醫(yī)學(xué)博士科研計(jì)劃書參考范本

1、醫(yī)學(xué)博士科研計(jì)劃書LncRNA-ANCR基因表達(dá)對大鼠退行性脊柱側(cè)凸影響的實(shí)驗(yàn)研究退行性脊柱側(cè)凸 (degenerative scoliosis,DS)通常指機(jī)體骨骼成熟后出現(xiàn)的脊柱腰段的側(cè)凸 ,冠狀面 Cobb?角大于 10 °,同時(shí)可以存在矢狀面失衡與/或脊椎的旋轉(zhuǎn)異常。隨著全球人口老齡化及老年人生活方式轉(zhuǎn)變,DS 已成為導(dǎo)致脊柱畸形、影響生活質(zhì)量的一種腰椎退行性疾病。由于DS 的具體病因還未明確解釋,當(dāng)前關(guān)于DS 的研究絕大多數(shù)就是針對治療,涉及病因?qū)W方面的基礎(chǔ)研究很少。 因此 ,進(jìn)一步研究 DS 的病因及發(fā)病機(jī)制具有非常重要的意義。長鏈非編碼 RNA(Long non-cod

2、ing RNA,LncRNA) 就是長度大于 200 個(gè)核苷酸的非編碼 RNA 。研究表明 ,LncRNA 在調(diào)控表觀遺傳、細(xì)胞周期與細(xì)胞分化等細(xì)胞分化與個(gè)體發(fā)育的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用,并與人類疾病的發(fā)生密切相關(guān),其中包括癌癥、退行性疾病在內(nèi)的多種嚴(yán)重危害人類健康的重大疾病,成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。其中 ,ANCR(anti-differentiation ncRNA, 抗分化 ncRNA) 為一個(gè) 855 bplncRNA, 在細(xì)胞分化期間下調(diào)。 ANCR 在包含祖細(xì)胞群體中的減少,沒有任何其她刺激 ,導(dǎo)致快速分化基因誘導(dǎo)。本研究正就是選擇LncRNA-ANCR 這一基因 ,旨在通過研究該基因與

3、大鼠DS 之間作用關(guān)系 ,為進(jìn)一步從分子生物學(xué)水平研究DS 的發(fā)病機(jī)理 ,希望從發(fā)病的初始關(guān)鍵環(huán)節(jié)上預(yù)防該類型疾病發(fā)生。參考文獻(xiàn)(1)Dalle-Carbonare L,Innamorati G,Valanti MT.Transcription factor Runx2 and itsapplication to bone tissue engineeringJ.Stem Cell Rev,2012,8(3):891897、(2)Liu TM,IR EH Tran.scriptional regulatory cascades in Runx2 dependent bonedevelopmen

4、tJ.Tissue Eng Part B Rev,2013,19(3):254263、(3)Lin Zhu,Pei-Cheng Xu,Downregulated LncRNA-ANCR promotes osteoblast differentiation by targeting EZH2 and regulating Runx2 expressionJ,Biochemicaland Biophysical Research Communications 432 (2013) 612617、(4)Glass DA、 Canonical Wnt signaling in differentia

5、ted osteoblasts controlsosteoclast differentiationJ.Dev Cell,2010,104(9):1670216707、(5)劉錫梅 ,馬越鳴 ,丁伯平等 ,大鼠兩種骨質(zhì)疏松模型的建立J、皖南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào) ,2001,20(1):4-5、(6)劉曉陽 ,邱貴興 ,翁習(xí)生等 ,長鏈非編碼 RNA 在青少年特發(fā)性脊柱側(cè)凸中的表達(dá)研究 J、中國骨與關(guān)節(jié)外科 ,2014,3(7):235-240、(7)Daffner SD,Vaccaro AR、 Adult degene rative lumbarscoliosis、 Am J Orthop,2003,3

6、2(2):77-82、(8)Kretz M , Webster DE , Flockhart RJ?etc, Suppression of progenitor differentiation requires the long noncoding RNA ANCRJ, Genes Dev、2012,26 (4) :338343、(9)李慧章 ,葉君健。骨形態(tài)發(fā)生蛋白在椎間盤退變中的研究J 、 福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) ,2005,39(1):53-55、(10)Cui M;Wan Y;Anderson DG、 Mouse growth and differentiation factor-5 pro

