毒在細(xì)胞中增殖的指標(biāo)病毒在細(xì)胞中增殖的指標(biāo) 細(xì)胞病變效應(yīng)細(xì)胞病變效應(yīng)( cytopathic effect,CPE)紅細(xì)胞吸附紅細(xì)胞吸附病毒干擾作用病毒干擾作用細(xì)胞代謝的改變細(xì)胞代謝的改變 病毒在細(xì)胞中增殖的指標(biāo)病毒在細(xì)胞中增殖的指標(biāo) 病毒形態(tài)學(xué)鑒定病毒形態(tài)學(xué)鑒定 病毒抗原鑒定病毒抗原鑒定 病毒病毒基因鑒定基因鑒定: 病毒的分離培養(yǎng)病毒的分離培養(yǎng) 病毒的鑒定病毒的鑒定 病毒數(shù)量及感染性測(cè)定病毒數(shù)量及感染性測(cè)定二、二、病毒的分離培養(yǎng)與鑒定病毒的分離培養(yǎng)與鑒定 病毒數(shù)量及感染性測(cè)定：病毒數(shù)量及感染性測(cè)定：50%50%組織細(xì)胞感染量組織細(xì)胞感染量蝕蝕( (空空) )斑形成試

13、驗(yàn)斑形成試驗(yàn) 病毒總量病毒總量( (活病毒活病毒+ +死病毒死病毒) )：感染性病毒量感染性病毒量: :血凝試驗(yàn)血凝試驗(yàn)概念概念: : 測(cè)定病毒感染細(xì)胞后引起測(cè)定病毒感染細(xì)胞后引起50%50%細(xì)胞病變的最小病細(xì)胞病變的最小病毒量。毒量。方法方法: :一般是將病毒懸液作一般是將病毒懸液作1010倍的系列稀釋，分倍的系列稀釋，分別接種細(xì)胞，經(jīng)一定時(shí)間后觀察別接種細(xì)胞，經(jīng)一定時(shí)間后觀察CPECPE、血細(xì)胞吸、血細(xì)胞吸附等指標(biāo)，以能使附等指標(biāo)，以能使50%50%細(xì)胞感染的病毒的最高稀細(xì)胞感染的病毒的最高稀釋度作為終點(diǎn)。最后用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算出釋度作為終點(diǎn)。最后用統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算出50%50%組織組織細(xì)胞感染量

14、。細(xì)胞感染量。用途用途: : 測(cè)定感染性病毒的量和毒力測(cè)定感染性病毒的量和毒力 分別為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀釋度的HCMV感染的HEL細(xì)胞原理：適當(dāng)濃度的感染性病毒在覆蓋瓊原理：適當(dāng)濃度的感染性病毒在覆蓋瓊脂的細(xì)胞層上產(chǎn)生可見和可數(shù)的局部病脂的細(xì)胞層上產(chǎn)生可見和可數(shù)的局部病灶稱為灶稱為蝕蝕斑。一個(gè)斑。一個(gè)蝕蝕斑是由一個(gè)感染性斑是由一個(gè)感染性病毒顆粒增殖而形成的，由病毒顆粒增殖而形成的，由蝕蝕斑的數(shù)目斑的數(shù)目可以計(jì)算出原始標(biāo)本中感染性病毒的含可以計(jì)算出原始標(biāo)本中感染性病毒的含量。量。PLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYP

15、LAQUE ASSAYPLAQUE ASSAYPLAQUE ASSAY 分別為10-1、10-2、10-3倍稀釋度的HCMV病毒液感染的HEL細(xì)胞用途：用途： 測(cè)定感染性病毒量測(cè)定感染性病毒量 單位單位: PFU (plaque forming unit)/ml: PFU (plaque forming unit)/ml 由一個(gè)感染性病毒顆粒增殖而形成的一個(gè)空由一個(gè)感染性病毒顆粒增殖而形成的一個(gè)空斑稱為空斑形成單位。斑稱為空斑形成單位。 分純病毒分純病毒 已知抗原已知抗原測(cè)抗體（診斷）測(cè)抗體（診斷） 已知抗體已知抗體測(cè)抗原（測(cè)抗原（鑒定病毒鑒定病毒屬、屬、種、種、 型、亞型型、亞型） 三三.

16、病毒感染的血清學(xué)診斷病毒感染的血清學(xué)診斷( (1 1) ) 中和試驗(yàn)中和試驗(yàn)(Neutralization test)(Neutralization test)(2)(2) 血凝抑制試驗(yàn)血凝抑制試驗(yàn)(H(Hemagglutinatiemagglutination ion inhibition testnhibition test) )( (3 3) ) 免疫標(biāo)記法免疫標(biāo)記法( (FIAFIA、EIAEIA、RIARIA) ) 蛋白印跡蛋白印跡(Western blot)(Western blot)方法：方法： 三三. 病毒感染的血清學(xué)診斷病毒感染的血清學(xué)診斷Positive immunoflu

17、orescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC)HEL細(xì)胞中細(xì)胞中CMV IE1蛋白的表達(dá)蛋白的表達(dá)Enzyme immunoassay (EIA)ELISAColoured wells indicate reactivityAIDS的確診試驗(yàn)的確診試驗(yàn)Western blot 四四. 病毒感染的快速診斷病毒感染的快速診斷電鏡和免疫電鏡檢查電鏡和免疫電鏡檢查 普通光學(xué)顯微鏡檢查普通光學(xué)顯微鏡檢查 包涵體包涵體電子顯微鏡電子顯微鏡：可觀察各種病毒的形態(tài)：可觀察各種病毒的形態(tài) 但設(shè)備貴、操作復(fù)雜，但設(shè)備貴、操作復(fù)雜，應(yīng)用受限應(yīng)用受限光學(xué)顯

