寨卡提取物體外對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其作用機(jī)制研究

1、寨卡提取物體外對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其作用機(jī)制研究         作者：江南，曾瑾，清源，羅霞，楊志榮 【摘要】 目的研究寨卡提取物誘導(dǎo)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡的作用，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討。方法以寨卡提取物作用于人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，采用MTT法分析寨卡提取物對(duì)LoVo腫瘤細(xì)胞的抑制生長(zhǎng)作用；采用Annexin V-FITC熒光染色實(shí)驗(yàn)             

2、0;           作者：江南，曾瑾，清源，羅霞，楊志榮【摘要】  目的研究寨卡提取物誘導(dǎo)人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞凋亡的作用，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行探討。方法以寨卡提取物作用于人結(jié)腸癌LoVo細(xì)胞，采用MTT法分析寨卡提取物對(duì)LoVo腫瘤細(xì)胞的抑制生長(zhǎng)作用；采用Annexin V-FITC熒光染色實(shí)驗(yàn)，考察細(xì)胞在藥物作用下的質(zhì)膜變化，對(duì)提取物誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)；采用比色法測(cè)定寨卡提取物對(duì)人大腸癌LoVo腫瘤細(xì)胞內(nèi)還原型谷胱甘肽（GSH）的耗竭作用和對(duì)谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶（G

3、ST）的誘導(dǎo)作用；同時(shí)利用DCFH-DA探針，檢測(cè)LoVo腫瘤細(xì)胞給藥后的活性氧水平；應(yīng)用Western蛋白印跡法檢測(cè)Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達(dá)。結(jié)果寨卡提取物具有明顯的體外抗腫瘤活性，并呈劑量依賴關(guān)系，IC50為550g·ml-1。該藥物可通過(guò)改變細(xì)胞質(zhì)膜，耗竭細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量，增加谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶含量，上調(diào)腫瘤細(xì)胞內(nèi)活性氧水平等途徑，提高Caspase-3和Caspase-9蛋白的表達(dá)，誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞發(fā)生凋亡。結(jié)論寨卡提取物可誘導(dǎo)LoVo細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能通過(guò)耗竭細(xì)胞內(nèi)GSH 的含量，以ROS為介導(dǎo)直接作用于細(xì)胞線粒體，誘導(dǎo)凋亡的產(chǎn)生。寨卡提取物對(duì)

4、LoVo細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用還可能與其增加Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  寨卡 細(xì)胞凋亡 結(jié)腸癌 LoVo細(xì)胞Abstract：ObjectiveTo study the induction of the extract from Thlaspi arvense Linn.(ZAF) on apoptosis in human colorectal carcinoma LoVo cells and its mechanisms in vitro.MethodsMTT assay was employed to evaluate the surviva

5、l of LoVo cells. The induction of apoptosis was detected by Annexin V-FITC staining. The depletion of glutathione (GSH) and the induction of glutathione-S-transferase (GST) effects of ZAF in LoVo cells were dectected. The level of reactive oxygen species (ROS) in LoVo cells was analyzed with DCFH-DA

6、 as probe. The protein expressions of Caspase-3 and Caspase-9 in LoVo cells were assayed by Western blot. ResultsZAF effectively inhibited LoVo cell viability in vitro and induced LoVo cells apoptosis in a dose-dependent manner, and IC50 was 550g·ml-1. ZAF could obviously deplet the level of GS

7、H level, increase activity of GST, and accumulate ROS in LoVo cells. Over-expression of Caspase-3 and Caspase-9 mediated by ZAF in a concentration-dependent manner were observed. ConclusionZAF can induce apoptosis of LoVo cells, which is relative to the changes of the cells redox states and upregula

8、ting Caspase-3 and Caspase-9 expression.Key words：Thlaspi arvense Linn.  apoptosis；  Human colorectal carcinoma；  LoVo cells    寨卡是一味常用藏藥，為十字花科植物Thlaspi arvense Linn.的干燥成熟種子。在傳統(tǒng)藏醫(yī)藥應(yīng)用中，寨卡性辛、微溫，具有散風(fēng)明目，活絡(luò)通痹，溫補(bǔ)五臟，清肺熱、腎熱，健胃之功效，主要用于治療目赤腫痛流淚，肺熱，咳嗽，腎熱，淋病，消化不良，嘔吐等病癥。目前針對(duì)寨卡化學(xué)成分缺乏

9、系統(tǒng)細(xì)致的報(bào)道，僅通過(guò)初步的植物化學(xué)研究所知，寨卡含黑芥子苷（Sinigrin），又含脂肪油34，揮發(fā)油0.836，蔗糖1.8，卵磷脂1.6等1。本課題組的前期研究工作發(fā)現(xiàn)，寨卡中含有活性強(qiáng)烈的抗腫瘤成分，其有效部位為十字花科植物中富含的硫代葡萄糖苷（glucosinolate）類物質(zhì)2，該有效部位提取物ZAF體外抗腫瘤作用與其抑制細(xì)胞增值和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)3，本研究對(duì)寨卡提取物誘導(dǎo)LoVo 腫瘤細(xì)胞凋亡的作用靶點(diǎn)和影響途徑進(jìn)行研究，以探討寨卡提取物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為開(kāi)辟寨卡新的藥用途徑奠定理論基礎(chǔ)。1  材料與儀器1.1  藥品與試劑寨卡有效部位提取物（activ