7、tein and DNA therapy potentiates intervertebral disc cell aggregation and chondrogenic gene expressionJ、 Spine Journal,2008,8(2):287-295、創(chuàng)新點(diǎn) :LncRNA 就是當(dāng)前的研究熱點(diǎn) ,在癌癥方面研究相對較多,本研究借此熱點(diǎn)探討LncRNA-ANCR 在大鼠 DS 發(fā)生發(fā)展過程中的作用。若探明 LncRNA-ANCR 與 DS 之間的作用關(guān)系 ,從而人為地調(diào)控LncRNA-ANCR的作用機(jī)制 ,從早期防治 DS,為防治 DS 開辟一個(gè)新思路。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與技術(shù)路線

8、:1.重組 LncRNA-ANCR 腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定 (1)根據(jù) LncRNA-ANCR 前體序列應(yīng)用 Primer premier 5 軟件設(shè)計(jì)引物。(2)利用 PCR 技術(shù)擴(kuò)增出 LncRNA-ANCR 前體的 DNA 序列。(3)LncRNA-ANCR 前體的 DNA 序列重組入腺病毒miRNA 表達(dá)載體。(4)應(yīng)用 Lipofeetamine 2000將重組 LncRNA-ANCR 腺病毒表達(dá)載體與輔助包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染如 293T 細(xì)胞進(jìn)行病毒包裝。(5)收集、濃縮、純化與滴定重組LncRNA-ANCR 腺病毒。2、 重組 LncRNA-ANCR 腺病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大鼠BMSC

9、s 的細(xì)胞學(xué)研究(1)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)的分離、培養(yǎng)選取 2 月齡大鼠 ,無菌條件下獲取自體骨髓,用 Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液梯度離心法進(jìn)行分離、培養(yǎng) ,獲得自體原代骨髓干細(xì)胞,傳代培養(yǎng)。應(yīng)用 CD45、CD34、CD29、CD105 單克隆抗體 ,FACS(流式細(xì)胞儀 )檢測 BMSCs 表面抗原表達(dá)。細(xì)胞分組 :基因組 :LncRNA-ANCR 載體轉(zhuǎn)染的 BMSCs無關(guān)序列組 :無關(guān)序列載體轉(zhuǎn)染的BMSCs空載體組 :空載體的 BMSCs空白對照組 :無特殊處理的 BMSCs(3)檢測 BMSCs 分化指標(biāo)TaqMan RT-PCR與 Western-blot 方法分

10、別檢測各組BMSCs 內(nèi) BMP7 mRNA 、Runx2 mRNA 與 GDF5 mRNA 以及相應(yīng)蛋白表達(dá)3、 重組 LncRNA-ANCR 腺病毒表達(dá)載體對大鼠DS 的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 :剛斷乳的 SD 大鼠 50 只,分 5 組,每組 10 只。(2)實(shí)驗(yàn)分組 :空白對照組 :無特殊處理模型組 :僅雙上肢截肢空載體組 :雙上肢截肢 +注射空載體轉(zhuǎn)染的BMSCs無關(guān)序列組 :雙上肢截肢 +注射無關(guān)序列載體轉(zhuǎn)染的BMSCs基因組 :雙上肢截肢 +注射 LncRNA-ANCR 載體轉(zhuǎn)染的 BMSCs(3)影像學(xué)觀察測量大鼠脊柱形態(tài)變化(4)病理學(xué) :觀察椎體與椎間盤病理變化(5)基

11、因表達(dá) :TaqMan RT-PCR檢測 BMP7 mRNA 、 Runx2 mRNA 與 GDF5 mRNA表達(dá)(6)蛋白表達(dá) :Westernblot 檢測 BMP7、 Runx2 與 GDF5 蛋白表達(dá)預(yù)期目標(biāo)與意義 :成功構(gòu)建與鑒定重組LncRNA-ANCR 腺病毒載體。將重組 LncRNA-ANCR 腺病毒載體轉(zhuǎn)染到BMSCs 細(xì)胞中 ,阻斷或顯著抑制BMSCs 分化 ,最終導(dǎo)致大鼠發(fā)生DS。本研究如達(dá)到預(yù)期結(jié)果 ,可在國際核心學(xué)術(shù)期刊發(fā)表1-2 篇論文。課題研究的階段性安排 :(1)2016.01-2016.05 完成載體的構(gòu)建。(2)2016.06-2016.12 完成細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)

