絞股藍(lán)皂甙及平陽(yáng)霉素對(duì)口腔鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞抑制作用的研究

1、    絞股藍(lán)皂甙及平陽(yáng)霉素對(duì)口腔鱗癌頸淋巴結(jié) 轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞抑制作用的研究        摘要目的：探討絞股藍(lán)皂甙(gypenosides, GP)及平陽(yáng)霉素(PYM)對(duì)口腔鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌GNM細(xì)胞的體外抑制作用及作用機(jī)制。方法：采用MTT法及流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。結(jié)果：GP與PYM對(duì)GNM細(xì)胞均有抑制作用,抑制率與藥物濃度呈正相關(guān),二者聯(lián)用,抑制率增強(qiáng)。GP主要作用于細(xì)胞的“S”期。結(jié)論：GP與PYM對(duì)GNM細(xì)胞具有抑制作用, GP對(duì)細(xì)胞的損傷是通過(guò)干擾細(xì)胞周期實(shí)

2、現(xiàn)的,GP與PYM聯(lián)用抑制作用增強(qiáng)在于二者作用的細(xì)胞周期不同。提示用藥時(shí)可根據(jù)二者各時(shí)相時(shí)間分開(kāi)應(yīng)用。GP具有臨床應(yīng)用價(jià)值。關(guān)鍵詞絞股藍(lán)皂甙細(xì)胞毒細(xì)胞周期中分類(lèi)號(hào)R739.91 The Suppressive Effect of Gypenosides and Pinyangmycin on Neck Lymph Node Metastatic Cell Line Derived from Human OralSquamous Cell Carcinoma in Vitro.Yan Junfeng, Li Jinrong, Hu Zhuanzheng.College Stomatology,

3、Hubei Medical University,430079Abstract Objective： To investigate the suppressive effect and effective mechanism of gypenosides (GP) and PYM on neck lymph node metatatic GNM cell line derived from human oral squamous cell carcinoma in vitro. Methods：MTT assays and flow cytometry were used. Results：T

4、here was a synergetic effect when GP was combined with PYM. a decrease in number of cells was noticed in "S" stage when GP was used. Conclusions：There was a suppressive effect when GP and PYM were used on GNM cell, a synergetic effect was realized by different cycle stage of two drugs. The

5、 present study provided evidence for using drugs clinically.Key wordsgypenosidescytotoxic effectcycle化療是預(yù)防和治療惡性腫瘤局部復(fù)發(fā)無(wú)法手術(shù)或放療不敏感或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移病例的主要手段。但是化療藥物在抑制或殺傷癌細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)機(jī)體的正常細(xì)胞尤其是造血細(xì)胞及免疫活性細(xì)胞亦有不同程度的損傷。如何降低藥物毒性一直是學(xué)者們關(guān)注的重點(diǎn)。有研究表明,部分中草藥對(duì)某些腫瘤細(xì)胞具有抑制或殺滅作用,而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)影響,且能協(xié)同手術(shù)、放療或化療起到提高和鞏固療效的作用。絞股藍(lán)系葫蘆科絞股藍(lán)屬植物，主要有效成分為絞股藍(lán)皂

6、甙(gypenosides, GP)。實(shí)驗(yàn)證明，GP可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖1。為了更進(jìn)一步了解其和化療藥物聯(lián)用的效果及作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)采用MTT法及流式細(xì)胞儀對(duì)其抑制口腔轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的作用進(jìn)行了相關(guān)研究。材料與方法1. 細(xì)胞人口腔鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌GNM細(xì)胞株,由湖醫(yī)口腔醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室建立2。2. 藥物 GP, 含量大于90%,陜西省安康中藥廠產(chǎn)品。平陽(yáng)霉素(PYM),天津市河北制藥廠產(chǎn)品,8mg/支。藥物使用時(shí)用培養(yǎng)液稀釋成各種不同濃度。3. MTT法測(cè)定3取指數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)于RPMI-1640(含10%小牛血清)培養(yǎng)液中的GNM細(xì)胞,制成單細(xì)胞懸液,用0.5%臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)活細(xì)胞率。用血球計(jì)數(shù)