10、e fractions of pennycress，ZAF），由四川省中醫(yī)藥研究院中藥細(xì)胞與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。RPMI-1640培養(yǎng)基（GIBCO公司）；小牛血清（HyClone公司）；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所）；谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒、還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)定試劑盒（購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司）；活性氧檢測(cè)試劑盒（購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司）；兔抗肌動(dòng)蛋白（-actin）、鼠抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-3），兔抗人半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase-9）抗體、抗小鼠IgG、及抗兔IgG均為Santa

11、Cruz產(chǎn)品；ECL檢測(cè)底物I和II（Pierce公司）；臺(tái)盼藍(lán)，MTT，SDS，胰蛋白酶，EDTA·4Na均購(gòu)自Sigma公司；青霉素，慶大霉素及其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；硝酸纖維素膜(博士德)。1.2  儀器與設(shè)備倒置顯微鏡（Nikon，TS10）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Heraeus，BB5060UV）；酶標(biāo)儀（Themo Electron，Multiskan）；垂直電泳槽(Bio-rad Mini-PROTEAN 3)；轉(zhuǎn)印槽(Bio-rad Trans-blot)；凝膠成相系統(tǒng)（Bio-Rad，ChemiDoc XRS）；電泳電源(Bio-rad Powerpac B

12、asic)。2  方法2.1  細(xì)胞培養(yǎng)人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo（ATC編號(hào)：CCL-229），購(gòu)于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。在本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)培養(yǎng)于含10小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)中（青霉素100 KU·L-1，鏈霉素100 mg·L-1），放置于37，5CO2的培養(yǎng)箱下，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.2  細(xì)胞增殖抑制作用的檢測(cè)LoVo細(xì)胞（5.0×104個(gè)細(xì)胞/孔）接種于96孔板，用不同濃度的ZAF作用48 h后，采用MTT法4，酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔吸光度（A570），每個(gè)濃度組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞抑制率（%）

13、= （對(duì)照組A-實(shí)驗(yàn)組A）/（對(duì)照組A-空白組A）×100%。并計(jì)算IC50。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。2.3  Annexin V-FITC/PI熒光雙染色取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 LoVo 細(xì)胞，按5×105個(gè)/孔接種于24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板，預(yù)培養(yǎng)24 h。設(shè)置3個(gè)藥物作用濃度，分別為300，550，1 000 g·ml-1，每種濃度設(shè)3個(gè)平行孔，同時(shí)做陰性對(duì)照孔（加細(xì)胞和培養(yǎng)液，不加藥物；即藥物濃度為0 g·ml-1）。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)36 h。利用Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)LoVo細(xì)胞死亡時(shí)質(zhì)膜變化進(jìn)行熒光染色檢測(cè)。2.4  We

14、stern蛋白印跡法分析Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達(dá)LoVo細(xì)胞與不同濃度的ZAF作用36 h（200，400，800，1 000g·ml-1）后，離心收集，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞總蛋白，用Bradford法測(cè)定蛋白濃度，采用Western蛋白印跡法檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9蛋白的表達(dá)5，以肌動(dòng)蛋白（-actin）作為內(nèi)標(biāo)。2.5  LoVo腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 LoVo 細(xì)胞按1×106個(gè)/瓶接種于50 ml平底細(xì)胞培養(yǎng)瓶，預(yù)培養(yǎng)24 h。設(shè)置3個(gè)藥物作用濃度，分別為300，550，1 000 g

15、3;ml-1，同時(shí)做細(xì)胞陰性對(duì)照瓶（細(xì)胞和培養(yǎng)液）和陽(yáng)性藥物對(duì)照瓶（順鉑，藥物濃度為10 g·ml-1）。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)24 h。利用還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)定試劑盒對(duì)LoVo腫瘤細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽含量進(jìn)行測(cè)定。2.6  LoVo腫瘤細(xì)胞谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期LoVo細(xì)胞，按1×106個(gè)/瓶接種于50ml平底細(xì)胞培養(yǎng)瓶，預(yù)培養(yǎng)24 h。設(shè)置3個(gè)藥物作用濃度，分別為300，550，1 000 g·ml-1，同時(shí)做細(xì)胞陰性對(duì)照瓶（細(xì)胞和培養(yǎng)液）。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)36 h。利用谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶測(cè)定試劑盒對(duì)LoVo腫瘤細(xì)胞谷胱甘肽-S轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行測(cè)定。2.7  LoVo腫瘤細(xì)胞活性氧