12、及動(dòng)物學(xué)實(shí)驗(yàn)。(3)2017.01-2017.06 整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) ,寫出論文總結(jié) ,發(fā)表相關(guān)文章衛(wèi)生管理制度1總則1.1為了加強(qiáng)公司的環(huán)境衛(wèi)生管理，創(chuàng)造一個(gè)整潔、文明、溫馨的購物、辦公環(huán)境，根據(jù)公共場所衛(wèi)生管理?xiàng)l例的要求，特制定本制度。1.2集團(tuán)公司的衛(wèi)生管理部門設(shè)在企管部，并負(fù)責(zé)將集團(tuán)公司的衛(wèi)生區(qū)域詳細(xì)劃分到各部室，各分公司所轄區(qū)域衛(wèi)生由分公司客服部負(fù)責(zé)劃分，確保無遺漏。2衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)2.1室內(nèi)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)2.1.1地面、墻面：無灰塵、無紙屑、無痰跡、無泡泡糖等粘合物、無積水，墻角無灰吊、無蜘蛛網(wǎng)。2.1.2門、窗、玻璃、鏡子、柱子、電梯、樓梯、燈具等，做到明亮、無灰塵、無污跡、無粘合物，特別是玻璃

13、，要求兩面明亮。2.1.3柜臺、貨架：清潔干凈，貨架、柜臺底層及周圍無亂堆亂放現(xiàn)象、無灰塵、無粘合物，貨架頂部、背部和底部干凈，不存放雜物和私人物品。2.1.4購物車（筐）、直接接觸食品的售貨工具（包括刀、叉等） ：做到內(nèi)外潔凈，無污垢和粘合物等。購物車（筐）要求每天營業(yè)前簡單清理，周五全面清理消毒；售貨工具要求每天消毒，并做好記錄。2.1.5商品及包裝：商品及外包裝清潔無灰塵（外包裝破損的或破舊的不得陳列）。2.1.6收款臺、服務(wù)臺、辦公櫥、存包柜：保持清潔、無灰塵，臺面和側(cè)面無灰塵、無灰吊和蜘蛛網(wǎng)。桌面上不得亂貼、亂畫、亂堆放物品，用具擺放有序且干凈，除當(dāng)班的購物小票收款聯(lián)外，其它單據(jù)不得

14、存放在桌面上。2.1.7垃圾桶：桶內(nèi)外干凈，要求營業(yè)時(shí)間隨時(shí)清理，不得溢出，每天下班前徹底清理，不得留有垃圾過夜。2.1.8窗簾：定期進(jìn)行清理，要求干凈、無污漬。2.1.9吊飾：屋頂?shù)牡躏椧鬅o灰塵、無蜘蛛網(wǎng)，短期內(nèi)不適用的吊飾及時(shí)清理徹底。 2.1.10內(nèi)、外倉庫：半年徹底清理一次，無垃圾、無積塵、無蜘蛛網(wǎng)等。2.1.11室內(nèi)其他附屬物及工作用具均以整潔為準(zhǔn)，要求無灰塵、無粘合物等污垢。2.2室外衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)2.2.1門前衛(wèi)生：地面每天班前清理，平時(shí)每一小時(shí)清理一次，每周四營業(yè)結(jié)束后有條件的用水沖洗地面（冬季可根據(jù)情況適當(dāng)清理） ，墻面干凈且無亂貼亂畫。2.2.2院落衛(wèi)生：院內(nèi)地面衛(wèi)生全天保潔，果皮箱、消防器械、護(hù)欄及配電箱等設(shè)施每周清理干凈。垃圾池周邊衛(wèi)生清理徹底，不得有垃圾溢出。2.2.3綠化區(qū)衛(wèi)生：做到無雜物、無紙屑、無塑料袋等垃圾。3清理程序3.1室內(nèi)和門前院落等區(qū)域衛(wèi)生： 每天營業(yè)前提前 10 分鐘把所管轄區(qū)域內(nèi)衛(wèi)生清理完畢，營業(yè)期間隨時(shí)保潔。下班后 5-10 分鐘清理桌面及衛(wèi)生區(qū)域。3.2綠化區(qū)衛(wèi)生：每周徹底清理一遍，隨時(shí)保持清潔無垃圾。4管理考核4