18、微鏡光學(xué)顯微鏡：可觀察：可觀察大病毒大病毒（痘病毒）痘病毒）和包涵體和包涵體 對(duì)一般病毒檢測(cè)對(duì)一般病毒檢測(cè)意義不大意義不大Inclusion bodyCytomegalic cell that contains a dense, owls eye, acidophilic intranuclear inclusion body Negry bodyp香港大學(xué)專家：患者鼻咽標(biāo)本香港大學(xué)專家：患者鼻咽標(biāo)本VeroVero細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)CPE CPE EMEM觀察：冠狀病毒觀察：冠狀病毒p隨后加拿大和美國隨后加拿大和美國CDCCDC等等SARSSARS國際協(xié)作組的多個(gè)實(shí)國際協(xié)作組的多個(gè)實(shí)驗(yàn)室也培養(yǎng)

19、出了冠狀病毒驗(yàn)室也培養(yǎng)出了冠狀病毒p利用利用免疫熒光法免疫熒光法將分離病毒與將分離病毒與SARSSARS患者血清進(jìn)患者血清進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，反應(yīng)呈陽性行血清學(xué)檢測(cè)，反應(yīng)呈陽性p從冠狀病毒基因組的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用從冠狀病毒基因組的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，采用RT-RT-PCRPCR方法從培養(yǎng)上清中擴(kuò)增出了冠狀病毒基因方法從培養(yǎng)上清中擴(kuò)增出了冠狀病毒基因測(cè)測(cè)序序經(jīng)經(jīng)GenbankGenbank數(shù)據(jù)庫同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性為數(shù)據(jù)庫同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)同源性為64%64%左右左右p加拿大專家完成了全基因組測(cè)序加拿大專家完成了全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)與已知人和發(fā)現(xiàn)與已知人和動(dòng)物的冠狀病毒的同源性差異較大動(dòng)物的冠狀病毒的同

20、源性差異較大確定為一種新確定為一種新的冠狀病毒。的冠狀病毒。p荷蘭的病毒學(xué)家：用這種冠狀病毒感染猴子荷蘭的病毒學(xué)家：用這種冠狀病毒感染猴子出現(xiàn)出現(xiàn)了與了與SARSSARS病人相同的臨床表現(xiàn)和病理特征病人相同的臨床表現(xiàn)和病理特征再次再次從動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)引起從動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)引起SARSSARS的病原體是這種冠狀的病原體是這種冠狀病毒病毒pWHOWHO將其命名為將其命名為SARSSARS冠狀病毒冠狀病毒第二節(jié)第二節(jié)病毒感染特異性預(yù)防病毒感染特異性預(yù)防 第三節(jié)第三節(jié)病毒感染的治療病毒感染的治療 1 1抗病毒的化學(xué)制劑：目前抗病毒化學(xué)藥物主要有核抗病毒的化學(xué)制劑：目前抗病毒化學(xué)藥物主要有核苷類藥物。苷類

21、藥物。（1 1）核苷類藥物：通過阻抑子代病毒基因的合成與表達(dá)，）核苷類藥物：通過阻抑子代病毒基因的合成與表達(dá)，抑制病毒復(fù)制抑制病毒復(fù)制 . .常用藥物有常用藥物有: :用于用于DNADNA病毒感染病毒感染: :阿糖腺苷、碘尿苷、無環(huán)鳥苷（阿昔阿糖腺苷、碘尿苷、無環(huán)鳥苷（阿昔洛韋）、丙氧鳥苷；洛韋）、丙氧鳥苷；用于用于HIVHIV感染感染: :疊氮脫氧胸苷（疊氮脫氧胸苷（AZTAZT）廣譜抗病毒廣譜抗病毒:3-:3-氮唑核苷，對(duì)多種氮唑核苷，對(duì)多種RNARNA或或DNADNA病毒有抑制作病毒有抑制作用。用。 （2 2）病毒蛋白酶抑制劑：通過抑制病毒蛋）病毒蛋白酶抑制劑：通過抑制病毒蛋白酶的活性，阻止病毒的復(fù)制白酶的活性，阻止病毒的復(fù)制. . 常用藥物有印地那韋、利多那韋等，對(duì)常用藥物有印地那韋、利多那韋等，對(duì)HIVHIV有一定抑制作用。有一定抑制作用。 （3 3）其它抗病毒藥物：金剛烷胺或甲基金）其它抗病毒藥物：金剛烷胺或甲基金剛烷胺用于甲型流感的治療，甲酸磷霉素用剛烷胺用于甲型流感的治療，甲酸磷霉素用于皰疹病毒感染的治療。于皰疹病毒感染的治療。 2 2干擾素及干擾素誘生劑干擾素及干擾素誘生劑 : : 干擾素具有廣譜抗病毒作用，主要用干擾素具有廣譜抗病毒作用，主要用IFN-IFN-，副作用小，對(duì)某些病毒性疾病的防治有較好，副作用小，對(duì)某些病毒性疾病的防治有較好的效果的效