7、板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為105/ml。然后將細(xì)胞懸液加入96孔培養(yǎng)板,每孔100l。將培養(yǎng)板置于37、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后,各加入100l五種不同濃度的GP、PYM和GPPYM的混合劑。每組每一濃度重復(fù)4孔。設(shè)不含藥物的對(duì)照組,培養(yǎng)72h后,每孔加入20l 0.5%MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)4h。然后,吸除孔內(nèi)液體,每孔加入150l二甲基亞砜,振蕩5d后,用全自動(dòng)酶標(biāo)儀(516型,波長(zhǎng)為540nm)測(cè)定每孔光吸收值(OD),以下式計(jì)算出藥物對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(IR%)。4. GP對(duì)GNM細(xì)胞增殖周期的檢測(cè)取指數(shù)生長(zhǎng)期的GNM細(xì)胞制成濃度為105/ml的單細(xì)胞懸液,接種于25ml培養(yǎng)瓶中,

8、每瓶含培養(yǎng)液5ml,設(shè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。24h后實(shí)驗(yàn)組加GP終濃度為200g/ml。培養(yǎng)72h后用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液,收集于離心管中。8001000r/min離心5d,用PBS洗滌、離心2次后，用70%冷乙醇固定。上機(jī)前用PBS進(jìn)行離心沉淀去除固定液。采用溴化乙啶一步插入法，DNA定量熒光染色(染液含EB10g/ml,RNA酶10g/ml,1%Rritonx-100), 04染色30d后,用FACS-420型流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè),擬合出細(xì)胞周期各時(shí)相比例。結(jié)果1. GP對(duì)GNM細(xì)胞生長(zhǎng)的影響從表1看出,不同濃度的GP對(duì)GNM細(xì)胞生長(zhǎng)均有抑制作用,抑制作用隨濃度的增加而增加,呈濃度

9、依賴關(guān)系。2.2 PYM對(duì)GNM細(xì)胞生長(zhǎng)的影響表1不同濃度GP對(duì)GNM細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(IR%)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組(g/ml)2550100200600OD0.5300.3350.2660.2240.2050.166IR36.849.857.861.368.7從表2看出,PYM對(duì)GNM細(xì)胞的抑制作用亦呈劑量相關(guān)關(guān)系。表2不同濃度PYM對(duì)GNM細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(IR%)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組(g/ml)0.050.10.20.40.6OD0.5300.3450.3260.2340.2010.122IR18.538.555.862.177.03. GP與PYM聯(lián)用對(duì)GNM細(xì)胞生長(zhǎng)的影響從表3看出，GP與PYM合用

10、后,其抑制率較單用GP或PYM提高,但聯(lián)合用藥時(shí)劑量較各自單獨(dú)用藥量減少。表3GP與PYM聯(lián)用對(duì)GNM細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率(IR%)對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組(g/ml)OD0.5300.2790.2470.2030.1440.072IR47.453.461.672.886.4注: 劑量分別為各取GP和PYM單用時(shí)劑量的1/2。4. GP對(duì)GNM細(xì)胞增殖周期的影響由表4看出,GP作用于GNM細(xì)胞后,實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組S期細(xì)胞比例下降,細(xì)胞被阻滯在G0/G1期,細(xì)胞增殖被抑制。表4GP對(duì)GNM細(xì)胞增殖的影響組別細(xì)胞周期分布(%)G0/G1SG2/M對(duì)照組52.9542.604.45GP組60.3732.25*7.38

11、* 與對(duì)照組比較卡方檢驗(yàn)P0.01。討論用中西醫(yī)結(jié)合治療和預(yù)防惡性腫瘤在我國(guó)已有幾十年的歷史，并取得了顯著成績(jī)。對(duì)抗癌中草藥的研究已從宏觀向微觀發(fā)展，從機(jī)體整體水平向細(xì)胞水平、分子水平不斷深入。絞股藍(lán)，又名七葉膽，具有益氣健脾、清熱解毒的功能。研究證實(shí)，其抗腫瘤的主要有效成份是GP。劉華等4發(fā)現(xiàn)GP的抑瘤作用因細(xì)胞株來(lái)源不同而有明顯差異。作者的研究也證實(shí)，GP可抑制GNM細(xì)胞的增殖,并引起癌細(xì)胞的線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)破壞5。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GP作用于GNM細(xì)胞后,細(xì)胞周期中S期細(xì)胞減少,細(xì)胞被阻滯在G0/G1期。S期為DNA合成期,代表細(xì)胞增殖活力。因此，S期細(xì)胞減少,提示細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞增

12、殖受到抑制。已證實(shí)人參皂甙RH2有抑制黑色素瘤B16生長(zhǎng)的作用,并發(fā)現(xiàn)是通過(guò)阻滯細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期來(lái)達(dá)到的6,這說(shuō)明和人參皂甙結(jié)構(gòu)相同的GP與人參皂甙的抑瘤機(jī)制可能類(lèi)同。本研究結(jié)果顯示了GP與PYM聯(lián)用后抑癌作用增強(qiáng)。平陽(yáng)霉素是口腔頜面部鱗癌治療中的首選藥物，也是預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移癌的常選藥物之一。其作用機(jī)理為平陽(yáng)霉素分子與細(xì)胞DNA分子嵌合后使其斷裂,從而干擾遺傳物質(zhì)的合成與復(fù)制。其作用主要在G1期、G2M期7。GP與PYM聯(lián)用抑癌作用增強(qiáng)的機(jī)制可能就在于二者作用于細(xì)胞的環(huán)節(jié)不同而發(fā)揮"互補(bǔ)"作用的結(jié)果。因此提示在臨床用藥時(shí)可根據(jù)GP與PYM各時(shí)相時(shí)間分開(kāi)應(yīng)用,讓其在各自作

13、用的環(huán)節(jié)發(fā)揮作用。本研究利用鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞株篩選抗轉(zhuǎn)移癌藥物，為臨床用藥提供了理論依據(jù)。臨床已證實(shí)以絞股藍(lán)為主的中藥方劑可預(yù)防惡性腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，經(jīng)檢測(cè)患者NK細(xì)胞活性及免疫功能增強(qiáng),并可提高腫瘤患者淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化力,而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)顯著影響1,說(shuō)明GP是一個(gè)有希望預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移癌的天然抗癌藥,有臨床應(yīng)用價(jià)值。作者單位：武漢市(430079)湖北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院(閻軍峰現(xiàn)在武警湖北總隊(duì)醫(yī)院)參考文獻(xiàn)1閻軍峰,李金榮. 絞股藍(lán)抗腫瘤作用的研究進(jìn)展.中醫(yī)藥研究, 1998,14(3):602金輝喜. 人口腔鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞系和人舌鱗癌細(xì)胞系的建立及其生物學(xué)特性分析. 湖北醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文,19973吳軍正,司徒鎮(zhèn)強(qiáng),劉斌，等. MTT試驗(yàn)及其在抗癌中藥篩選中的應(yīng)用.中華口腔醫(yī)學(xué)雜志. 1992,27(6):3734劉華,司履生. 絞股藍(lán)總皂甙對(duì)體外培養(yǎng)肺癌細(xì)胞的抑制作用.西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào). 1994,15(4):3465閻軍峰,李金榮,胡傳真，等. 絞股藍(lán)總皂甙對(duì)體外培養(yǎng)人口腔鱗癌頸淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞抑制作用的研究.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志.1998,14(3): 14